Fertilization, Cortical Rotation, and Cleavage Most frogs have external fertilization, with the male

fertilizing the eggs as the female is laying them. Even before fertilization, the frog egg has polarity, in
that the dense yolk is at the vegetal (bottom) end, whereas the animal part of the egg (the upper half)
has very little yolk. As we will also see, certain proteins and mRNAs are already localized in specific
regions of the unfertilized egg. Fertilization can occur anywhere in the animal hemisphere of the
amphibian egg. The point of sperm entry is important because it determines dorsal-ventral polarity. The
point of sperm entry marks the ventral (belly) side of the embryo, while the site 180º opposite the point
of sperm entry will mark the dorsal (spinal) side. The sperm centriole, which enters the egg with the
sperm nucleus, organizes the microtubules of the egg into parallel tracks in the vegetal cytoplasm,
separating the outer cortical cytoplasm from the yolky internal cytoplasm (Figure 11.2A,B). These
microtubular tracks allow the cortical cytoplasm to rotate with respect to the inner cytoplasm. Indeed,
these parallel arrays are first seen immediately before rotation starts, and they disappear when rotation
ceases (Elinson and Rowning 1988; Houliston and Elinson 1991). In the zygote, the cortical cytoplasm
rotates about 30º with respect to the internal cytoplasm (Figure 11.2C). In some cases, this exposes a
region of gray-colored inner cytoplasm directly opposite the sperm entry point (Figure 11.2D; Roux
1887; Ancel and Vintenberger 1948). This region, the gray crescent, is where gastrulation will begin.
Even in Xenopus eggs, which do not expose a gray crescent, cortical rotation occurs and cytoplasmic
movements can be seen (Manes and Elinson 1980; Vincent et al. 1986). Gastrulation begins at the part
of the egg opposite the point of sperm entry, and this region will become the dorsal portion of the
embryo. The microtubular arrays organized by the sperm centriole at fertilization plays a large role in
initiating these movements. Therefore, the dorsal-ventral axis of the larva can be traced back to the
point of sperm entry.

Unequal radial holoblastic cleavage

Cleavage in most frog and salamander embryos is radially symmetrical and holoblastic, like echinoderm
cleavage. The amphibian egg, however, is much larger than echinoderm eggs and contains much more
yolk. This yolk is concentrated in the vegetal hemisphere and is an impediment to cleavage. Thus, the
first division begins at the animal pole and slowly extends down into the vegetal region (Figure 11.3A). In
those species having a gray crescent (especially salamanders and frogs of the genus Rana), the first
cleavage usually bisects the gray crescent (see Figure 11.2D).

While the first cleavage furrow is still cleaving the yolky cytoplasm of the vegetal hemisphere, the
second cleavage has already started near the animal pole. This cleavage is at right angles to the first one
and is also meridional. The third cleavage is equatorial. However, because of the vegetally placed yolk,
the third cleavage furrow is not at the equator but is displaced toward the animal pole (Valles et al.
2002). It divides the amphibian embryo into four small animal blastomeres (micromeres) and four large
blastomeres (macromeres) in the vegetal region. Despite their unequal sizes, the blastomeres continue
to divide at the same rate until the twelfth cell cycle (with only a small delay of the vegetal cleavages).
As cleavage progresses, the animal region becomes packed with numerous small cells, while the vegetal
region contains a relatively small number of large, yolk-laden macromeres. An amphibian embryo
containing 16 to 64 cells is commonly called a morula (plural morulae; Latin, “mulberry,” whose shape it
vaguely resembles). At the 128-cell stage, the blastocoel becomes apparent, and the embryo is
considered a blastula (Figure 11.3B). Numerous cell adhesion molecules keep the cleaving blastomeres
together. One of the most important of these is EP-cadherin. The mRNA for this protein is supplied in
the oocyte cytoplasm. If this message is destroyed by antisense oligonucleotides so that no EP-cadherin
protein is made, the adhesion between blastomeres is dramatically reduced, resulting in the obliteration
of the blastocoel (Heasman et al. 1994a,b). Membrane adhesions may have a further role; it is probable
that the coordination of cell division is mediated through waves of membrane contractions (Chang and
Ferrell 2013). Although amphibian development differs from species to species (see Hurtado and De
Robertis 2007), in general the animal hemisphere cells will give rise to the ectoderm, the vegetal cells
will give rise to the endoderm, and the cells beneath the blastocoel cavity will become mesoderm
(Figure 11.3C). The cells opposite the point of sperm entry will become the neural ectoderm, the
notochord mesoderm, and the pharyngeal (head) endoderm (Keller 1975, 1976; Landstrom and Løvtrup
1979). The amphibian blastocoel serves two major functions. First, it can change its shape such that cell
migration can occur during gastrulation; and second, it prevents the cells beneath it from interacting
prematurely with the cells above it. When Nieuwkoop (1973) took embryonic newt cells from the roof of
the blastocoel in the animal hemisphere (a region often called the animal cap) and placed them next to
the yolky vegetal cells from the base of the blastocoel, the animal cap cells differentiated into
mesodermal tissue instead of ectoderm. Thus, the blastocoel prevents the premature contact of the
vegetal cells with the animal cap cells, and keeps the animal cap cells undifferentiated.

The mid-blastula transition: Preparing for gastrulation An important precondition for gastrulation is the
activation of the zygotic genome (that is, the genes within each nucleus of the embryo). In Xenopus
laevis, only a few genes appear to be transcribed during early cleavage. For the most part, nuclear genes
are not activated until late in the twelfth cell cycle (Newport and Kirschner 1982a,b; Yang et al. 2002). At
that time, the embryo experiences a mid-blastula transition, or MBT, as different genes begin to be
transcribed in different cells, the cell cycle acquires gap phases, and the blastomeres acquire the
capacity to become motile. It is thought that some factor in the egg is being absorbed by the newly
made chromatin because (as in Drosophila) the time of this transition can be changed experimentally by
altering the ratio of chromatin to cytoplasm in the cell (Newport and Kirschner 1982a,b). Some of the
events that trigger the mid-blastula transition involve chromatin modification. First, certain promoters
are demethylated, allowing transcription of these genes. During the late blastula stages, there is a loss of
methylation on the promoters of genes that are activated at MBT. This demethylation is not seen on
promoters that are not activated at MBT, nor is it observed in the coding regions of MBT-activated
genes. The methylation of lysine-4 on histone H3 (forming a trimethylated lysine associated with active
transcription) is also seen on the 5′ ends of many genes during MBT. It appears, then, that modification
of certain promoters and their associated nucleosomes may play a pivotal role in regulating the timing
of gene expression at the mid-blastula transition (Stancheva et al. 2002; Akkers et al. 2009; Hontelez et
al. 2015). It is thought that once the chromatin at the promoters has been remodeled, various
transcription factors (such as the VegT protein, formed in the vegetal cytoplasm from localized maternal
mRNA) bind to the promoters and initiate new transcription. For instance, the vegetal cells (under the
direction of the VegT protein) become the endoderm and begin secreting factors that induce the cells
above them to become the mesoderm (see Figure 11.10). Amphibian Gastrulation The study of
amphibian gastrulation is both one of the oldest and one of the newest areas of experimental
embryology (see Beetschen 2001; Braukmann and Gilbert 2005). Even though amphibian gastrulation
has been studied extensively since the 1870s, new live-imaging techniques have emerged that are giving
us a new appreciation of the intricacies of these cell movements (Papan et al. 2007; Moosmann et al.
2013). Moreover, most of our theories concerning the mechanisms of gastrulation and axis specification
have been revised over the past two decades. The study of these developmental movements has also
been complicated by the fact that there is no single way amphibians gastrulate; different species employ
different means to achieve the same goal. In recent years, the most intensive investigations have
focused on Xenopus laevis, so we will concentrate on the mechanisms of gastrulation in that species.

Vegetal rotation and the invagination of the bottle cells Amphibian blastulae are faced with the same
tasks as the invertebrate blastulae we followed in Chapters 8 through 10—namely, to bring inside the
embryo those areas destined to form the endodermal organs; to surround the embryo with cells capable
of forming the ectoderm; and to place the mesodermal cells in the proper positions between the
ectoderm and the endoderm. The cell movements of gastrulation that will accomplish this are initiated
on the future dorsal side of the embryo, just below the equator, in the region of the gray crescent (i.e.,
the region opposite the point of spermentry; see Figure 11.2C). Here the cells invaginate to form the
slitlike blastopore. These bottle cells change their shape dramatically. The main body of each cell is
displaced toward the inside of the embryo while maintaining contact with the outside surface by way of
a slender neck. As in sea urchins, the bottle cells will initiate the formation of the archenteron (primitive
gut).1 However, unlike sea urchins, gastrulation in the frog begins not in the most vegetal region but in
the marginal zone—the region surrounding the equator of the blastula, where the animal and vegetal
hemispheres meet (Figure 11.4A,B). Here the endodermal cells are not as large or as yolky as the most
vegetal blastomeres. But cell involution is not a passive event. At least 2 hours before the bottle cells
form, internal cell rearrangements propel the cells of the dorsal floor of the blastocoel toward the
animal cap. This vegetal rotation places the prospective pharyngeal endoderm cells adjacent to the
blastocoel and immediately above the involuting mesoderm (see Figure 11.5D). These cells then migrate
along the basal surface of the blastocoel roof, traveling toward the future anterior of the embryo (Figure
11.4C–E; Nieuwkoop and Florschütz 1950; Winklbauer and Schürfeld 1999; Ibrahim and Winklbauer
2001). The superficial layer of marginal cells is pulled inward to form the endodermal lining of the
archenteron, merely because it is attached to the actively migrating deep cells. Although experimentally
removing the bottle cells does not affect the involution of the deep or superficial marginal zone cells into
the embryo, removal of the deep involuting marginal zone (IMZ) cells stops archenteron formation.
involution at the blastopore lip After the bottle cells have brought the involuting marginal zone into
contact with the blastocoel wall, the IMZ cells involute into the embryo. As the migrating marginal cells
reach the lip of the blastopore, they turn inward and travel along the inner surface of the outer animal
hemisphere cells (i.e., the blastocoel roof; Figure 11.4D–F). The order of the march into the embryo is
determined by the vegetal rotation that abuts the prospective pharyngeal endoderm against the inside
of the animal cap tissue (Winklebauer and Damm 2011). Meanwhile, the animals cells undergo epiboly,
producing a stream of cells that converge at and become the dorsal blastopore lip. The first cells to
compose the dorsal blastopore lip and enter into the embryo are the cells of the prospective pharyngeal
endoderm of the foregut (Figure 11.5). These cells migrate anteriorly beneath the surface ectoderm of
the blastocoel.2 These anterior endoderm cells transcribe the hhex gene, which encodes a transcription
factor that is critical for forming the head and heart (Rankin et al. 2011). As these first cells pass into the
interior of the embryo, the dorsal blastopore lip becomes composed of cells that involute into the
embryo to become the prechordal plate, the precursor of the head mesoderm. Prechordal plate cells
transcribe the goosecoid gene, whose product is a transcription factor that activates numerous genes
controlling head formation. It achieves this activation indirectly, by repressing those genes (e.g., Wnt8)
that repress head development. This phenomenon—the activation of genes by repressing their
repressors—is a major feature of animal development, as we saw in the double-negative gate that
specifies sea urchin micromeres. Next to involute through the dorsal blastopore lip are the cells of the
chordamesoderm. These cells will form the notochord, the transient mesodermal rod that plays an
important role in inducing and patterning the nervous system. Chordamesoderm cells express the Xbra
(Brachyury) gene, whose product (as we saw in the previous chapter) is a transcription factor critical for
notochord formation. Thus, the cells constituting the dorsal blastopore lip are constantly changing as
the original cells migrate into the embryo and are replaced by cells migrating downward, inward, and
upward. As the new cells enter the embryo, the blastocoel is displaced to the side opposite the dorsal
lip. Meanwhile, the lip expands laterally and ventrally as bottle cell formation and involution continue
around the blastopore. The widening blastopore “crescent” develops lateral lips and, finally, a ventral lip
over which additional mesodermal and endodermal precursor cells pass (Figure 11.6). These cells
include the precursors of the heart and kidney. With the formation of the ventral lip, the blastopore has
formed a ring around the large endodermal cells that remain exposed on the vegetal surface.

This remaining patch of endoderm is called the yolk plug; it, too, is eventually internalized (at the site of
the anus). At that point, all the endodermal precursors have been brought into the interior of the
embryo, the ectoderm has encircled the surface, and the mesoderm has been brought between them.
The first cells into the blastopore become the most anterior.

convergent extension of the dorsal mesoderm Figure 11.7 depicts the behavior of the involuting
marginal zone cells at successive stages of Xenopus gastrulation (Keller and Schoenwolf 1977; Hardin
and Keller 1988). The IMZ is originally several layers thick. Shortly before their involution through the
blastopore lip, the several layers of deep IMZ cells intercalate radially to form one thin, broad layer. This
intercalation further extends the IMZ vegetally (Figure 11.7A). At the same time, the superficial cells
spread out by dividing and flattening. When the deep cells reach the blastopore lip, they involute into
the embryo and initiate a second type of intercalation. This intercalation causes a convergent extension
along the mediolateral axis that integrates several mesodermal streams to form a long, narrow band
(Figure 11.7B). The anterior part of this band migrates toward the animal cap. Thus, the mesodermal
stream continues to migrate toward the animal pole, and the overlying layer of superficial cells
(including the bottle cells) is passively pulled toward the animal pole, thereby forming the endodermal
roof of the archenteron (see Figures 11.4 and 11.7). The radial and mediolateral intercalations of the
deep layer of cells appear to be responsible for the continued movement of mesoderm into the embryo.
Several forces appear to drive convergent extension. The first force is a polarized cell cohesion, wherein
the involuted mesodermal cells send out protrusions to contact one another. These “reachings out” are
not random, but occur toward the midline of the embryo and require an extracellular fibronectin matrix
(Goto et al. 2005; Davidson et al. 2008). These intercalations, both mediolaterally and radially, are
stabilized by the planar cell polarity (PCP) pathway that is initiated by Wnts (Jessen et al. 2000; Shindo
and Wallingford 2014; Ossipova et al. 2015). The second force is differential cell cohesion. During
gastrulation, the genes encoding the adhesion proteins paraxial protocadherin and axial protocadherin
become expressed specifically in the paraxial (somiteforming; see Chapter 17) mesoderm and the
notochord, respectively. An experimental dominant-negative form of axial protocadherin prevents the
presumptive notochord cells from sorting out from the paraxial mesoderm and blocks normal axis
formation.

A dominant-negative paraxial protocadherin (which is secreted instead of being bound to the cell
membrane) prevents convergent extension3 (Kim et al. 1998; Kuroda et al. 2002). Moreover, the
expression domain of paraxial protocadherin characterizes the trunk mesodermal cells, which undergo
convergent extension, distinguishing them from the head mesodermal cells, which do not undergo
convergent extension. A third factor regulating convergent extension is calcium flux. Wallingford and
colleagues (2001) found that dramatic waves of calcium ions (Ca2+) surge across the dorsal tissues
undergoing convergent extension, causing waves of contraction within the tissue. Ca2+ is released from
intracellular stores and is required for convergent extension. If Ca2+ release is blocked, normal cell
specification still occurs, but the dorsal mesoderm neither converges nor extends. These findings
support a model for convergent extension wherein regulatory proteins cause changes in the outer
surface of the tissue and generate mechanical traction forces that either prevent or encourage cell
migration (Beloussov et al. 2006; Davidson et al. 2008; Kornikova et al. 2009). Those mesodermal cells
entering through the dorsal lip of the blastopore give rise to the central dorsal mesoderm (notochord
and somites), while the remainder of the body mesoderm (which forms the heart, kidneys, bones, and
parts of several other organs) enters through the ventral and lateral blastopore lips to create the
mesodermal mantle. The endoderm is derived from the superficial cells of the involuting marginal zone
that form the lining of the archenteron roof and from the subblastoporal vegetal cells that become the
archenteron floor (Keller 1986). The remnant of the blastopore—where the endoderm meets the
ectoderm—now becomes the anus. As gastrulation expert Ray Keller famously remarked, “Gastrulation
is the time when a vertebrate takes its head out of its anus.

Epiboly of the prospective ectoderm During gastrulation, the animal cap and noninvoluting
marginal zone (NIMZ) cells expand by epiboly to cover the entire embryo (see Figure 11.7B).
These cells will form the surface ectoderm. One important mechanism of epiboly in Xenopus
gastrulation appears to be an increase in cell number (through division) coupled with a
concurrent integration of several deep layers into one (Figure 11.8; Keller and Schoenwolf 1977;
Keller and Danilchik 1988; Saka and Smith 2001). A second mechanism of Xenopus epiboly
involves the assembly of fibronectin into fibrils by the blastocoel roof. This fibrillar fibronectin
is critical in allowing the vegetal migration of the animal cap cells and enclosure of the embryo
(Rozario et al. 2009). In Xenopus and many other amphibians, it appears that the involuting
mesodermal precursors migrate toward the animal pole by traveling on an extracellular lattice of
fibronectin secreted by the presumptive ectoderm cells of the blastocoel roof (Figure 11.9A,B).
Confirmation of fibronectin’s importance for the involuting mesoderm came from experiments
with a chemically synthesized peptide fragment that was able to compete with fibronectin for the
binding sites of embryonic cells (Boucaut et al. 1984). If fibronectin were essential for cell
migration, then cells binding this synthesized peptide fragment instead of extracellular
fibronectin should stop migrating. Unable to find their “road,” these prospective mesodermal
cells should cease involution. That is precisely what happened, and the mesodermal precursors
remained outside the embryo, forming a convoluted cell mass (Figure 11.9C,D). Thus, the
fibronectin-containing extracellular matrix appears to provide both a substrate for adhesion as
well as cues for the direction of cell migration. Progressive Determination of the Amphibian
Axes Specification of the germ layers As we have seen, the unfertilized amphibian egg has
polarity along the animal-vegetal axis, and the germ layers can be mapped onto the oocyte even
before fertilization. The animal hemisphere blastomeres will become the cells of the ectoderm
(skin and nerves); the vegetal hemisphere cells become the cells of the gut and associated organs
(endoderm); and the equatorial cells form the mesoderm (bone, muscle, heart). This general fate
map is thought to be imposed on the embryo by the vegetal cells, which have two major
functions: (1) to differentiate into endoderm and (2) to induce the cells immediately above them
to become mesoderm. The mechanism for this “bottom-up” specification of the frog embryo
resides in a set of mRNAs that are tethered to the vegetal cortex. This includes the mRNA for the
transcription factor VegT, which becomes apportioned to the vegetal cells during cleavage. VegT
is critical in generating both the endodermal and mesodermal lineages. When VegT transcripts
are destroyed by antisense oligonucleotides, the entire embryo becomes epidermis, with no
mesodermal or endodermal components (Zhang et al. 1998; Taverner et al. 2005). VegT mRNA
is translated shortly after fertilization. Its product activates a set of genes prior to the mid-blastula
transition. One of the genes activated by this VegT protein encodes the Sox17 transcription
factor. Sox17, in turn, is critical for activating the genes that specify cells to be endoderm. Thus,
the fate of the vegetal cells is to become endodermal. Another set of early genes activated by
VegT encodes Nodal paracrine factors that instruct the cell layers above them to become
mesoderm (Skirkanich et al. 2011). Nodal secreted from the vegetal cells in the nascent
endoderm and signal the cells above them to accumulate phosphorylated Smad2. Phosphorylated
Smad2 helps activate the eomesodermin and Brachyury (Xbra) genes in those cells, causing the
cells to become specified as mesoderm. The Eomesodermin and Smad2 proteins working
together can activate the zygotic genes for the VegT proteins, thus creating a positive
feedforward loop that is critical in sustaining the mesoderm (Figure 11.10). In the absence of
such induction, cells become ectoderm (Fukuda et al. 2010). In addition, the Vg1 mRNA that has
been stored in the vegetal cytoplasm is also translated. The production of Vg1 (another Nodal-
like protein) is needed to activate other genes in the dorsal mesoderm. If either Nodal or Vg1
signaling is blocked, there is little or no mesoderm induction (Kofron et al. 1999; Agius et al.
2000; Birsoy et al. 2006). Thus, by the late blastula stage, the fundamental germ layers are
becoming specified. The vegetal cells are specified as endoderm through transcription factors
such as Sox17. The equatorial cells are specified as mesoderm by transcription factors such as
Eomesodermin. And the animal cap—which has not begun receiving signals yet—becomes
specified as ectoderm (see Figure 11.10). The dorsal-ventral and anterior-posterior axes
Although animal-vegetal polarity initiates specification of the germ layers, the anteriorposterior,
dorsal-ventral, and left-right axes are specified by events triggered at fertilization but not realized
until gastrulation. In Xenopus (and in other amphibians), the formation of the anterior-posterior
axis is inextricably linked to the formation of the dorsal-ventral axis. This, as we will see, is
predicated on fertilization events that will place the transcription factor β-catenin in the region of
the egg opposite the point of sperm entry and will specify that region of the egg to be the dorsal
region of the embryo. Once β-catenin is localized in this region of the egg, the cells containing β-
catenin will induce expression of certain genes and thus initiate the movement of the involuting
mesoderm. This movement will establish the anterior-posterior axis of the embryo. The first
mesodermal cells to migrate over the dorsal blastopore lip will induce the ectoderm above them
to produce anterior structures such as the forebrain; mesoderm that involutes later will signal the
ectoderm to form more posterior structures, such as the hindbrain and spinal cord. This process,
whereby the central nervous system forms through interactions with the underlying mesoderm,
has been called primary embryonic induction and is one of the principal ways in which the
vertebrate embryo become organized. Indeed, its discoverers called the dorsal blastopore lip and
its descendants “the organizer,” and found that this region is different from all the other parts of
the embryo. In the early twentieth century, experiments by Hans Spemann and his students at the
University of Freiburg, Germany, framed the questions that experimental embryologists would
continue to ask for most of the rest of the century and resulted in a Nobel Prize for Spemann in
1935 (see Hamburger 1988; De Robertis and Aréchaga 2001; Sander and Fässler 2001). The
Work of Hans Spemann and Hilde Mangold Autonomous specification versus inductive
interactions The experiment that began the Spemann laboratory’s research program was
performed in 1903, when Spemann demonstrated that early newt blastomeres have identical
nuclei, each capable of producing an entire larva. His procedure was ingenious: Shortly after
fertilizing a newt egg, Spemann used a baby’s hair (taken from his infant daughter) to “lasso” the
zygote in the plane of the first cleavage. He then partially constricted the egg, causing all the
nuclear divisions to remain on one side of the constriction. Eventually—often as late as the 16-
cell stage—a nucleus would escape across the constriction into the non-nucleated side. Cleavage
then began on this side too, whereupon Spemann tightened the lasso until the two halves were
completely separated. Twin larvae developed, one slightly more advanced than the other (Figure
11.11). Spemann concluded from this experiment that early amphibian nuclei were genetically
identical and that each cell was capable of giving rise to an entire organism. However, when
Spemann performed a similar experiment with the constriction still longitudinal but
perpendicular to the plane of the first cleavage (i.e., separating the future dorsal and ventral
regions rather than the right and left sides), he obtained a different result altogether. The nuclei
continued to divide on both sides of the constriction, but only one side—the future dorsal side of
the embryo—gave rise to a normal larva. The other side produced an unorganized tissue mass of
ventral cells, which Spemann called the Bauchstück (“belly piece”). This tissue mass was a ball
of epidermal cells (ectoderm) containing blood cells and mesenchyme (mesoderm) and gut cells
(endoderm), but it contained no dorsal structures such as nervous system, notochord, or somites.
Why did these two experiments have such different results? One possibility was that when the
egg was divided perpendicular to the first cleavage plane, some cytoplasmic substance was not
equally distributed into the two halves. Fortunately, the salamander egg was a good organism to
test that hypothesis. As we saw earlier in this chapter (see Figure 11.2), there are dramatic
movements in the cytoplasm following the fertilization of amphibian eggs, and in some
amphibians these movements expose a gray, crescent-shaped area of cytoplasm in the region
directly opposite the point of sperm entry. The first cleavage plane normally splits this gray
crescent equally between the two blastomeres (see Figure 11.2D). If these cells are then
separated, two complete larvae develop (Figure 11.12A). However, should this cleavage plane be
aberrant (either in the rare natural event or in an experiment), the gray crescent material passes
into only one of the two blastomeres. Spemann’s work revealed that when two blastomeres are
separated such that only one of the two cells contains the crescent, only the blastomere
containing the gray crescent develops normally (Figure 11.12B). It appeared, then, that
something in the region of the gray crescent was essential for proper embryonic development.
But how did it function? What role did it play in normal development? The most important clue
came from fate maps, which showed that the gray crescent region gives rise to those cells that
form the dorsal lip of the blastopore. These dorsal lip cells are committed to invaginate into the
blastula, initiating gastrulation and the formation of the head endomesoderm and notochord.
Because all future amphibian development depends on the interaction of cells that are rearranged
during gastrulation, Spemann speculated that the importance of the gray crescent material lies in
its ability to initiate gastrulation, and that crucial changes in cell potency occur during
gastrulation. In 1918, he performed experiments that showed both statements to be true. He
found that the cells of the early gastrula were uncommitted, but that the fates of late gastrula cells
were determined. Spemann’s demonstration involved exchanging tissues between the gastrulae
of two species of newts whose embryos were differently pigmented—the darkly pigmented
Triturus taeniatus and the nonpigmented T. cristatus. When a region of prospective epidermal
cells from an early gastrula of one species was transplanted into an area in an early gastrula of
the other species and placed in a region where neural tissue normally formed, the transplanted
cells gave rise to neural tissue. When prospective neural tissue from early gastrulae was
transplanted to the region fated to become belly skin, the neural tissue became epidermal (Figure
11.13A; Table 11.1). Thus, cells of the early newt gastrula exhibit conditional (induction-
dependent) specification: their ultimate fate depends on their location in the embryo. However,
when the same interspecies transplantation experiments were performed on late gastrulae,
Spemann obtained completely different results. Rather than differentiating in accordance with
their new location, the transplanted cells exhibited autonomous (mosaic, independent)
development. Their prospective fate was determined, and the cells developed independently of
their new embryonic location. Specifically, prospective neural cells now developed into brain
tissue even when placed in the region of prospective epidermis (Figure 11.13B), and prospective
epidermis formed skin even in the region of the prospective neural tube. Within the time
separating early and late gastrulation, the potencies of these groups of cells had become
restricted to their eventual paths of differentiation. Something caused them to become committed
to epidermal and neural fates. What was happening? Primary embryonic induction The most
spectacular transplantation experiments were published by Spemann and his doctoral student
Hilde Mangold in 1924.4 They showed that, of all the tissues in the early gastrula, only one has
its fate autonomously determined. This self-determining tissue is the dorsal lip of the blastopore
—the tissue derived from the gray crescent cytoplasm opposite the point of sperm entry. When
this tissue was transplanted into the presumptive belly skin region of another gastrula, it not only
continued to be dorsal blastopore lip but also initiated gastrulation and embryogenesis in the
surrounding tissue In these experiments, Spemann and Mangold once again used the differently
pigmented embryos of Triturus taeniatus and T. cristatus so they could identify host and donor
tissues on the basis of color. When the dorsal lip of an early T. taeniatus gastrula was removed
and implanted into the region of an early T. cristatus gastrula fated to become ventral epidermis
(belly skin), the dorsal lip tissue invaginated just as it would normally have done (showing self-
determination) and disappeared beneath the vegetal cells (Figure 11.14A). The pigmented donor
tissue then continued to self-differentiate into the chordamesoderm (notochord) and other
mesodermal structures that normally form from the dorsal lip (Figure 11.14B). As the donor-
derived mesodermal cells moved forward, host cells began to participate in the production of a
new embryo, becoming organs that normally they never would have formed. In this secondary
embryo, a somite could be seen containing both pigmented (donor) and nonpigmented (host)
tissue. Even more spectacularly, the dorsal lip cells were able to interact with the host tissues to
form a complete neural plate from host ectoderm. Eventually, a secondary embryo formed,
conjoined face to face with its host (Figure 11.14C). The results of these technically difficult
experiments have been confirmed many times and in many amphibian species, including
Xenopus (Figure 11.14D,E; Capuron 1968; Smith and Slack 1983; Recanzone and Harris 1985).
Spemann referred to the dorsal lip cells and their derivatives (notochord and head
endomesoderm) as the organizer because (1) they induced the host’s ventral tissues to change
their fates to form a neural tube and dorsal mesodermal tissue (such as somites), and (2) they
organized host and donor tissues into a secondary embryo with clear anterior-posterior and
dorsal-ventral axes. He proposed that during normal development, these cells “organize” the
dorsal ectoderm into a neural tube and transform the flanking mesoderm into the anterior-
posterior body axis (Spemann 1938). It is now known (thanks largely to Spemann and his
students) that the interaction of the chordamesoderm and ectoderm is not sufficient to organize
the entire embryo. Rather, it initiates a series of sequential inductive events. Because there are
numerous inductions during embryonic development, this key induction—in which the progeny
of dorsal lip cells induce the dorsal axis and the neural tube—is traditionally called the primary
embryonic induction. This classical term has been a source of confusion, however, because the
induction of the neural tube by the notochord is no longer considered the

Fertilisasi, Rotasi Kortikal, dan Pembelahan Kebanyakan katak memiliki pembuahan eksternal,
dengan jantan membuahi telur saat betina bertelur. Bahkan sebelum pembuahan, telur katak
memiliki polaritas, yaitu kuning telur yang padat berada di ujung vegetal (bawah), sedangkan
bagian telur hewan (bagian atas) memiliki kuning telur yang sangat sedikit. Seperti yang juga
akan kita lihat, protein dan mRNA tertentu sudah terlokalisasi di wilayah tertentu dari telur yang
tidak dibuahi. Pembuahan dapat terjadi di manapun di belahan bumi hewan telur amfibi. Titik
masuk sperma penting karena menentukan polaritas dorsal-ventral. Titik masuk sperma
menandai sisi ventral (perut) embrio, sedangkan tempat yang berlawanan 180º dengan titik
masuk sperma akan menandai sisi punggung (tulang belakang). Sentriol sperma, yang
memasuki sel telur dengan inti sperma, mengatur mikrotubulus telur menjadi jalur paralel dalam
sitoplasma nabati, memisahkan sitoplasma kortikal luar dari sitoplasma internal kuning (Gambar
11.2A, B). Jejak mikrotubular ini memungkinkan sitoplasma kortikal berputar sehubungan
dengan sitoplasma bagian dalam. Memang, array paralel ini pertama kali terlihat segera
sebelum rotasi dimulai, dan menghilang ketika rotasi berhenti (Elinson dan Rowning 1988;
Houliston dan Elinson 1991). Pada zigot, sitoplasma kortikal berputar sekitar 30º sehubungan
dengan sitoplasma internal (Gambar 11.2C). Dalam beberapa kasus, hal ini memperlihatkan
wilayah sitoplasma bagian dalam berwarna abu-abu tepat di seberang titik masuk sperma
(Gambar 11.2D; Roux 1887; Ancel dan Vintenberger 1948). Wilayah ini, bulan sabit abu-abu,
adalah tempat gastrulasi akan dimulai. Bahkan pada telur Xenopus, yang tidak memperlihatkan
bulan sabit abu-abu, rotasi kortikal terjadi dan gerakan sitoplasma dapat dilihat (Manes dan
Elinson 1980; Vincent et al. 1986). Gastrulasi dimulai di bagian sel telur yang berlawanan
dengan titik masuk sperma, dan wilayah ini akan menjadi bagian punggung embrio. Susunan
mikrotubular yang diatur oleh sentriol sperma pada saat pembuahan memainkan peran besar
dalam memulai gerakan ini. Oleh karena itu, sumbu dorsal-ventral larva dapat ditelusuri kembali
ke titik masuk sperma.

Pembelahan holoblastik radial yang tidak sama

Pembelahan pada kebanyakan embrio katak dan salamander adalah simetris radial dan
holoblastik, seperti pembelahan echinodermata. Telur amfibi, bagaimanapun, jauh lebih besar
dari telur echinodermata dan mengandung lebih banyak kuning telur. Kuning telur ini
terkonsentrasi di belahan tumbuhan dan merupakan penghalang untuk pembelahan. Dengan
demikian, divisi pertama dimulai dari kutub hewan dan perlahan-lahan meluas ke daerah
vegetal (Gambar 11.3A). Pada spesies yang memiliki bulan sabit abu-abu (terutama
salamander dan katak dari genus Rana), belahan pertama biasanya membagi dua bulan sabit
abu-abu (lihat Gambar 11.2D).

Sementara alur pembelahan pertama masih membelah sitoplasma kuning telur dari belahan
tumbuhan, pembelahan kedua telah dimulai di dekat kutub hewan. Belahan ini berada pada
sudut siku-siku dengan yang pertama dan juga meridional. Pembelahan ketiga adalah ekuator.
Namun, karena kuning telur yang ditempatkan secara vegetatif, alur pembelahan ketiga tidak
berada di ekuator tetapi bergeser ke arah kutub hewan (Valles et al. 2002). Ini membagi embrio
amfibi menjadi empat blastomer hewan kecil (mikromer) dan empat blastomer besar
(makromer) di wilayah vegetal. Meskipun ukurannya tidak sama, blastomer terus membelah
dengan kecepatan yang sama sampai siklus sel kedua belas (dengan sedikit penundaan
pembelahan vegetal). Saat pembelahan berlangsung, wilayah hewan menjadi penuh dengan
banyak sel kecil, sedangkan wilayah vegetasi mengandung sejumlah kecil makromer besar
yang sarat kuning telur. Embrio amfibi yang mengandung 16 sampai 64 sel biasanya disebut
morula (morulae jamak; Latin, "mulberry", yang bentuknya agak mirip). Pada tahap 128 sel,
blastocoel menjadi jelas, dan embrio dianggap sebagai blastula (Gambar 11.3B). Banyak
molekul adhesi sel menjaga blastomer yang membelah bersama-sama. Salah satu yang
terpenting adalah EP-cadherin. MRNA untuk protein ini disuplai dalam sitoplasma oosit. Jika
pesan ini dihancurkan oleh oligonukleotida antisense sehingga tidak ada protein EP-cadherin
yang dibuat, maka adhesi antara blastomer akan berkurang secara drastis, yang
mengakibatkan obliterasi dari blastocoel (Heasman et al. 1994a, b). Adhesi membran mungkin
memiliki peran lebih lanjut; ada kemungkinan bahwa koordinasi pembelahan sel dimediasi
melalui gelombang kontraksi membran (Chang dan Ferrell 2013). Meskipun perkembangan
amfibi berbeda dari spesies ke spesies (lihat Hurtado dan De Robertis 2007), pada umumnya
sel-sel belahan bumi hewan akan memunculkan ektoderm, sel-sel vegetal akan memunculkan
endoderm, dan sel-sel di bawah rongga blastocoel akan menjadi mesoderm. (Gambar 11.3C).
Sel-sel yang berlawanan dengan titik masuk sperma akan menjadi ektoderm saraf, mesoderm
notochord, dan endoderm faring (kepala) (Keller 1975, 1976; Landstrom dan Løvtrup 1979).
Blastocoel amfibi memiliki dua fungsi utama. Pertama, dapat mengubah bentuknya sehingga
migrasi sel dapat terjadi selama gastrulasi; dan kedua, mencegah sel-sel di bawahnya
berinteraksi sebelum waktunya dengan sel-sel di atasnya. Ketika Nieuwkoop (1973) mengambil
sel embrionik newt dari atap blastocoel di belahan bumi hewan (daerah yang sering disebut
tutup hewan) dan menempatkannya di sebelah sel vegetal kuning dari dasar blastocoel, sel-sel
topi hewan berdiferensiasi menjadi jaringan mesodermal bukan ektoderm. Dengan demikian,
blastocoel mencegah kontak prematur dari sel-sel vegetal dengan sel-sel tutup hewan, dan
membuat sel-sel tutup hewan tidak terdiferensiasi.

Transisi mid-blastula: Mempersiapkan gastrulasi Prasyarat penting untuk gastrulasi adalah

aktivasi genom zigotik (yaitu, gen di dalam setiap nukleus embrio). Dalam Xenopus laevis,
hanya beberapa gen yang tampak ditranskripsikan selama awal pembelahan. Untuk sebagian
besar, gen inti tidak diaktifkan sampai akhir siklus sel kedua belas (Newport dan Kirschner
1982a, b; Yang et al. 2002). Pada saat itu, embrio mengalami transisi mid-blastula, atau MBT,
saat gen yang berbeda mulai ditranskripsikan di sel yang berbeda, siklus sel memperoleh fase
celah, dan blastomer memperoleh kapasitas untuk menjadi motil. Diperkirakan bahwa beberapa
faktor dalam telur diserap oleh kromatin yang baru dibuat karena (seperti dalam Drosophila)
waktu transisi ini dapat diubah secara eksperimental dengan mengubah rasio kromatin
terhadap sitoplasma dalam sel (Newport dan Kirschner 1982a, b). ). Beberapa peristiwa yang
memicu transisi mid-blastula melibatkan modifikasi kromatin. Pertama, promotor tertentu
mengalami demetilasi, memungkinkan transkripsi gen ini. Selama tahap akhir blastula, terjadi
hilangnya metilasi pada gen promotor yang diaktifkan di MBT. Demetilasi ini tidak terlihat pada
promotor yang tidak diaktifkan di MBT, juga tidak diamati di daerah pengkodean gen yang
diaktifkan MBT. Metilasi lisin-4 pada histon H3 (membentuk lisin trimetilasi yang terkait dengan
transkripsi aktif) juga terlihat pada ujung 5 'banyak gen selama MBT. Tampaknya, modifikasi
promotor tertentu dan nukleosom terkaitnya mungkin memainkan peran penting dalam
mengatur waktu ekspresi gen pada transisi pertengahan blastula (Stancheva et al.2002; Akkers
et al.2009; Hontelez et al.2015 ). Diperkirakan bahwa setelah kromatin di promotor telah
direnovasi, berbagai faktor transkripsi (seperti protein VegT, yang terbentuk di sitoplasma nabati
dari mRNA ibu yang terlokalisasi) terikat ke promotor dan memulai transkripsi baru. Misalnya,
sel-sel tumbuhan (di bawah arahan protein VegT) menjadi endoderm dan mulai mensekresi
faktor-faktor yang mendorong sel-sel di atasnya menjadi mesoderm (lihat Gambar 11.10).
Gastrulasi Amfibi Studi tentang gastrulasi amfibi adalah salah satu yang tertua dan salah satu
bidang embriologi eksperimental terbaru (lihat Beetschen 2001; Braukmann dan Gilbert 2005).
Meskipun gastrulasi amfibi telah dipelajari secara ekstensif sejak tahun 1870-an, teknik
pencitraan langsung baru telah muncul yang memberi kita apresiasi baru tentang seluk-beluk
pergerakan sel ini (Papan et al. 2007; Moosmann et al. 2013). Selain itu, sebagian besar teori
kami mengenai mekanisme gastrulasi dan spesifikasi sumbu telah direvisi selama dua dekade
terakhir. Studi tentang gerakan perkembangan ini juga diperumit oleh fakta bahwa tidak ada
cara tunggal amfibi mencerna; spesies yang berbeda menggunakan cara yang berbeda untuk
mencapai tujuan yang sama. Dalam beberapa tahun terakhir, penyelidikan paling intensif
difokuskan pada Xenopus laevis, jadi kami akan berkonsentrasi pada mekanisme gastrulasi
pada spesies itu.

Rotasi vegetasi dan invaginasi sel botol Blastula amfibi dihadapkan pada tugas yang sama
seperti blastula invertebrata yang kita ikuti di Bab 8 sampai 10 — yaitu, memasukkan ke dalam
embrio area yang ditakdirkan untuk membentuk organ endodermal; untuk mengelilingi embrio
dengan sel yang mampu membentuk ektoderm; dan untuk menempatkan sel mesodermal pada
posisi yang tepat antara ektoderm dan endoderm. Pergerakan sel gastrulasi yang akan
menyelesaikan hal ini dimulai di sisi punggung masa depan embrio, tepat di bawah ekuator, di
wilayah bulan sabit abu-abu (yaitu, wilayah yang berlawanan dengan titik sperma; lihat Gambar
11.2C). Di sini sel berinvaginasi membentuk blastopori seperti celah. Sel-sel botol ini mengubah
bentuknya secara dramatis. Badan utama setiap sel dipindahkan ke bagian dalam embrio
sambil mempertahankan kontak dengan permukaan luar melalui leher yang ramping. Seperti
pada bulu babi, sel-sel botol akan memulai pembentukan archenteron (usus primitif) .1 Namun,
tidak seperti bulu babi, gastrulasi pada katak dimulai bukan di sebagian besar wilayah vegetal
tetapi di zona marginal — wilayah yang mengelilingi ekuator blastula, tempat pertemuan
belahan hewan dan tumbuhan (Gambar 11.4A, B). Di sini, sel-sel endodermal tidak sebesar
atau sekuning kebanyakan blastomer vegetal. Tetapi involusi sel bukanlah peristiwa pasif.
Setidaknya 2 jam sebelum sel botol terbentuk, pengaturan ulang sel internal mendorong sel-sel
lantai punggung blastocoel menuju tutup hewan. Rotasi vegetal ini menempatkan sel endoderm
faring prospektif berdekatan dengan blastocoel dan tepat di atas mesoderm involusi (lihat
Gambar 11.5D). Sel-sel ini kemudian bermigrasi di sepanjang permukaan basal atap blastocoel,
bergerak menuju anterior masa depan embrio (Gambar 11.4C – E; Nieuwkoop dan Florschütz
1950; Winklbauer dan Schürfeld 1999; Ibrahim dan Winklbauer 2001). Lapisan superfisial sel
marginal ditarik ke dalam untuk membentuk lapisan endodermal archenteron, hanya karena ia
melekat pada sel dalam yang bermigrasi secara aktif. Meskipun secara eksperimental
mengeluarkan sel-sel botol tidak mempengaruhi involusi sel-sel zona marginal dalam atau
superfisial ke dalam embrio, pengangkatan sel-sel zona marjinal involusi dalam (IMZ)
menghentikan pembentukan archenteron. involusi pada bibir blastopori Setelah sel-sel botol
membawa zona marginal yang tidak bervolume ke dalam kontak dengan dinding blastocoel,
sel-sel IMZ bervolusi ke dalam embrio. Saat sel-sel marginal yang bermigrasi mencapai bibir
blastopori, mereka berputar ke dalam dan berjalan sepanjang permukaan dalam sel-sel belahan
luar hewan (yaitu, atap blastocoel; Gambar 11.4D – F). Urutan perjalanan ke dalam embrio
ditentukan oleh rotasi vegetal yang berbatasan dengan calon endoderm faring terhadap bagian
dalam jaringan tutup hewan (Winklebauer dan Damm 2011). Sementara itu, sel hewan
mengalami epiboli, menghasilkan aliran sel yang berkumpul dan menjadi bibir blastopori dorsal.
Sel pertama yang menyusun bibir blastopori dorsal dan masuk ke dalam embrio adalah sel-sel
endoderm faring prospektif dari foregut (Gambar 11.5). Sel-sel ini bermigrasi ke anterior di
bawah permukaan ektoderm blastocoel.2 Sel-sel endoderm anterior ini mentranskripsi gen
hhex, yang mengkode faktor transkripsi yang sangat penting untuk membentuk kepala dan
jantung (Rankin et al. 2011). Saat sel-sel pertama ini masuk ke bagian dalam embrio, bibir
blastopori dorsal menjadi terdiri dari sel-sel yang bervolusi ke dalam embrio untuk menjadi pelat
prechordal, prekursor mesoderm kepala. Sel pelat prechordal mentranskripsi gen goosecoid,
yang produknya merupakan faktor transkripsi yang mengaktifkan banyak gen yang
mengendalikan pembentukan kepala. Ia mencapai aktivasi ini secara tidak langsung, dengan
menekan gen-gen tersebut (misalnya, Wnt8) yang menekan perkembangan kepala. Fenomena
ini — aktivasi gen dengan menekan penekannya — adalah ciri utama perkembangan hewan,
seperti yang kita lihat di gerbang negatif ganda yang menentukan mikromer bulu babi. Di
samping berinvolusi melalui bibir blastopori dorsal adalah sel-sel chordamesoderm. Sel-sel ini
akan membentuk notochord, batang mesodermal transien yang berperan penting dalam
menginduksi dan memola sistem saraf. Sel chordamesoderm mengekspresikan gen Xbra
(Brachyury), yang produknya (seperti yang kita lihat di bab sebelumnya) merupakan faktor
transkripsi yang penting untuk pembentukan notochord. Dengan demikian, sel-sel yang
membentuk bibir blastopori dorsal terus berubah saat sel asli bermigrasi ke dalam embrio dan
digantikan oleh sel yang bermigrasi ke bawah, ke dalam, dan ke atas. Saat sel baru memasuki
embrio, blastocoel dipindahkan ke sisi yang berlawanan dengan bibir punggung. Sementara itu,
bibir mengembang ke lateral dan ke arah perut seiring dengan pembentukan dan involusi sel
botol di sekitar blastopori. "Bulan sabit" blastopori yang melebar membentuk bibir lateral dan,
akhirnya, bibir ventral yang dilewati oleh sel-sel prekursor mesodermal dan endodermal
tambahan (Gambar 11.6). Sel-sel ini termasuk prekursor jantung dan ginjal. Dengan
terbentuknya bibir ventral, blastopori telah membentuk cincin di sekeliling sel-sel endodermal
besar yang tetap terbuka pada permukaan tumbuhan.

Tambalan endoderm yang tersisa ini disebut sumbat kuning telur; itu, juga, akhirnya
diinternalisasi (di lokasi anus). Pada saat itu, semua prekursor endodermal telah dibawa ke
bagian dalam embrio, ektoderm telah mengelilingi permukaan, dan mesoderm telah terbawa di
antara keduanya. Sel pertama yang memasuki blastopori menjadi yang paling anterior.

ekstensi konvergen dari mesoderm punggung Gambar 11.7 menggambarkan perilaku sel-sel
zona marginal berinvolusi pada tahap-tahap gastrulasi Xenopus yang berurutan (Keller dan
Schoenwolf 1977; Hardin dan Keller 1988). IMZ awalnya memiliki ketebalan beberapa lapis.
Sesaat sebelum involusi mereka melalui bibir blastopori, beberapa lapisan sel IMZ yang dalam
berinterkalasi secara radial untuk membentuk satu lapisan tipis dan lebar. Interkalasi ini
selanjutnya memperluas IMZ secara vegetatif (Gambar 11.7A). Pada saat yang sama, sel-sel
superfisial menyebar dengan membelah dan meratakan. Ketika sel-sel dalam mencapai bibir
blastopori, mereka bervolusi ke dalam embrio dan memulai jenis interkalasi kedua. Interkalasi
ini menyebabkan perluasan konvergen sepanjang sumbu mediolateral yang mengintegrasikan
beberapa aliran mesodermal untuk membentuk pita yang panjang dan sempit (Gambar 11.7B).
Bagian anterior pita ini bermigrasi ke arah tutup hewan. Dengan demikian, aliran mesodermal
terus berpindah ke kutub hewan, dan lapisan di atasnya dari sel-sel superfisial (termasuk sel
botol) ditarik secara pasif ke arah kutub hewan, sehingga membentuk atap endodermal
archenteron (lihat Gambar 11.4 dan 11.7). Interkalasi radial dan mediolateral dari lapisan dalam
sel tampaknya bertanggung jawab atas pergerakan mesoderm yang berkelanjutan ke dalam
embrio. Beberapa gaya tampaknya mendorong ekstensi konvergen. Gaya pertama adalah
kohesi sel terpolarisasi, di mana sel mesodermal berinvolusi mengirimkan tonjolan untuk saling
bersentuhan. "Jangkauan" ini tidak acak, tetapi terjadi ke arah garis tengah embrio dan
membutuhkan matriks fibronektin ekstraseluler (Goto et al. 2005; Davidson et al. 2008).
Interkalasi ini, baik secara mediolateral maupun radial, distabilkan oleh jalur polaritas sel planar
(PCP) yang diprakarsai oleh Wnts (Jessen et al. 2000; Shindo dan Wallingford 2014; Ossipova
et al. 2015). Gaya kedua adalah kohesi sel diferensial. Selama gastrulasi, gen yang mengkode
protein adhesi paraxial protocadherin dan axial protocadherin diekspresikan secara spesifik
dalam mesoderm dan notochord paraxial (pembentukan somit; lihat Bab 17). Bentuk
eksperimental dominan-negatif protocadherin aksial mencegah sel-sel notochord dugaan
menyortir dari mesoderm paraxial dan menghalangi pembentukan sumbu normal.

Protocadherin paraxial dominan-negatif (yang disekresikan alih-alih terikat ke membran sel)

mencegah ekstensi konvergen3 (Kim et al. 1998; Kuroda et al. 2002). Selain itu, domain
ekspresi protocadherin paraxial mencirikan sel mesodermal trunk, yang mengalami ekstensi
konvergen, membedakannya dari sel mesodermal kepala, yang tidak mengalami ekstensi
konvergen. Faktor ketiga yang mengatur perluasan konvergen adalah fluks kalsium. Wallingford
dan rekan (2001) menemukan bahwa gelombang ion kalsium (Ca2 +) yang dramatis di seluruh
jaringan punggung mengalami perluasan konvergen, menyebabkan gelombang kontraksi di
dalam jaringan. Ca2 + dilepaskan dari penyimpanan intraseluler dan diperlukan untuk perluasan
konvergen. Jika pelepasan Ca2 + diblokir, spesifikasi sel normal masih terjadi, tetapi mesoderm
punggung tidak menyatu atau memanjang. Temuan ini mendukung model untuk ekstensi
konvergen di mana protein pengatur menyebabkan perubahan pada permukaan luar jaringan
dan menghasilkan gaya traksi mekanis yang mencegah atau mendorong migrasi sel (Beloussov
et al.2006; Davidson et al.2008; Kornikova et al.2009 ). Sel-sel mesodermal yang masuk
melalui bibir dorsal blastopori memunculkan mesoderm dorsal sentral (notochord dan somit),
sedangkan mesoderm tubuh lainnya (yang membentuk jantung, ginjal, tulang, dan bagian dari
beberapa organ lain) masuk melalui bibir blastopori ventral dan lateral untuk membuat mantel
mesodermal. Endoderm berasal dari sel-sel superfisial zona marjinal yang tidak berliku yang
membentuk lapisan atap archenteron dan dari sel-sel tumbuhan subblastoporal yang menjadi
lantai archenteron (Keller 1986). Sisa blastopori — tempat endoderm bertemu ektoderm —
sekarang menjadi anus. Seperti yang dikatakan pakar gastrulasi Ray Keller, “Gastrulasi adalah
saat vertebrata mengeluarkan kepalanya dari anusnya.

Epiboli calon ektoderm Selama gastrulasi, sel tutup hewan dan zona marjinal noninvoluting
(NIMZ) berkembang secara epiboli untuk menutupi seluruh embrio (lihat Gambar 11.7B). Sel-
sel ini akan membentuk ektoderm permukaan. Salah satu mekanisme penting epiboly dalam
gastrulasi Xenopus tampaknya adalah peningkatan jumlah sel (melalui pembelahan) ditambah
dengan integrasi bersamaan dari beberapa lapisan dalam menjadi satu (Gambar 11.8; Keller
dan Schoenwolf 1977; Keller dan Danilchik 1988; Saka dan Smith 2001) . Mekanisme kedua
dari Xenopus epiboly melibatkan perakitan fibronektin menjadi fibril oleh atap blastocoel.
Fibronektin fibrilar ini sangat penting dalam memungkinkan migrasi vegetal dari sel-sel tutup
hewan dan penutup embrio (Rozario et al. 2009). Pada Xenopus dan banyak amfibi lainnya,
tampak bahwa prekursor mesodermal yang berinvolusi bermigrasi menuju kutub hewan dengan
berjalan di atas kisi ekstraseluler fibronektin yang disekresikan oleh sel ektoderm dugaan dari
atap blastocoel (Gambar 11.9A, B). Konfirmasi pentingnya fibronektin untuk mesoderm
berinvolusi berasal dari percobaan dengan fragmen peptida yang disintesis secara kimiawi yang
mampu bersaing dengan fibronektin untuk situs pengikatan sel embrio (Boucaut et al. 1984).
Jika fibronektin penting untuk migrasi sel, maka sel yang mengikat fragmen peptida yang
disintesis ini, bukan fibronektin ekstraseluler, harus berhenti bermigrasi. Tidak dapat
menemukan "jalan" mereka, sel-sel mesodermal prospektif ini harus menghentikan involusi.
Itulah yang terjadi, dan prekursor mesodermal tetap berada di luar embrio, membentuk massa
sel yang berbelit-belit (Gambar 11.9C, D). Dengan demikian, matriks ekstraseluler yang
mengandung fibronektin tampaknya menyediakan substrat untuk adhesi serta isyarat untuk
arah migrasi sel. Penentuan Progresif Sumbu Amfibi Spesifikasi lapisan kuman Seperti yang
telah kita lihat, telur amfibi yang tidak dibuahi memiliki polaritas sepanjang sumbu hewan-
tumbuhan, dan lapisan kuman dapat dipetakan ke oosit bahkan sebelum pembuahan.
Blastomer belahan bumi hewan akan menjadi sel-sel ektoderm (kulit dan saraf); sel-sel belahan
nabati menjadi sel-sel usus dan organ terkait (endoderm); dan sel-sel ekuator membentuk
mesoderm (tulang, otot, jantung). Peta nasib umum ini diperkirakan diterapkan pada embrio
oleh sel-sel tumbuhan, yang memiliki dua fungsi utama: (1) untuk berdiferensiasi menjadi
endoderm dan (2) untuk mendorong sel-sel yang berada tepat di atasnya menjadi mesoderm.
Mekanisme untuk spesifikasi “bottom-up” dari embrio katak ini berada dalam satu set mRNA
yang ditambatkan ke korteks vegetal. Ini termasuk mRNA untuk faktor transkripsi VegT, yang
akan dibagikan ke sel vegetal selama pembelahan. VegT sangat penting dalam menghasilkan
garis keturunan endodermal dan mesodermal. Ketika transkrip VegT dihancurkan oleh
oligonukleotida antisense, seluruh embrio menjadi epidermis, tanpa komponen mesodermal
atau endodermal (Zhang et al. 1998; Taverner et al. 2005). VegT mRNA diterjemahkan segera
setelah pembuahan. Produknya mengaktifkan satu set gen sebelum transisi mid-blastula. Salah
satu gen yang diaktifkan oleh protein VegT ini mengkodekan faktor transkripsi Sox17. Sox17,
pada gilirannya, sangat penting untuk mengaktifkan gen yang menentukan sel menjadi
endoderm. Dengan demikian, nasib sel tumbuhan menjadi endodermal. Seperangkat gen awal
lain yang diaktifkan oleh VegT mengkodekan faktor parakrin Nodal yang menginstruksikan
lapisan sel di atasnya untuk menjadi mesoderm (Skirkanich et al. 2011). Nodal disekresi dari sel
vegetal di endoderm yang baru lahir dan memberi sinyal pada sel di atasnya untuk
mengakumulasi Smad2 terfosforilasi. Smad2 terfosforilasi membantu mengaktifkan gen
eomesodermin dan Brachyury (Xbra) di dalam sel tersebut, menyebabkan sel tersebut menjadi
spesifik sebagai mesoderm. Protein Eomesodermin dan Smad2 yang bekerja bersama dapat
mengaktifkan gen zigotik untuk protein VegT, sehingga menciptakan loop umpan maju positif
yang sangat penting dalam mempertahankan mesoderm (Gambar 11.10). Dengan tidak adanya
induksi tersebut, sel menjadi ektoderm (Fukuda et al. 2010). Selain itu, mRNA Vg1 yang telah
disimpan di sitoplasma nabati juga diterjemahkan. Produksi Vg1 (protein mirip Nodal lainnya)
diperlukan untuk mengaktifkan gen lain di mesoderm punggung. Jika pensinyalan Nodal atau
Vg1 diblokir, induksi mesoderm hanya sedikit atau tidak ada (Kofron et al. 1999; Agius et al.
2000; Birsoy et al. 2006). Jadi, pada tahap blastula akhir, lapisan kuman yang mendasar
menjadi ditentukan. Sel-sel vegetal ditetapkan sebagai endoderm melalui faktor transkripsi
seperti Sox17. Sel-sel ekuator ditetapkan sebagai mesoderm oleh faktor transkripsi seperti
Eomesodermin. Dan tutup hewan — yang belum mulai menerima sinyal — ditetapkan sebagai
ektoderm (lihat Gambar 11.10). Sumbu dorsal-ventral dan anterior-posterior Meskipun polaritas
hewan-tumbuhan memulai spesifikasi lapisan germinal, sumbu anteriorposterior, dorsal-ventral,
dan kiri-kanan ditentukan oleh peristiwa yang dipicu saat pembuahan tetapi tidak disadari
sampai gastrulasi. Pada Xenopus (dan pada amfibi lainnya), pembentukan sumbu anterior-
posterior terkait erat dengan pembentukan sumbu dorsal-ventral. Hal ini, seperti yang akan kita
lihat, didasarkan pada peristiwa pembuahan yang akan menempatkan faktor transkripsi β-
catenin di wilayah sel telur yang berlawanan dengan titik masuk sperma dan akan menentukan
wilayah telur tersebut untuk menjadi wilayah punggung embrio. Setelah β-catenin terlokalisasi di
wilayah telur ini, sel-sel yang mengandung β-catenin akan menginduksi ekspresi gen tertentu
dan dengan demikian memulai pergerakan mesoderm yang berinvolusi. Gerakan ini akan
membentuk sumbu anterior-posterior embrio. Sel mesodermal pertama yang bermigrasi
melewati bibir blastopori dorsal akan mendorong ektoderm di atasnya untuk menghasilkan
struktur anterior seperti otak depan; mesoderm yang berinvolusi kemudian akan memberi sinyal
kepada ektoderm untuk membentuk lebih banyak struktur posterior, seperti otak belakang dan
sumsum tulang belakang. Proses ini, di mana sistem saraf pusat terbentuk melalui interaksi
dengan mesoderm yang mendasarinya, disebut induksi embrio primer dan merupakan salah
satu cara utama di mana embrio vertebrata menjadi terorganisir. Memang, penemunya
menyebut bibir dorsal blastopori dan keturunannya sebagai "penyelenggara", dan menemukan
bahwa wilayah ini berbeda dari semua bagian lain dari embrio. Pada awal abad kedua puluh,
eksperimen oleh Hans Spemann dan mahasiswanya di Universitas Freiburg, Jerman,
membingkai pertanyaan yang akan terus ditanyakan oleh ahli embriologi eksperimental selama
sisa abad ini dan menghasilkan Hadiah Nobel untuk Spemann pada tahun 1935 ( lihat
Hamburger 1988; De Robertis dan Aréchaga 2001; Sander dan Fässler 2001). Pekerjaan Hans
Spemann dan Hilde Mangold Spesifikasi otonom versus interaksi induktif Eksperimen yang
memulai program penelitian laboratorium Spemann dilakukan pada tahun 1903, ketika
Spemann menunjukkan bahwa blastomer kadal awal memiliki inti yang identik, masing-masing
mampu menghasilkan seluruh larva. Prosedurnya sangat cerdik: Tak lama setelah membuahi
telur kadal air, Spemann menggunakan rambut bayi (diambil dari bayi perempuannya) untuk
"menjerat" zigot di bidang pembelahan pertama. Dia kemudian mengencangkan sebagian telur,
menyebabkan semua divisi nuklir tetap berada di satu sisi penyempitan. Akhirnya — seringkali
hingga tahap 16-sel — sebuah inti akan lepas melintasi penyempitan menuju sisi yang tidak
berinti. Pembelahan kemudian dimulai di sisi ini juga, dimana Spemann mengencangkan laso
sampai kedua bagian benar-benar terpisah. Larva kembar berkembang, yang satu sedikit lebih
maju dari yang lain (Gambar 11.11). Spemann menyimpulkan dari percobaan ini bahwa inti
amfibi awal secara genetik identik dan bahwa setiap sel mampu melahirkan organisme secara
keseluruhan. Akan tetapi, ketika Spemann melakukan percobaan serupa dengan penyempitan
masih membujur tetapi tegak lurus dengan bidang pembelahan pertama (yaitu, memisahkan
daerah punggung dan perut masa depan daripada sisi kanan dan kiri), dia memperoleh hasil
yang berbeda sama sekali. Inti terus membelah di kedua sisi penyempitan, tetapi hanya satu
sisi — sisi punggung masa depan embrio — yang menghasilkan larva normal. Sisi lain
menghasilkan massa jaringan sel ventral yang tidak terorganisir, yang oleh Spemann disebut
Bauchstück ("potongan perut"). Massa jaringan ini berupa bola sel epidermis (ektoderm) yang
mengandung sel darah dan mesenkim (mesoderm) dan sel usus (endoderm), tetapi tidak
mengandung struktur punggung seperti sistem saraf, notochord, atau somit. Mengapa kedua
percobaan ini memiliki hasil yang berbeda? Salah satu kemungkinannya adalah ketika telur
dibelah secara tegak lurus dengan bidang pembelahan pertama, beberapa substansi
sitoplasma tidak terdistribusi secara merata ke dua bagian. Untungnya, telur salamander adalah
organisme yang baik untuk menguji hipotesis tersebut. Seperti yang kita lihat di awal bab ini
(lihat Gambar 11.2), terdapat gerakan dramatis dalam sitoplasma setelah pembuahan telur
amfibi, dan pada beberapa amfibi, gerakan ini memperlihatkan area sitoplasma abu-abu
berbentuk bulan sabit di wilayah yang berhadapan langsung dengan titik tersebut. masuknya
sperma. Bidang pembelahan pertama biasanya membagi bulan sabit abu-abu ini secara merata
antara dua blastomer (lihat Gambar 11.2D). Jika sel-sel ini kemudian dipisahkan, dua larva
lengkap akan berkembang (Gambar 11.12A). Namun, jika bidang pembelahan ini menyimpang
(baik dalam peristiwa alam yang langka atau dalam percobaan), material bulan sabit abu-abu
hanya masuk ke salah satu dari dua blastomer. Pekerjaan Spemann mengungkapkan bahwa
ketika dua blastomer dipisahkan sedemikian rupa sehingga hanya satu dari dua sel yang
mengandung bulan sabit, hanya blastomer yang mengandung bulan sabit abu-abu yang
berkembang secara normal (Gambar 11.12B). Kemudian, tampak bahwa sesuatu di wilayah
bulan sabit abu-abu itu penting untuk perkembangan embrio yang tepat. Tapi bagaimana
fungsinya? Peran apa yang dimainkannya dalam perkembangan normal? Petunjuk paling
penting datang dari peta nasib, yang menunjukkan bahwa daerah bulan sabit abu-abu
memunculkan sel-sel yang membentuk bibir dorsal blastopori. Sel-sel bibir punggung ini
berkomitmen untuk berinvaginasi ke dalam blastula, memulai gastrulasi dan pembentukan
endomesoderm kepala dan notochord. Karena semua perkembangan amfibi di masa depan
bergantung pada interaksi sel yang diatur ulang selama gastrulasi, Spemann berspekulasi
bahwa pentingnya bahan bulan sabit abu-abu terletak pada kemampuannya untuk memulai
gastrulasi, dan bahwa perubahan penting dalam potensi sel terjadi selama gastrulasi. Pada
tahun 1918, dia melakukan eksperimen yang menunjukkan bahwa kedua pernyataan itu benar.
Ia menemukan bahwa sel-sel dari gastrula awal tidak terikat, tetapi nasib sel-sel gastrula yang
terlambat ditentukan. Demonstrasi Spemann melibatkan pertukaran jaringan antara gastrulae
dari dua spesies kadal air yang embrionya berpigmen berbeda — Triturus taeniatus berpigmen
gelap dan T. cristatus yang tidak berpigmen. Ketika wilayah sel epidermis prospektif dari
gastrula awal dari satu spesies ditransplantasikan ke area di gastrula awal spesies lain dan
ditempatkan di wilayah di mana jaringan saraf biasanya terbentuk, sel yang ditransplantasikan
memunculkan jaringan saraf. Ketika jaringan saraf prospektif dari gastrula awal
ditransplantasikan ke wilayah yang ditakdirkan menjadi kulit perut, jaringan saraf menjadi
epidermal (Gambar 11.13A; Tabel 11.1). Jadi, sel-sel gastrula kadal air awal menunjukkan
spesifikasi bersyarat (bergantung pada induksi): nasib akhir mereka bergantung pada lokasinya
dalam embrio. Namun, ketika percobaan transplantasi antarspesies yang sama dilakukan pada
gastrula akhir, Spemann memperoleh hasil yang sangat berbeda. Alih-alih berdiferensiasi
sesuai dengan lokasi barunya, sel-sel yang ditransplantasikan memperlihatkan perkembangan
otonom (mosaik, independen). Nasib prospektif mereka ditentukan, dan sel-sel berkembang
secara independen dari lokasi embrionik baru mereka. Secara khusus, sel saraf prospektif
sekarang berkembang menjadi jaringan otak bahkan ketika ditempatkan di wilayah epidermis
prospektif (Gambar 11.13B), dan epidermis prospektif membentuk kulit bahkan di wilayah
tabung saraf prospektif. Dalam waktu memisahkan gastrulasi awal dan akhir, potensi kelompok
sel ini menjadi terbatas pada jalur diferensiasi akhirnya. Sesuatu menyebabkan mereka
berkomitmen pada nasib epidermal dan saraf. Apa yang terjadi? Induksi embrio primer
Eksperimen transplantasi yang paling spektakuler diterbitkan oleh Spemann dan mahasiswa
doktoralnya Hilde Mangold pada tahun 1924.4 Mereka menunjukkan bahwa, dari semua
jaringan di gastrula awal, hanya satu yang nasibnya ditentukan secara mandiri. Jaringan yang
menentukan sendiri ini adalah bibir dorsal blastopori — jaringan yang berasal dari sitoplasma
bulan sabit abu-abu yang berlawanan dengan titik masuknya sperma. Ketika jaringan ini
ditransplantasikan ke daerah kulit perut dugaan gastrula lain, itu tidak hanya berlanjut menjadi
bibir blastopori dorsal tetapi juga memulai gastrulasi dan embriogenesis di jaringan sekitarnya.
Dalam percobaan ini, Spemann dan Mangold sekali lagi menggunakan embrio berpigmen
berbeda dari Triturus. taeniatus dan T. cristatus sehingga dapat mengidentifikasi jaringan inang
dan donor berdasarkan warna. Ketika bibir punggung dari gastrula T. taeniatus awal diangkat
dan ditanamkan ke dalam daerah gastrula T. cristatus awal yang ditakdirkan untuk menjadi
epidermis ventral (kulit perut), jaringan bibir punggung menginvaginasi seperti biasanya
(menunjukkan diri -determination) dan menghilang di bawah sel vegetal (Gambar 11.14A).
Jaringan donor berpigmen kemudian terus berdiferensiasi sendiri menjadi chordamesoderm
(notochord) dan struktur mesodermal lain yang biasanya terbentuk dari bibir dorsal (Gambar
11.14B). Saat sel mesodermal yang diturunkan dari donor bergerak maju, sel inang mulai
berpartisipasi dalam produksi embrio baru, menjadi organ yang biasanya tidak akan pernah
terbentuk. Dalam embrio sekunder ini, somit terlihat mengandung jaringan berpigmen (donor)
dan nonpigmentasi (inang). Lebih spektakuler lagi, sel-sel bibir punggung mampu berinteraksi
dengan jaringan inang untuk membentuk pelat saraf lengkap dari ektoderm inang. Akhirnya,
embrio sekunder terbentuk, bertatap muka bersama dengan inangnya (Gambar 11.14C). Hasil
percobaan yang secara teknis sulit ini telah dikonfirmasi berkali-kali dan pada banyak spesies
amfibi, termasuk Xenopus (Gambar 11.14D, E; Capuron 1968; Smith dan Slack 1983;
Recanzone dan Harris 1985). Spemann merujuk pada sel bibir dorsal dan turunannya
(notochord dan head endomesoderm) sebagai penyelenggara karena (1) mereka menginduksi
jaringan ventral inang untuk mengubah nasib mereka untuk membentuk tabung saraf dan
jaringan mesodermal dorsal (seperti somit), dan ( 2) mereka mengatur jaringan inang dan donor
menjadi embrio sekunder dengan sumbu anterior-posterior dan dorsal-ventral yang jelas. Dia
mengusulkan bahwa selama perkembangan normal, sel-sel ini "mengatur" ektoderm punggung
menjadi tabung saraf dan mengubah mesoderm mengapit menjadi sumbu tubuh anterior-
posterior (Spemann 1938). Sekarang diketahui (sebagian besar berkat Spemann dan murid-
muridnya) bahwa interaksi chordamesoderm dan ektoderm tidak cukup untuk mengatur seluruh
embrio. Sebaliknya, ini memulai serangkaian peristiwa induktif berurutan. Karena terdapat
banyak induksi selama perkembangan embrio, induksi kunci ini — di mana keturunan sel bibir
dorsal menginduksi sumbu punggung dan tabung saraf — secara tradisional disebut induksi
embrionik primer. Istilah klasik ini telah menjadi sumber kebingungan, karena induksi tabung
saraf oleh notochord tidak lagi dianggap sebagai