ÔN TẬP PHÂN TÍCH PROTEIN

1. Cho biết mục đích của việc thêm dung dịch ammoniac vào sữa

trong phương pháp Mojonnier.

Mục đích thêm dung dịch NH3: kết tủa và loại protein ra khỏi hạt cầu
béo.

2. Kể tên các phương pháp định lượng protein dùng để ghi nhãn thực

phẩm.
Phương pháp Kjeldalh, Dumas
3. Phương pháp đo độ hấp thụ tia hồng ngoại có được dùng trong

định lượng protein để ghi nhãn thực phẩm hay không? Tại sao?
Không
4. Trong phương pháp Kjeldahl, một loại thực phẩm có hệ số chuyển

đổi (từ lượng N thành lượng protein) bằng 5,90. Như vậy tỉ lệ N trong
protein của loại thực phẩm này bằng bao nhiêu %?
%N = 100/5.9 = 16.95%
5.Liệt kê ít nhất 8 loại hợp chất chứa N phi protein có trong thực
phẩm.
 Axit amin tự do
 Các sản phẩm phân giải protein như urê, axit uric, purin, pirimidin,
nitrat, nitrit,… 
 Các hoạt chất sinh chứa N như một số vitamin và hocmon.

6. Việc cho thêm (NH ) SO có làm tăng chỉ số hàm lượng protein khi
4 2 4

định lượng bằng phương pháp Kjeldahl hay không? Tại sao? 
Có vì NH4 trong quá trình sục NaOH vào nó vẫn sinh ra NH , sẽ 3

kết hợp với nitơ protein thành ra làm tăng hàm lượng protein
7. Việc cho thêm KNO có làm tăng chỉ số hàm lượng protein khi định
3

lượng bằng phương pháp Kjeldahl hay không? Tại sao?

 Nitrat nitrit ko bị vô cơ hóa cũng như là pư với NaOH để giải
phóng NH nên ko làm thay đổi hàm lượng protein
3

8. Liệt kê ít nhất 5 tác nhân có thể gây biến tính protein.

Tác nhân vật lý:

+ Sóng siêu âm
+ Tia cực tím
+ Khuấy cơ học
Tác nhân hóa học:
+ Axit mạnh
+ Kiềm mạnh
+ Muối kim loại nặng
9. Liệt kê các bước và viết các phương trình phản ứng xảy ra trong

từng bước trong phương pháp Kjeldahl.

 Phân hủy chất hữu cơ

 Chưng cất
 Chuẩn độ
 Tính toán
10. Cho biết ưu điểm khi dùng H3BO3 dư so với khi dùng  H2SO4 dư

để hấp thụ NH3 trong phương pháp Kjeldahl

11. Trình bày ngắn gọn nguyên lý của phương pháp Kjeldahl định

lượng protein.
Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng
kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4
hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng H2SO4 0,1N.
12. Cho biết các ưu và nhược điểm của phương pháp Kjeldahl.

Ưu điểm:
Dùng cho mọi loại tp
Rẻ
Độ đúng cao, đo thành phần protein thô
Có thể đo được µg protein
Nhược điểm:
Đo nito hữu cơ tổng, không đo nitơ protein
Tốn thời gian (ít nhất 2h để hoàn thành)
DÙng chất ăn mòn
Ít chính xác hơn biuret
13. Hãy trình bày ngắn gọn một biện pháp cải tiến phương pháp

Kjeldahl truyền thống và cho biết ưu điểm của biện pháp này.
14. Trình bày ngắn gọn nguyên lý hoạt động của phương pháp Dumas

định lượng protein.

 Phương pháp Dumas xác định nitrogen ở tất cả các dạng liên kết, cả
hữu cơ và vô cơ, bao gồm cả nitrite và nitrate.
 Mẫu được đốt cháy ở nhiệt độ cao, khoảng 900 độ C tạo thành các
oxide, các hợp chất bị đốt cháy bao gồm cả gốc muối nitrate và nitrite
để tạo thành N-oxides hoặc N . 
2

 Với sự có mặt của Cu (đồng), các oxit nitrogen sẽ được khử thành
nitrogen. 
 Trong khi đó, CO  , H O và một vài oxide khác được tách ra và loại bỏ
2 2

hoàn toàn bằng các bẫy hấp thụ và hấp phụ. Khí nitrogen sinh ra được
đo bằng đầu dò dẫn nhiệt
 Hàm lượng nitơ được tính toán bằng bộ vi xử lý.
15. Đầu dò (detector) phát hiện các khí trong phương pháp Dumas

dựa trên tính chất nào của các khí đó?

Nguyên tắc hoạt động của các detector là dựa vào tính chất vật lí của các
cấu tử như: tính chất hấp thụ và phát xạ ánh sáng, tính phân cực, tính
khúc xạ,tính dẫn điện, dẫn nhiệt, khối lượng riêng…
16. Trình bày các ưu và nhược điểm của phương pháp Dumas.

Ưu điểm
 Không dùng hóa chất nguy hiểm
 Nhanh, chỉ 3 - 4 phút
 Những thiết bị tự động gần đây có thể đo được 150 mẫu một lúc mà
không cần chú ý
Nhược điểm
 Máy đắc tiền
 Đo tổng nito cháy đc , không đo nitow protein
17. Trình bày ngắn gọn nguyên lý định lượng protein bằng phương
pháp quang phổ hồng ngoại
Nguyên tắc của phương pháp này là các acid amin thơm như
tryptophan, tyrosine và phenylalanine trong chuỗi polypeptide có
phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 280nm.

18. Cho biết ưu và nhược điểm của phương pháp định lượng protein

bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại.

Ưu điểm
 Nhanh chóng và tương đối nhạy cảm. Ở 280nm, cần 100µg hoặc hơn,
nhạy cảm hơn vài lần phương pháp biuret
 Không có sự tham gia nào từ amoni sulfat và các muối đệm khác
 Không phá hủy mẫu, mẫu có thể được sử dụng cho các phân tích khác
sau khi xác định protein. Được sử dụng rất rộng rãi trong các phương
pháp sắc kí cột
Nhược điểm
 Các nucleic cũng hấp thụ ở bước sóng 280nm. Tỷ lệ hấp thụ 280 nm /
260nm đối với protein thô và axit nucleic là 1,75 và 0,5. Người ta có
thể điều chỉnh sự hấp thụ axit nucleic ở 280nm nếu tỷ lệ hấp thụ 280
nm / 260nm được biết đến. Các axit nucleic cũng có thể được điều
 chỉnh bằng cách sử dụng một phương pháp dựa trên sự khác biệt hấp
thụ giữa 235 và 280nm
 Hàm lượng đáng kể các dẫn xuất amino axit trong các protein từ
nhiều nguồn thực phẩm khác nhau.
 Dung môi phải trong suốt và không màu. Độ đục do các hạt trong
dung dịch sẽ làm tăng độ hấp thụ sai.
 Sự trong suốt là cần thiết để sử dụng phương pháp này.
19. Những loại hợp chất có đặc tính gì thì có thể tạo màu với thuốc

thử trong phương pháp biuret? Liệt kê 

20. Cho biết các chất có trong thuốc thử biuret và cho biết vai trò của
mỗi chất đó.
 NaOH, natri kali tartrate, CuSO4 trong thuốc thử
 NaOH +CuSO4: dung dịch chuyển sang màu tím thì chứng minh
được sự có mặt của protein (với nồng độ có thể xác định được là
khoảng 5-160mg/l)
 Natri kali tartrate: hi thử, nếu có mặt Protein, thuốc thử chuyển từ
màu xanh sang tím. Nếu thuốc thử chuyển từ màu xanh sang màu
hồng thì trong dung dịch có sự hiện diện của các chuỗi ngắn
polypeptide
21. Trình bày nguyên lý của phương pháp biuret định lượng protein.

Các aminoacid có phản ứng được với thuốc thử biuret hay không?
 Hàm lượng biuret được xác định bởi cường độ màu tím đỏ đặc trưng
do phản ứng tạo phức giữa biuret và đồng sunphat trong dung dịch
bazơ kali-natri tatrat, không có CO và amoni. Đo màu của phức chất
2

tạo thành ở bước sóng 550 nm.

 Nếu trong phần dung dịch lấy để thử có một lượng muối amoni tính
chuyển ra NH lớn hơn 15 mg, phải tiến hành loại nó trước khi xác
3

định.
 Một màu tím được phát ra khi ion Cu kết hợp với mạch peptide (ít
2+

nhất là 2 mạch peptide, biuret, mạch peptide lớn, và tất cả protein)

dưới điều kiện là alkan
 Sự hấp thụ màu được đọc ở 540nm. Sự hấp thụ màu tỉ lệ với thành
phần protein trong mẫu
 Trình bày 3 ưu điểm và 3 nhược điểm của phương pháp biuret.

 Ưu điểm
 Rẻ hơn Kjeldahl, nhanh (<30 phút), đơn giản
 Sai lệch màu sắc ít gặp hơn so với lowry, Hấp thụ tia UV, hoặc
phương pháp khí lạnh
 Rất ít chất trong thực phẩm gây cản trở cho biuret
 Không phát hiện ra ni tơ từ nguồn nonpeptide hoặc không phải
protein
 Không dùng acid đậm đặc
 Ít bị ảnh hưởng bởi pro
 Nhược điểm
 Không nhạy, từ 2-4mg pro mới phát hiện đc
 Hấp thụ có thể được đóng góp từ sắc tố nếu có
 Nồng độ cao của muối ammonium can thiệp vào phản ứng
 Nito pro sẽ không phản ứng đc với thuốc thử biuret
 Cần lượng tương đối lớn, lượng pro phải đủ lớn
 Ngưỡng phát hiện nhỏ nhất
 Dung dịch bị đục thì đo không chính xác
 Là phương pháp gián tiếp phải 
 23 . Trình bày nguyên lý của phương pháp Lowry. 
 Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret với việc giảm thuốc thử

folol-Ciocalteau phenol (phosphomolybdic-phosphotungstic acid) và

dư lượng tryptophan trong protein .Màu xanh sinh ra được đọc ở mức
 750nm (độ nhạy cao đối với nồng độ protein thấp) hoặc 500nm (độ
nhạy thấp đối với nồng độ protein cao.
24.Những aminoacid nào trong mạch protein đóng vai trò quan trọng

trong phản ứng với thuốc thử trong phương pháp Lowry.

Acid amin thơm (tyrosine, tryptophan,histidine)

25. Để dựng đường chuẩn trong các phương pháp định lượng protein

thì người ta thường dùng chất chuẩn nào? Tại sao?

26. Trình bày 3 ưu điểm và 3 nhược điểm của phương pháp Lowry.

Ưu điểm
 Rất nhạy
50-100 lần so với phương pháp biuret
10-20 lần so với phương pháp hấp thụ 280nm UV
Độ nhạy tương đương Nesslerization nhưng tiện hơn
 Ít bị ảnh hưởng bởi độ đục của mẫu
 Đặc hiệu hơn hầu hết các phương pháp khác
 Tương đối đơn giản, có thể hoàn thành xong trong 1-1,5h
Nhược điểm
 Màu sắc khác nhau đối với những loại protein khác nhau, đa dạng
màu hơn biuret
 Màu sắc không tỉ lệ thuận với nồng độ protein
 Phản ứng bị can thiệp với các mức độ khác nhau bởi sucrose, lipid,
đệm phosphate, monosaccharides, và hexoamines.
 Nồng độ cao các chất như đường khử, amoni sulfat và hợp chất
sulfhydryl làm ảnh hưởng đến phản ứng.
27. Trình bày nguyên lý của phương pháp BCA (bicinchoninic acid).

 Tương tự ng như Lowry vì cũng có quá trình khử Cu2+ thành Cu+
 Sự khác nhau của phương pháp này với phương pháp Lowry đó là
Cu+ sau khi tạo thành sẽ tham gia phản ứng tạo màu với BCA. Cả hai
phương pháp này đều có cùng độ nhạy với hàm lượng protein nhưng
BCA thuận lợi hơn tất cả các hóa chất tham gia vào phản ứng đều cho
vào ống nghiệm ngay từ đầu, còn lowry phải cho thuốc thử Folin vào
sau khi mẫu protein đã phản ứng với CuSO4.

 Trong phương pháp BCA cường độ màu sau phản ứng không bị ảnh
hưởng bởi các tác nhân gây cản trở như các chất tẩy, các chất làm
biến tính như urea và guanidinium chloride. Kết quả của phản ứng đó
là sự tạo thành màu tím của dung dịch, cường độ màu phụ thuộc vào
hàm lượng protein. Phức hợp màu này sẽ hấp thụ mạnh ánh sáng ở
bước sóng 562nm, đo mật độ quang (OD) của dung dịch này và dựa
vào phương trình đường chuẩn, xác định lượng protein có trong mẫu.
28. Trình bày nguyên lý của phương pháp BCA (bicinchoninic acid).

- Các protein khử ion cupric thành ion cuprous dưới điều kiện kiềm; ion
cuprous phản ứng với thuốc thử BCA để cho màu tím (hấp thụ ở 562
nm).
- Dựa trên cấu trúc phân tử của protein, các liên kết peptide làm cho
protein tách ra vì sự có mặt của Cys, Trp và Tyr.
- Được sử dụng để định lượng protein trong các dung dịch tinh khiết.

29. Trình bày nguyên lý của phương pháp liên kết thuốc nhuộm (dye-

binding method) trong định lượng protein.

Khi phản  ứng, trong điều kiện cụ thể, với thuốc nhuộm có chứa nhóm
sulfunic acid (– SO H ), các nhóm chức năng đặt biệt là các nhóm cơ bản
3

trong các chuỗi bên của arginine, lysine, histidine tạo màu trong dung
dịch thuốc nhuộm, cường  độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong thực
phẩm. Thuốc nhuộm hữu cơ liên kết với protein bằng các liên kết ion,
tĩnh điện, hoặc cả van der Waals. Phản ứng này tối ưu trong môi trường
acid mạnh, tạo ra các phức tan hoặc không tan. Vì vậy nồng độ protein có
thể dễ dàng xác định thông qua đo cường độ màu của dung dịch thuốc
nhuộm trước và sau khi thêm protein, hoặc sau khi tách riêng phức hợp
protein-thuốc nhuộm không tan bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm.

30.Trong phương pháp trắc quang UV định lượng protein, người ta

đo ở vùng bước sóng nào? Những amino acid có đặc điểm gì sẽ hấp
thụ ánh sáng ở vùng bước sóng này?
 Để hạn chế sự hấp thụ của các acid nucleic, cần pha loãng mẫu đến
nồng độ thích hợp để xác định mật độ quang tại 260nm và 280nm.

 Amino acid thơm, đặc biệt là tyrosine và tryptophan sẽ hấp thụ ánh

sáng ở vùng bước sóng này, dung dịch sử dụng phải nguyên chất.