Chương 3

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

3.1 Nước
Nước là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy, là yếu tố quan
trọng nhất quyết định sự phát triển của mọi vi sinh vật. Sự trao đổi chất, quá trình sinh
tổng hợp các cấu trúc tế bào, nghĩa là các phản ứng sinh hóa chỉ có thể xảy ra trong môi
trường nước. Trong môi trường không có nước mọi hoạt động dinh dưỡng đều bị dừng
lại, bởi ở trạng thái khô các chất dinh dưỡng đều không thể thâm nhập vào tế bào.
Chất lượng nước ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng môi trường. Phù hợp nhất để
pha môi trường là nước cất hoặc nước khử ion với pH=7. Trên thực tế, nước cất sau một
thời gian bảo quản, do sự thâm nhập các phần tử từ không khí nên bị acid hóa, pH của
nước bị kéo xuống chỉ còn trên dưới 6,5. Đây là điểm cần lưu ý khi pha chế từ các môi
trường đông khô theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.1.1 Nước sử dụng cho phân tích
Nước dùng để pha chế môi trường phải là nước tinh khiết, đã được khử khoáng và
mới được chưng cất, độ dẫn điện không vượt quá 2µS/cm.
Chỉ sử dụng nước cất để pha chế hóa chất, môi trường. Trong trường hợp cần thiết
có thể dùng nước đã khử ion (tương đương với nước cất một lần) để pha môi trường nếu
đảm bảo nước không chứa tạp chất có thể gây ức chế sự sinh trưởng hoặc phát triển của
vi khuẩn.
Nước cất xong được chứa trong các thùng sạch dán nhãn (ngày cất, mã số
can/thùng). Tiến hành kiểm tra TPC cho mỗi thùng trước khi sử dụng. Kết quả kiểm tra
TPC sẽ được ghi chép và tham khảo khi quyết định có thể sử dụng lô nước cất hay
không.
Chỉ tiêu chấp nhận được đối với nước cất

Chỉ tiêu (TPC 37oC/24 giờ) Mức chấp nhận

Tổng số vi sinh vật (TPC, CFU/ml) <50

3.1.2 Nước sử dụng thông thường

Nước sử dụng thông thường trong phòng kiểm nghiệm vi sinh (rửa dụng cụ, rửa tay,
dùng cất nước…) là nước thủy cục hoặc nước đã được xử lý để đảm bảo đạt chất lượng
vệ sinh.
3.2 Thạch (Agar)
Thạch là một loại polygalactoside thu được từ một số loài tảo đỏ thuộc họ
Rhodophyceae (ví dụ như rong câu, rất phổ biến ở một số vùng ven biển Việt Nam).
Trong nước, thạch tạo thành gel nóng chảy ở 100 oC và đông lại ở gần 40oC. Nồng độ
thích hợp để làm rắn môi trường thường được dùng là 1-2%. Để xác định tính di động
hay nuôi dưỡng vi sinh vật kỵ khí hoặc vi hiếu khí, nồng độ thạch thường được dùng là
0,05-0,3%.
Nếu môi trường nuôi cấy có giá trị pH thấp hơn 5,0, nồng độ thạch cần tăng lên 2-
2,2% hoặc tốt nhất là chỉnh pH sau khi đã khử trùng môi trường. Việc bổ sung một lượng
nhỏ thạch vào môi trường nuôi cấy lỏng sẽ hạn chế dòng lưu chuyển, làm thay đổi nồng
độ oxy ở mức độ khác nhau, giúp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật kỵ khí hoặc
hiếu khí thuộc loại khó tính
3.3 Peptone
Peptone (sản phẩm thủy phân protein) được dùng trong các môi trường nuôi cấy vi
sinh vật dị dưỡng. Tùy theo nguồn protein (như casein, gelatin, thịt, bột đậu nành…) và
loại tác nhân dùng để phân giải chúng (kiềm, acid hoặc các enzyme chuyên biệt như
pancreatin, trypsin, pepsin, papain…) người ta sản xuất ra nhiều loại peptone dùng cho
những mục đích nuôi cấy khác nhau. Dưới đây là một số ví dụ (với những tên gọi khác
nhau tùy theo hãng sản xuất).
- Peptone trypticase (peptone từ casein dạng pancreatic) là sản phẩm phân giải
casein bằng pancreatin, có thể dùng rộng rãi cho nhiều loại vi sinh vật kỵ khí lẫn hiếu khí,
dùng trong môi trường sinh hóa để thử indol (do hàm lượng tryptophn cao), dùng xác
định khả năng tạo men tryptophan deaminase của vi sinh vật…
- Peptone thịt là sản phẩm phân giải thịt bằng pepsin
- Peptone myosate là sản phẩm th3uy phân cơ tim bò bằng pancreatin
3.4 Cao thịt
Cao thịt được chế từ thịt đã loại bỏ gân, mỡ và xử lý sơ bộ bằng các men phân giải
protein trước khi trích ly và cô đặc. Đây là chất nền dinh dưỡng cực tốt rất giàu đạm
peptone và acid amin (chiếm đến 85-90% trọng lượng khô).
3.5 Cao nấm men
Cao nấm men được chế bằng cách đông khô dung dịch ly trích từ nấm men đã qua
quá trình tự giải. Cao nấm men rất giàu các loại vitamin, tạo điều kiện phát triển tốt cho
nhiều dạng vi sinh vật.
3.6 Một số tác nhân tạo môi trường kỵ khí
Để tạo môi trường kỵ khí người ta thường dùng một số sản phẩm dưới đây:
- Bột gan: được chế bằng cách làm khô và nghiền nhỏ gan bò tươi. Do chất lượng
dinh dưỡng cao và đặc biệt là hệ thống oxy hóa khử tự nhiên vốn có trong gan được duy
trì tốt qua quá trình chế biến, dung dịch dinh dưỡng từ bột gan rất thích hợp cho việc nuôi
dưỡng các vi sinh vật kỵ khí
- Ngoài bột gan những tác nhân khử thường được đưa vào môi trường nuôi cấy vi
sinh vật kỵ khí là sodium thioglycolate, sodium formaldehyde sulfoxylate, cystein. Đặc
điểm chung của các tác nhân này là chứa lưu huỳnh (nguyên tố có khả năng nhận điện tử
thay thế oxy, tạo nên điều kiện kỵ khí trong môi trường).
3.7 Các chế phẩm từ mật bò
Các chế phẩm từ mật bò thường được dùng trong các môi trường chọn lọc hoặc
phân lập do khả năng kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột đồng thời ức
chế các vi khuẩn gram dương (ngoại trừ Enterococci).
- Mật bò được chế từ mật bò tươi qua làm sạch và sấy khô. Một gram mật bò khô
tương đương với 10-12 gram mật tươi.
- Hỗn hợp muối mật là tập hợp muối sodium của các aicd có trong mật bò (như
cholic, taurocholic, desoxycholic…) tác dụng giống như mật bò nhưng hoạt tính cao hơn
và được dùng với nồng độ thấp hơn.
- Sodium desoxycholate là chế phẩm muối mật tinh khiết thường được dùng trong
nhiều môi trường chọn lọc hoặc phân lập trực khuẩn đường ruột gram âm.
3.8 Các chất ức chế chọn lọc
Do tính đa dạng của các loài vi sinh vật cần kiểm tra trong các loại mẫu thử, những
yếu tố ức chế chọn lọc là thành phần không thể thiếu trong các môi trường chọn lọc và
phân lập. Ngoài các yếu tố hóa lý như độ pH, nhiệt độ… người ta thường đưa vào các
môi trường trên những chất ức chế đặc hiệu với các tổ hợp (thành phần và nồng độ) khác
nhau để tạo nên những hiệu quả mong muốn đối với các vi sinh vật cần ức chế. Dưới đây
là ví dụ về một số chất ức chế như vậy:
- Azide và sulfite ức chế các trực khuẩn gram âm trong môi trường chọn lọc
Streptococci.
- Sulfite và fuchsin ức chế phần lớn vi khuẩn gram dương trong môi trường Endo.
- Lauryl sulfate ức chế phần lớn các vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường canh
lauryl sulfate dùng tăng sinh chọn lọc và chẩn đoán sơ bộ Coliforms.
3.9 Các cơ chất để thử phản ứng sinh hóa
Các tính chất sinh hóa là những tiêu chuẩn quan trọng nhất để định danh và phân
loại vi sinh vật. Các tính chất này được xác định bởi khả năng của vi sinh vật sản sinh ra
những loại men nhất định có tác dụng phân giải hoặc làm biến đổi những cơ chất tương
ứng. Bản chất của các thử nghiệm sinh hóa là dùng những cơ chất nhất định để thử khả
năng phân giải hoặc biến đổi chúng của các dòng vi sinh vật được cấy vào môi trường.
Những cơ chất thường được dùng để thử khả năng biến giải của vi sinh vật là các
loại đường hoặc rượu như lactose, glucose, saccharose, fructose, maltose, galactose,
mannitol…
3.10 Các chất chỉ thị màu
Hai loại chất chỉ thị quan trọng nhất thường dùng trong các môi trường nuôi cấy vi
sinh vật là các chất chỉ thị pH và rH. Nguyên tắc hoạt động của các chất chỉ thị là chúng
làm biến đổi màu môi trường khi các giá trị pH (mức acid hóa hay kiềm hóa của môi
trường) hoặc rH (hàm lượng oxy trong môi trường) bị thay đổi.
Những chất chỉ thị pH có vùng chuyển màu gần với độ pH tối ưu cho sự phát triển
của nhiều loại vi sinh vật thường được sử dụng trong các môi trường nuôi cấy là
bromothymol blue, brocresol, neutral red và đặc biệt là phenol red. Nếu môi trường có
chứ chất chỉ thị màu phenol red chẳng hạn, nó sẽ đổi màu từ đỏ sang vàng do tác dụng
của những vi sinh vật có khả năng phân giải các loại đường sinh acid làm pH của môi
trường giảm xuống.

Chất chỉ thị pH môi pH pH

Thành phần hóa học
pH trường acid kiềm

Dibromo-o-`[-trew
Bromcresol 5.2 -
6.3 –tím 6.8 - tím ‘/,cresolsulfonphthalein
purple vàng
(C21H16O5SBr2)

7.0 – 7.6 – Dibromophenolsulfonphthalein

Bromthymol 6.0 -
xanh lá Xanh (C27H28O5SBr2)
blue vàng
cây đậm

4.4 - 6.0 - 4’ – Dimethylaminoazobenzene-2-

Methyl red 5.0 carboxylic acid (C15H15N3O2)
đỏ vàng

6.8 - 8.0 - 2- Methylamiophenazine

Neutral red 7.5 (C15H17N4Cl)
đỏ vàng

8.4 – đỏ Phenolsulfonphthalein
6.8 -
Phenol red 7.9 hồng (C19H14O5S)
vàng
nhạt