Xeno Oestrogene Stoffen in Het Aquatische Milieu in Nederland Een Verkennende

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.
net/publication/289368361
Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu in Nederland: een

verkennende studie
Technical Report · December 1996
CITATIONS READS
2 165
2 authors:
Andre Dick Vethaak Antoon Opperhuizen

Deltares Maastricht University
256 PUBLICATIONS 9,867 CITATIONS 188 PUBLICATIONS 6,473 CITATIONS
SEE PROFILE SEE PROFILE
Some of the authors of this publication are also working on these related projects:
ICON prject View project
Human health hazards of exposure to micro- and nanoplastics View project
All content following this page was uploaded by Andre Dick Vethaak on 05 January 2016.
The user has requested enhancement of the downloaded file.

Ministerie van verkeer en waterstaat Directoraat-Generaal Rijkswaterstaat
Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ
Xeno-oestrogene stoffen
in het aquatische milieu
in Nederland:
een verkennende studie
Dick Vethaak Rijkswaterstaat
AntOOn Opperhuizen Rijksinstituut voor
Kust en Zee/RIKZ
bibliotheek
Rapport RIKZ 96.015 _
december 1996 /fJ^fZ~^^r On
Voorwoord
In het kader van de voorbereiding en de uitvoering van beleid op het

terrein van de bescherming van Nederlandse watersystemen tegen
vervuiling en het beperken en voorkomen van de schadelijke gevolgen,
verricht Rijk waterstaat een groot aantal onderzoeken. Het Rijksinstituut
voor Kust en Zee (RIKZ) en het Rijksinstituut voor Integraal
Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA) voeren voor de
hoofddirectie van Rijkswaterstaat het onderzoeksprogramma Toxische
Stoffen' uit. Daarom heeft het RIKZ een voorstudie gedaan naar het
mogelijk belang van de aanwezigheid van bepaalde typen stoffen die de
voortplanting van organismen kunnen bedreigen.
Deze studie is onderdeel van het project STOF-VELD. Dit project heeft
tot doel Inzicht te geven in het optreden van ecologische en
ecotoxicologische effecten in het natuurlijk milieu, en probeert de
oorzaken van mogelijke verstoringen te achterhalen, Het merendeel van
het veldonderzoek gericht op de estuariene en mariene wateren van het
programma Toxische Stoffen' wordt binnen dit project uitgevoerd.
De studie is grotendeels gebaseerd op een literatuurstudie die het

adviesbureau MiBACL) (mevrouw ir. W. Smidt) in het voorjaar van 1995
heeft verricht. De auteurs zijn verder dr. P. Hagel (RIVO-DLO), drs. C.
van de Guchte (RIZA) en drs. H.G. Evers (RIKZ) dankbaar voor hun
adviezen en kritische kanttekeningen bij de tekst.
Rijksinstituut voor Kust en Zee
Inhoudsopgave
Voorwoord
Samenvatting 4
Uitgebreide samenvatting met conclusies en aanbevelingen 5
Extended sumtnaty 9
1 Introductie en probleemstelling 13
2 Ontregeling van geslachtshormonen 17
3 Waarnemingen van oestrogene werking van stoffen 19
4 Inventarisatie xeno-oestrogenen 21
4.1 Schadelijke oestrogene werkingvan therapeutische stoffen 21
..1,1 DES en andere stilbenen 21
4.1.2 Ethinyloestradiol en mestranol 22
4.1.3 Andere therapeutische middelen 23
4.2 Alkylfenol en alkylfenoylethoxylaten 23
4.3 Fyto- en myco-oestrogenen 25
4.4 Chloorkool waterstoffen 27
4.4.1 Chloordecone en Mirex 27
4.4.2 DDT en derivaten 27
4.4.3 Methoxychloor 28
4.4.4 Polychloorbifenylen 29
4.4.5 Beta-Hexachloorcyclohexaan 29
4.5 Overige stoffen 30
4.5.1 Dibenz(ah)anthraceen metabolieten 30
4.5.2 Organosiloxanen 30
4.5.3 Diversen 30
5 Xeno-oestrogenen: welke zijn belangrijk? 33

5.1 Structuur-activiteitsrelaties 33
5.2 Relatieve potentie van xeno-oestrogene stoffen 34
6 Stoffen die van belang zijn voor het milieu in Nederland 39
7 Aanbevelingen 43
Literatuur 47
Bijlage 1 61
Fysiologie van oestrogene stoffen: de sexuele
ontwikkeling der invloed van oestrogenen
Bijlage 2 66
Mflieuchemische en toxicologische informatie over
alkylfenolen en ethoxyderi vaten
Bijlage 3 72
Concentraties van enkele xeno-oestrogene stoffen in
Nederlandse watersystemen
Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

Samenvatting
In dit rapport wordt een verkennend onderzoek beschreven naar het

mogelijk belang van xeno-oestrogene stoffen als bedreiging voor de
voortplanting van organismen. Speciale aandacht is besteed aan
alkylfenolderivaten. Xeno-oestrogene stoffen zijn een bepaald type
milieuvreemde stoffen die via binding aan specifieke receptoren in
organismen een oestrogene werking kunnen uitoefenen. In hoofdstuk 1
van het rapport worden de aanleiding en problematiek ten aanzien van
de (mogelijke) effecten van xeno-oestrogene stoffen nader uiteengezet.
Hoofdstuk 2 gaat in op de ontregeling van de endocriene functies als
gevolg van hormonale werking door xeno-oestrogene stoffen en de
eventuele gevolgen daarvan. Hoofdstuk 3 bevat een bespreking van de
thans beschikbare testmethoden voor het screenen van milieuvreemde
stoffen op oestrogene activiteit; de resultaten die tot nu toe met deze
testen zijn behaald, worden bediscussieerd. Een overzichten beschrijving
van de stoffen en stofgroepen met oestrogene werking wordt gegeven
in hoofdstuk 4.
In hoofdstuk 5 wordt het belang van xeno-oestrogene stoffen voor
reproductie effecten op basis van moleculaire structuur-activiteitrelaties
en dosis-effectrelaties nader onderbouwd.
In hoofdstuk 6 wordt beargumenteerd welke stoffen specifiek voor het
Nederlandse milieu van belang kunnen zijn.
De aanbevelingen voor nader onderzoek en aandachtspunten voor
beleid zijn opgenomen in hoofdstuk 7.
Bijlage 1 bevat achtergrondinformatie met betrekking tot de rol van
geslachtshormonen bij de voortplanting en de sexuele ontwikkeling.
Bijlage 2 geeft een overzicht van de literatuur met betrekking tot het
milieuchemische en het toxicologische gedrag van alkylfenolen en
ethoxyderivaten.
Bijlage 3 bevat een lijst met de concentraties van enkele xeno-
oestrogene stoffen die voorkomen in Nederlandse watersystemen.

Uitgebreide samenvatting met conclusies en

aanbevelingen
Aanleiding
De potentiële bedreiging die hormoonverstorende stoffen, en meer in

het bijzonder xeno-oestrogene stoffen, voor de voortplanting van mens
en dier kunnen vormen, is in vrij korte tijd volop in de aandacht
gekomen. Sinds 1992 zijn er berichten verschenen waarin een causale
relatie wordt verondersteld tussen een mogelijke vermindering van de
spermaproductie bij de man gedurende de laatste vijf decennia en een
toegenomen blootstelling aan xeno-oestrogene stoffen in het milieu. Die
berichten hebben veel stof doen opwaaien. Behalve mogelijke effecten
op de humane voortplanting zijn vergelijkbare effecten op de
geslachtsorganen (hermafrodisme, onvruchtbaarheid, vervrouwelijking,
enz.) al eerder en in opvallend toenemende mate de laatste jaren
wereldwijd bij een breed scala van dieren (krokodillen, panters,
zeehonden, vogels, slakken, enz.) geconstateerd.
In Nederland is tot op heden in het beheer en beleid weinig aandacht
besteed aan xeno-oestrogene stoffen, dit in tegenstelling tot de ons
omringende landen en de Verenigde Staten en Canada. Al sinds enige
jaren verricht Rijkswaterstaat nadere studies op het terrein van mogelijke
reproductieverstoring bij dieren in het Nederlandse milieu - in het
bijzonder in de kustwateren. In het kader van deze recente
ontwikkelingen is onze verkennende studie tot stand gekomen.
Afbakening en Inhoud van de studie
In deze literatuurstudie zal de nadruk bijna uitsluitend liggen op in het

milieu voorkomende chemicaliën die (waarschijnlijk) via specifieke
receptorbinding aantoonbaar oestrogeen actief zijn. Het doel van de
studie is vierledig:
1) het inventariseren van milieuvervuilende stoffen die aantoonbaar

oestrogeen zijn, waarbij speciale aandacht geschonken wordt aan
alkylfenolderivaten.
2) nagaan in welke mate xenobiotische oestrogene stoffen in het
Nederlandse aquatische milieu voorkomen.
3) onderbouwen van het belang van xeno-oestrogenen voor
reproductie-effecten in het Nederlandse milieu op basis van
endocrinologisch werkingsmechanisme en dosis-effect relaties.
4) formuleren van beleidsaandachtspunten ter beperking of
voorkoming van eventuele effecten, alsmede het formuleren van
advies- en onderzoeksvragen die belangrijk meer inzicht kunnen
geven in mogelijke reproductie-effecten in het Nederlandse milieu
door aanwezigheid van xeno-oestrogene stoffen.
Ontregeling van de endocrinologie van geslachtshormonen
De reproductie bij alle gewervelde en diverse ongewervelde dieren

wordt geregeld dooreen complex systeem van hormonen, Oestrogene
hormonen als oestradiol (met name 17p-oestradiol) en verwante

steroiden zijn van vitaal belang bij het vrouwelijke voortplantings-

systeem. Oestradiol wordt geproduceerd in de follikelcellen van de
ovaria en is extra actief tijdens de fase bij rijping van de eicel. Het
stimuleert onder meer de aanmaak van progesteron receptoren. Behalve
andere primaire functies, zoals de groei van de baarmoeder en
borstklieren, is het ook verantwoordelijk voor de secundaire
geslachtskenmerken. Progesteron wordt geproduceerd na de ovulatie in
het corpus luteum en remt de verdere rijping van andere follikels af. De
ovaria worden op hun beurt gereguleerd door de hypofyse en de
afbraak van oestrogenen vindt plaats in de lever. Aanmaak en afbraak
van hormonen zijn ingewikkelde processen, waarbij een goede regulatie
en hormoonspiegel van belang is voor de reproductie. Verstoring van de
regulatie zal de reproductie kunnen verstoren. Oestrogenen in het bloed
van een man heeft een anti-masculine werking (vervrouwelijking) tot
gevolg.
De werking van direct oestrogene stoffen heeft hoofdzakelijk plaats

doordat stoffen direct aan de oestrogeenreceptor binden, waarbij de
oestrogene stof het hormoon gewoon imiteert. Binding van oestrogeen
induceert een cascade aan reacties die de vrouwelijke reproductie
controleren. Maar ook synthetische hormoon-actieve stoffen en een
aantal chemische milieuverontreinigingen werken via dit mechanisme,
zoals ethinyloestradiol (bestanddeel van de anticonceptiepil) en
bijvoorbeeld diethylstiIbestrol (DES), dat begin 1950 tot begin 1970
werd voorgeschreven om spontane abortus bij vrouwen tegen te gaan.
Screeningsmethoden voor oestrogene stoffen
In de literatuur is van tientallen stoffen die in het milieu voorkomen

oestrogene activiteit bekend. Een aantal van deze stoffen komt van
nature voor in bepaalde planten en schimmels (fyto-oestrogenen), maar
voor het merendeel betreft het industrieel geproduceerde stoffen uit
bronnen, zoals pesticiden, herbiciden, detergenten en plastics.
In tal van studies worden diverse methoden gebruikt om oestrogene
werking aan te tonen. Klassiek is veel gebruik gemaakt van studies
waarin de binding van een stof aan de oestrogeenreceptor (ER) wordt
bepaald. Binding aan de ER betekent echter lang niet altijd oestrogene
werking. Het is ook goed mogelijk dat binding anti-oestrogeniteit
inhoudt, omdat de stof zelf niet verder actief is en de werking van
oestradiol verhinderd.
De laatste jaren is in toenemende mate gebruik gemaakt van gekweekte
cellen waarin oestrogeniteit meetbaar is. Hierbij gaat het enerzijds om
gekweekte (borst- of endometrium) kankercellen die voor proliferatie
onder oestrogene controle staan. Anderzijds gaat het om levercellen
(hepatocyten) die onder 'oestrogene druk' dooiereiwit (vitellogenine)
afscheiden. Recentelijk wordt ook gebruik gemaakt van de zogenaamde
'Yeast-Assay', een screeningstest die is gebaseerd op transcriptie van de
humane oestrogeenreceptor ingebouwd in de kern van gistcellen. Als
reporter gen wordt het Lac-Z gebruikt dat codeert voor p-galacto-
sidase. Dit laatste wordt gebruikt om de activiteit van de receptor te
meten. Deze drie soorten in vitro assays worden momenteel in een
aantal laboratoria in het buitenland verder ontwikkeld en kunnen in de
nabije toekomst worden ingezet voor biomonitoring.
Onlangs is ook in Nederland de Landbouwuniversiteit van Wageningen
(LUW) met het RIKZ een onderzoek begonnen naar de ontwikkeling van
een funktionele in vitro screeningstest voor (anti)oestrogeen-actteve
stoffen. Dit betreft een recombinante receptor/gen-assay, waarbij
gebruik wordt gemaakt van de humane oestrogeenreceptor en een

luciferase reporter gen (CALUX: Chemical-Activated Luciferase Gene

Expression). Voorlopige resultaten van deze studie zijn veelbelovend en
implementatie van deze nieuwe screeningstest lijkt binnen handbereik.
Behalve de in vitro bioassays worden testen met intacte organismen

gebruikt om oestrogeniteit op te sporen. Klassiek is veel gebruik
gemaakt van de geslachtsontwikkeling bij knaagdieren en vogels. De
laatste jaren wordt steeds vaker gebruik gemaakt van vissen, waarbij
onder meer dooiereiwitproductie een geschikte maat is voor oestrogene
activiteit van een stof. In Engeland is inmiddels met redelijk succes
gebruik gemaakt van vissen als biomonitor in het milieu; mannelijke
regenboogforellen werden hier gekooid uitgezet in 'verdacht
oppervlaktewater' en in verschillende gevallen werd sterke
dooiereiwitproductie waargenomen. Aan de LUW en TNO wordt
momenteel gewerkt aan een veelbelovend model met ingeteelde
karpers. Hierbij wordt gebruik gemaakt van feminisatie van genetisch
mannelijke karpers na blootstelling aan oestrogene stoffen.
Stoffen die van belang zijn voor het Nederlandse milieu
In Nederland is weinig tot niets bekend over de mate waarin xeno-

oestrogenen voorkomen in water, waterbodem of organismen. In het
bijzonder zou het hierbij moeten gaan om stoffen als: alkylfenolen en
polyethoxyderivaten daarvan; diverse soorten stilbenen, met name
tamoxifen; diverse ftaalzuuresters; bisfenol-A; o,p'-DDTen o,p'-DDE;
natuurlijke (17p-oestradiol) en synthetische oestrogenen in 'de pil' (o.a.
ethinyloestradiol). Van het zwak oestrogeen werkende beta-
cyclohexaan, een bijproduct van het bestrijdingsmiddel lindaan, zijn wel
reguliere metingen bekend. De concentraties zijn zo laag dat er weinig
risico's zijn te verwachten van dit xeno-oestrogeen. Van DDT zijn totaal-
concentraties bekend, maar geen informatie is beschikbaar van de
eveneens oestrogeen-actieve isomeer - het o,p'-DDT.
Van de meeste milieucontaminanten is (nog) niet bekend of zij
oestrogene effecten kunnen veroorzaken. De lijst van stoffen die zich
kunnen binden aan de oestrogeen receptor wordt echter voortdurend
langer. Andere risicostoffen mogelijk van belang voor de Nederlandse
situatie zijn met name: dibenz(ah)anthraceen en mogelijk enkele andere
PAK's; toxafeen (gechloreerde camfenen), en verder endosulfan
(Kepone) en dieldrin. Verder zijn er vele stofklassen waarvan oestrogene
activiteit niet bekend is maar waarvan de chemische structuurkenmerken
zoveel gelijkenis vertonen met stoffen die wel bekend oestrogeen zijn,
dat nader onderzoek hiernaar dringend gewenst is. Ugilec en
difenylethers zijn hiervan voorbeelden.
Conclusies en aanbevelingen
Nader onderzoek naar de effecten van xeno-oestrogene stoffen is vooral

gewenst om tot een wetenschappelijk onderbouwde uitspraak te
kunnen komen over de waarschijnlijkheid van reproductiestoornissen in
organismen in Nederlandse wateren. Metingen door middel van
bestaande en nog te ontwikkelen chemische analyse-technieken zijn
nodig om de aanwezigheid van xeno-oestrogene stoffen (zoals
alkylfenolen en alkylfenol-ethoxylaten, ftaalzuuresters, bisfenol-A en
natuurlijke en synthetische oestrogenen) in de Nederlandse
oppervlaktewateren in kaart te brengen. Ook kunnen in vitro bioassays
worden ingezet om te onderzoeken welke milieuverontreinigingen (met
name bepaalde PAK's, bestrijdingsmiddelen, Ugilec en difenylethers)

oestrogene effecten veroorzaken. Het optreden van additieve en

synergistische effecten door combinaties van oestrogene stoffen dient
met deze bioassays nader te worden onderzocht. Wel moet hiervoor
nog worden nagegaan welke vorm dosis-respons relaties dergelijke
bioassays opleveren, en welke betrouwbaarheid de resultaten hebben
op het niveau van organismen. Een voorbeeld van een reeds
gevalideerde in vivo assay is de vitellogenine test met de regenboog-
forel. Ontwikkeling van aanvullende in vivo toxiciteitsto etsen en
diagnostische biomarkers is daarnaast nodig.
Aangezien in de literatuur nog maar weinig bekend is over de

langetermijngevolgen van bioaccumutatie van xeno-oestrogene stoffen
en in vitro bioassays evenmin ons weinig kunnen vertellen over deze
gevolgen omdat ze feitelijk alleen de mate van directe blootstelling
meten, is nader onderzoek nodig naar de gevolgen van ophoping van
alkylfenolen, verschillende soorten bestrijdingsmiddelen (met name o,p'-
DDT en o,p'-DDE) en ftaalzuuresters. Indien voor deze stoffen geen
additionele informatie beschikbaar komt, dan moet worden
aangenomen dat zij door de combinatie van oestrogeniteit en
bioaccumulatie actief oestrogeen zijn in het milieu. Dit zou aanleiding
kunnen zijn voor ingrijpende beleids- en beheersmaatregelen. Voor
bepaalde bestrijdingsmiddelen zoals DDT is, gezien de bestaande
verboden, aanvullend beleid niet nodig.
Het is eveneens van belang kennis te vergaren over hormoon-

verstorende stoffen met andere werkingsmechanismen (bijvoorbeeld
androgenen) en deze bij de beoordeling van gezondheidsrisico's van
milieucontaminanten te betrekken. Van organotinverbindingen,
bijvoorbeeld, is inmiddels aangetoond dat zeer kleine hoeveelheden van
deze stoffen (ppt-gebied) geslachtsveranderingen veroorzaken bij
slakken in onze kustwateren.
Er is ten slotte dringend behoefte aan monitorïng van reproductie-

effecten in de veldsituatie, mede gebruik makend van betrouwbare
biomarkers en bioassay-gestuurde fractionering, waardoor het mogelijk
wordt de verantwoordelijke actieve fracties en de individuele stoffen te
identificeren.

Extended summary
Xeno-oestrogens in the Dutch aquatic environment: an inventory

study.
Introduction
This inventory, undertaken by the National Institute for Coastal and

Marine Management (RIKZ), focuses on evaluating the significance in
the aquatic environment of the presence of certain types of compounds
(oestrogen-active compounds or xeno-oestrogens) that could potentially
dfsrupt reproduction in organisms including humans.
Xeno-oestrogens are defined as xenobiotics, or metabolites of
xenobiotics that mimic the action of the female sex-hormonesr
particularly oestradiol, in the body, A major mechanism of action of such
compounds is that they interfere by binding to the oestrogen-receptors
to initiate a physiological response.
The aims of this inventory study are:

1) to list the xenobiotics which have been shown to be directly
oestrogenic, special attention being given to the alkylphenol
derivatives.
2) to identify the degree to which xeno-oestrogenic compounds occur
in the Dutch aquatic environment.
3) to understand the effects of these xeno-oestrogens on animal
reproduction in the Dutch aquatic environment by analyzing
dose-related effects following known endocrine pathways.
4) to identify areas for further research that would improve our
knowledge of these effects set.
5) to set out issues which need to be addressed by policies aimed at
reducing and preventing effects.
Summary of the main findings in the study
In the Netherlands, little attention has so far been paid to formulating

legislation for the management of environmenta! xenobiotics that affect
the function of female sex hormones. This provides a contrast with some
other countries, where there is awareness that certain industrial
compounds can alter oestradio! regulation. Furthermore, research has
revealed effects on reproduction and development in several species,
and has even led to the conclusion that some of these species could be
endangered.
In the Netherlands, little is known aboutthe occurrence of xeno-
oestrogens in water, sediment or animal tissues. Data derived from
routine monitoring are availabte for beta-cyciohexane, a weakly
oestrogenic compound. However, concentrates of this compound are
extremely fow and unlikely to represent any risks. There is comparable
data on total concentrations of DDT, but virtuaüy none for its
oestrogenic isomer, o.p'-DDT.
As far as the important xeno-oestrogens recorded in the international

literature are concerned, only limited data are available to define their
status in Dutch waters. These compounds include alkylphenols and poly-
ethoxy-derivatives, different types of stilbenes, e.g. tamoxifen, various

phthalates, biphenol-A, o,p'-DDT, o,p'-DDE, natural oestrogens (17(3-

oestradiol), ethinyloestradiol and other synthetic oestrogens present in
'anticonceptiva'.
There are many other compounds for which there is insufficient

information regarding their oestrogenic activity, although they are
expected to exhibit such activity. They can not be added to the list of
important xeno-oestrogens untii more is known of their chemical
properties. Examples include dibenz(ah)anthracene and possibiy several
other PAHs, toxaphene, endosulfan and dieldrin. The firsttwo of these
compounds in particuiar could be important in the Netherlands.
Furthermore, there are many groups of compounds whose oestrogenic
activity is unknown, but whose chemical structures have much in
common with known oestrogens. Examples include Ugilec and
diphenylethers. Further research into these compounds is urgently
needed.
ft is known from the literature that many compounds present in the
environment exhibit oestrogenic activity. There are several methods for
establishing oestrogenicity in compounds; conventional approaches
involve binding the compound to the oestrogen receptor (ER). However,
binding to the ER does not always imply oestrogenic activity. In fact, it
can mean anti-oestrogenicity if the compound itself has become
inactive, and the working mechanism of oestradiol is therefore blocked.
Research into oestrogenic sensitivity tests has resulted in the

development of in vitro methods involving cell cultures. One such
method involves exposing suspect compounds to cuitured cells derived
from mamma or endometrium tumours. Proliferation of the cells is
controlled if oestrogens are present. A second method involves exposure
of compounds to celi cultures of hepatocytes, any oestrogenic activity
inducing vitellogenin production in the cuitured cells. In addition, a
sensitive oestrogen assay based on genetically engineered yeast which
contains the human oestrogen receptor gene has recently become
available. With further development, all three of these in vitro methods
appear to be promising for screening sources of oestrogens in the
environment Currently, the Department of Toxicology, Agricultural
University of Wageningen, in colloboration with RIKZ, is developing
another genetically engineered assay for oestrogens and anti-
oestrogens. This approach is based on in vitro recombinant
receptor/reporter gene assay (CALUX: Chemical-Activated Luciferase
Gene Expression). Preliminary results of this study are very promising,
and implementation of the test in routine monitoring seems to be within
reach.
In addition to in vitro bioassays, in vivo tests have been used to detect

oestrogenicity. For example, exposure of rodents and birds to xeno-
oestrogens has resulted in changes to gametogenesis, development of
sexual organs and progeny development. Recently, and with particuiar
significance to studies of the aquatic environment, fish have been used
as test models. Levels of vitellogenin production have been measured to
detect oestrogenic activity. For example, laboratory experiments in the
UK have shown elevated levels of vitellogenin in trout exposed to xeno-
oestrogens. Also, in field trials involving caged carp and trout, both
female en male fish in rivers receiving effluents from sewage treatment
works showed elevated vitellogenin production. Recently, feminization
of male carp has been recommended as a suitable in vivo model for
testing the endocrine activity of chemicals and effluents. It was shown
that genetically all-male, sexually undifferentiated populations develop
female characteristics after exposure to known oestrogenic compounds.
Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu 10

In the Netherlands, experiments to detectthe presence of sources of

xeno-oestrogens in surface waters have not yet been carried out. In
order to identify the extent of any oestrogen-related effects on the
Dutch aquatic environment, it is important that this situation is rectified
and that testing begins without deiay. Chemical techniques for anaiysing
a number of the above-mentioned compounds are already available.
Short-term bioassays, as described above, should be used to monitor the
presence of as yet unidentified xeno-oestrogens. The possibility of
biotransformation should also be taken into account. Before any
bioassay method is introduced, the dose-response relationships need to
be refined. It is important that all false-positive and false-negative results
are eliminated, or at least become very rare.
Research is also needed into the biodegradability of some xeno-

oestrogens by organisms or environmental processes. For exampie,
some industrial compounds are hydrophobic and therefore accumulate
in sediments and in the tissues of organisms. This will make oestrogenic
activlty more likely and will increase its effects. Unfortunately, very little
is known about the effects of bioaccumulation on the activity of xeno-
oestrogens. Bioassays only measure the effect of direct exposure, not
bioaccumuiattve effects. There is therefore a need for further
information about bioaccumulation of xeno-oestrogenlc compounds
such as alkylphenols, various pesticides (e.g. o.p'-DDT and o.p'-DDE)
and phthalate esters. Even in the absence of further information, it has
to be assumed that because of the combination of oestrogenicity and
bioaccumulation, these compounds are probably active in the aquatic
environment. This could be sufficient reason to take legislative and
management action. Due to the prohibition on certain pesticides such as
DDT in the Netherlands, however, no further action in relation to these
compounds is necessary at the moment.
The real risk that xeno-oestrogens and other endocrine disrupting

chemicals may pose to aquatic organisms in the Dutch environment can
only be adequately assessed on basis of eco-epidemiological studies,
Therefore it is necessary that a monitoring programme should be
implemented with sensitive indicator species to determine the
magnitude and extent of individual and population-level reponses. This
programme should utilise reliable biomarkers and bioassay-directed
fractionation in order to identify the active fractions and the individual
compounds responsible.


1. Introductie en probleemstelling
Oestrogene en androgene stoffen zijn geslachtshormonen die door

organismen zelf worden geproduceerd. Zij zijn van essentieel belang
voor de normale voortplanting van gewervelden. Voor de mannelijke
ontwikkeling van organismen zijn androgenen van belang. In
afwezigheid van androgenen ontwikkelen zich meestal organismen met
vrouwelijk uiterlijke kenmerken (fenotype). Oestrogene stoffen worden
zowel in mannetjes als vrouwtjes aangetroffen. 17Beta-oestradiol is van
de oestrogene hormonen het meest bekend en reguleert voor een
belangrijk deel de geslachtelijke ontwikkeling en de vruchtbaarheid van
vrouwtjes.
Te hoge concentraties oestrogenen kunnen bij vrouwtjes leiden tot
reproductie-toxische effecten in de geslachtsorganen, waardoor de
voortplanting wordt verstoord. Een te hoge concentratie oestrogene stof
in organismen meteen mannelijk genetische samenstelling (genotype)
kan resulteren in vervrouwelijking van de geslachtsontwikkeling
(feminisatie) - in sommige organismen resulteert dit in de afwezigheid
van exemplaren met een mannelijk fenotype. Genotype en fenotype zijn
dan niet meer overeenkomstig voor het individu.
Bij geslachtsrijpe mannetjes kunnen hoge concentraties oestrogenen
voor een sterk verminderde spermaproductie zorgen, verandering van
het paringsgedrag veroorzaken, en mogelijk tot steriliteit leiden. Bij
sommige organismen (vissen, reptielen en amfibieën) kan aanmaak van
dooiereiwit (vitellogenine) optreden bij mannetjes door verhoogde
oestrogeenspiegels - een effect dat normaal alleen bij vrouwtjes kan
optreden bij de ontwikkeling van eitjes.
Te hoge concentraties androgenen kunnen vergelijkbare effecten
opwekken. Bij mannetjes kan daling van de spermaproductie optreden,
soms zelfs resulterend in steriliteit. Aanwezigheid van androgenen in
vrouwtjes kan leiden tot steriliteit met eveneens als mogelijke
consequentie het onvermogen tot voortplanting.
Verstoorde balansen tussen androgenen en oestrogenen kunnen op veel
manieren verminderde of zelfs geblokkeerde voortplantings-
mogelijkheden veroorzaken. Steriliteit, geslachtsomkeer en
hermafrodisme (inclusief extreme vormen zoals imposex) zijn hiervan
enkele vormen.
In de afgelopen jaren zijn er steeds meer publikaties verschenen waarin

wordt aangegeven dat er in het milieu stoffen voorkomen die in vele
soorten organismen oestrogene of androgene werking kunnen hebben.
Een veelheid van publikaties bevat informatie over natuurlijke stoffen,
zoals die bijvoorbeeld geproduceerd worden door planten, die
reproductie bij gewerveiden kunnen verstoren. Nog alarmerender zijn
echter publikaties waarin wordt aangetoond dat diverse industrieel
geproduceerde stoffen oestrogene of androgene activiteit bezitten.
Stoffen die vanwege hun oestrogene werking internationaal veel
aandacht krijgen zijn onder meer p-nonylfenol en ethoxylaatderivaten
daarvan, stilbeen-derivaten, enkele soorten pesticiden, en diverse
klassen gechloreerde koolwaterstoffen.

Rijksinstituut voor Kusten Zee
Aan stoffen met mogelijk androgene werking is de laatste jaren minder

aandacht geschonken dan aan die met oestrogene werking. Slechts de
sterke penis-ontwikkeling bij slakachtigen (imposex) is een androgeen
effect dat de laatste jaren in milieu-onderzoek en -beleid sterk in de
belangstelling staat. De aandacht richt zich hierbij voornamelijk op de
effecten van organotinverbindingen (Ten Haüers-Tjabbesetal., 1994;
Mensink et al., 1996).
Recentelijk zijn in Croot-Brittannië en Denemarken omvangrijke

rapporten over de problematiek van xeno-oestrogene stoffen
gepubliceerd, te weten een rapport van de British Medical Research
Council (Harrison et al., 1995) en een rapport van de Danisch
Environmental Protedion Agency (Toppari et al., 1995).
In tegenstelling tot de aandacht die xenobiotica met oestrogene
activiteit (xeno-oestrogenen) en androgene activiteit (xeno-androgenen)
in Europese landen zoals Denemarken, Groot-Brittannië, Duitsland en
Zweden, alsmede in de Verenigde Staten en Canada krijgen, is er tot op
heden in Nederland weinig aandacht voor deze milieuproblematiek, tn
diverse landen heeft een reportage van het BBC-programma Horizon
over oestrogenen in het milieu - veel stof doen opwaaien. In dit
programma, evenals in de publikaties van Colborn en medewerkers
(Colborn en Clement, 1992; Colborn et al., 1993; McLachlan en Korach,
1995) worden vele mogelijke voorbeelden uit de natuur aangehaald
waaruit de dreiging van xeno-oestrogene stoffen zou kunnen blijken.
Hierbij gaat het om het optreden van effecten bij een zeer breed scala
van organismen, mogelijk zelfs inclusief de mens. Met name de
publikatie van Skakkebaek en medewerkers (Carisen et al., 1992; Sharp
en Skakkebaek, 1993; Sharpe, 1993) waarin een mogelijke daling van
de spermaproductie en een toename in het voorkomen van testiculaire
tumoren bij mensen wordt gesuggereerd, heeft aandacht getrokken (zie
Raloff, 1994; Stone, 1994). Deze discussie duurt voort, en de
epidemiologische en veldgegevens zijn niet altijd eenduidig te
interpreteren (zie o.a. Daston et al., 1995). De mogelijke daling van de
humane spermaproductiviteit is bijvoorbeeld in twijfel getrokken in de
publikaties van Olson et al. (1995) en Bromwich et al. (1994); hierbij zijn
eventuele methodologische fouten bij de interpretatie van
gegevensbestanden de belangrijkste bron van kritiek.
Inmiddels worden op vrijwel alle belangrijke toxicologische,
endocrinologische en milieu-chemische congressen en symposia
themasessies georganiseerd over oestrogene en androgene risico's. De
relatieve stilte op dit front in Nederland is dan ook opvallend. Hier lijkt
een duidelijke kentering op te treden. In het werkprogramma van de
Gezondheidsraad staat het thema 'milieuverontreiniging en
voortplanting' vermeld voor 1996 en 1997. Een commissie die de
invloed van anthropogene stoffen op de geslachtshormoonhuishouding
van dieren en daarmee op het functioneren van ecosystemen nader zal
bestuderen, is inmiddels door de Raad geïnstalleerd. Een verkennende
studie van het RIVM over het genoemde onderwerp met accent op
humane effecten is in de zomer van 1996 gepubliceerd. Op 23 februari
1996 werd door het RIKZ in samenwerking met de onderzoekschool
SENSE een studiedag over het thema 'oestrogeen-actieve stoffen in het
milieu' gehouden. Een verslag dat een goed overzicht geeft van het
onderzoek dat op dit terrein in Nederland wordt uitgevoerd, is onlangs
gepubliceerd (Leonards et al., 1996).
Al eerder is het ministerie van Verkeer en Waterstaat begonnen met
nadere studies op het terrein van mogelijke reproductieverstoring in het
Nederlandse milieu - in het bijzonder in de Nederlandse kustwateren. In
het kader van deze recente ontwikkelingen is de onderhavige studie tot
stand gekomen.

Afbakening van de vraagstelling van de studie
In deze studie zal de meeste aandacht worden geschonken aan stoffen

die waarschijnlijk aan de ER binden en die daarna een oestrogeen effect
kunnen veroorzaken. Hierbij zal ook aandacht worden geschonken aan
stoffen die eerst gemetaboliseerd moeten worden voordat zij aan de ER
kunnen binden. Stoffen die indirect oestrogeen zijn, en werken via een
meer algemene endocriene ontregeling, of stoffen die op andere wijze
reproductieverstorend werken worden buiten beschouwing gelaten.
Verder wordt geen aandacht geschonken aan stoffen die wel aan de ER
kunnen binden maar geen oestrogeen effect veroorzaken in
organismen. Meestal zijn deze stoffen anti-oestrogeen omdat zij de
binding van endogeen oestradiol belemmeren en daarmee voor
endocriene ontregeling zorgdragen.
Verder is deze studie voornamelijk gericht op gewervelde organismen.
Voor zover mogelijk, wordt aandacht geschonken aan endocrinologische
overeenkomsten en verschillen tussen knaagdieren, vogels en vissen. De
aandacht voor de laatste twee diersoorten is gekozen, omdat zij zeer
vee! worden gebruikt in milieutoxicologisch onderzoek en in effect-
monitoringsprogramma's in het veld.
Het doel van de studie is vierledig:
1) het inventariseren van milieuvervuilende stoffen die aantoonbaar

oestrogeen zijn, waarbij speciale aandacht wordt geschonken aan
alkyifenolderivaten.
2) nagaan in welke mate xenobiotische oestrogene stoffen in het
Nederlandse aquatische milieu voorkomen.
3) onderbouwen van het belang van xeno-oestrogenen voor
reproductie-effecten in het Nederlandse milieu op basis van
endocrinologisch werkingsmechanisme en dosis-effect relaties.
4) formuleren van beleidsaandachtspunten ter beperking of
voorkoming van eventuele effecten, alsmede het formuleren van
advies- en onderzoeksvragen die belangrijk meer inzicht kunnen
geven in mogelijke reproductie-effecten in het Nederlandse milieu
door aanwezigheid van xeno-oestrogene stoffen.


2. Ontregeling van de geslachtshormonen
Verstoring van hormonale regulering van organogenese, oöcytose en

spermatogenese kan op vele manieren tot stand komen. In recente
publicaties van Colborn en medewerkers (Colbom en Clement, 1992;
Colborn et al., 1993; Rolland et a!., 1995) zijn hiervan zeer veel
voorbeelden gegeven. Op het niveau van hormonale signaal transductie
tussen hypothalamus, hypophyse en gonaden zijn diverse toxicologische
ontregelingsmechanismen denkbaar. Beïnvloeding van de werking van
de hypothalamus is bijvoorbeeld aangetoond {Thomas, 1990). Directe
effecten van kationische zware metalen, (Cooper et al., 1987) is
aangetoond in de rat. Effecten van cadmium op de afgifte van
gonadotrofine is aangetoond bij de rat (Thomas, 1991). Effecten van
cadmium op de secretie van sex-hormonen in vissen is gevonden door
Balm (1987) en Thomas (1990).
Directe effecten van xenobiotische stoffen op de ontwikkeling van de
gonaden is onder meer aangetoond voor methylkwik in vissen (Wester
en Canton, 1992). Verondersteld wordt dat de werking van deze stof is
gebaseerd op de ontregeling van de cellulaire homeostase, waardoor
celdeling (mitose) wordt verhinderd. Voor normale ontwikkeling en
werking van de testis is mitose essentieel. Hoewel eveneens effecten op
de gonaden zichtbaar waren bij blootstelling van vissen aan
organotinverbindingen in vergelijkbare experimenten (Westeren
Canton, 1987) lijkt de werking van deze laatste stof klasse meer te
duiden op een androgeen of anti-oestrogeen effect dan die van een
gonadetoxine die mitose verstoort.
In bijlage 1 wordt een overzicht gegeven van de literatuur met

betrekking tot de rol(len) van oestrogene (en androgene) stoffen bij de
voortplanting en de sexuele ontwikkeling. Hierbij is de meeste aandacht
gericht op knaagdieren, vogels en vissen - dit mede gezien de speciale
aandacht die aan deze organismen wordt geschonken in publikaties over
milieu-effecten. Omdat zeer veel bekend is van de endocrinologie van
knaagdieren is een belangrijk deel van de beschrijving van de fysiologie
van oestrogene en androgene stoffen gebaseerd op informatie die is
verkregen met deze diergroep,
Eco-epidemiologische gegevens over reproductiestoornissen bij wilde-

dierpopulaties in Nederland zijn niet of nauwelijks beschikbaar.
Reproductiestoornissen bij de gewone zeehond in de Waddenzee zijn in
verband gebracht met chloorkool waterstof f en (Reijnders and Brasseur,
1992). De betrokken contaminanten en onderliggende mechanismen
zijn echter nog onbekend.
Effecten op reproductie zijn onlangs geconstateerd bij de platvis bot met
een experimentele effectstudie in bassins met vervuild slib, afkomstig uit
het Rotterdamse havengebied. Onder deze experimentele
omstandigheden werd een verschuiving in de afrijptijd van de wijfjes
vastgesteld. Dit ging vergezeld van een vervroegde productie van
vitellogenine die waarschijnlijk werd veroorzaakt door een verlaagde
uitscheiding van endogeen oestradiol uit het bloed. De vervroegde
vitellogenese zou op lange termijn kunnen resulteren in verminderd
reproductiesucces (Janssen, 1996).

De werking van direct oestrogene stoffen (xeno-oestrogenen) kan op

ten minste drie verschillende manieren. Ten eerste kunnen stoffen
binden aan de oestrogeenreceptor (ER), waarbij de werking van
oestrogene stof identiek is aan die van 17p-oestradiol. Het tweede
mechanisme is gebaseerd op de stimulering van de endogene produktie
van 17p-oestradiol. Een derde mechanisme zou kunnen zijn een
vermindering van de 17(i-oestradiol afbraak. In testen met normale
organismen is het moeilijk onderscheid te maken tussen verschillende
werkingsmechanismen. Met name is er in de literatuur weinig bekend
over stoffen die de endogene secretie van 17f}-oestradiol kunnen
stimuleren.
Zeer geschikte, recent verschenen, publicaties waarin een overzicht
wordt gegeven van milieuvervuilende stoffen die reproductie verstorend
kunnen werken, zijn van Kime (1995), Toppari et al. (1995) en Harrison
et al. (1995). Ook in het werk van Colborn et al. (1993) staan vele
reproductieverstorende stoffen vermeld, waaronder veel stoffen die
waarschijnlijk niet oestrogeen werken.
Verder zijn er stoffen die wel aan de ER kunnen binden maar geen
oestrogeen effect veroorzaken in organismen. Meestal zijn deze stoffen
anti-oestrogeen, omdat zij de binding van endogeen oestradiol
belemmeren en daarmee voor endocriene ontregeling zorgdragen. Van
verschillende polychloorbifenylen bijvoorbeeld is anti-oestrogene
werking bekend, evenals van polychloor dibenzo-p-dioxines (Astroff and
Safe, 1990). Verder zijn er ook stoffen die op een andere indirecte wijze
de hormoonregulatie kunnen beïnvloeden, bijvoorbeeld doordat ze het
metabolisme of de afgifte van 17p-oestradiol beïnvloeden.
In in vivo experimenten is de werking van stoffen vaak onbekend -

slechts op basis van vergelijkend onderzoek kan een indruk verkregen
worden of het gaat om direct of indirect werkende oestrogene stoffen.
In ER-bindingsstudies geldt het omgekeerde - het mechanisme van
potentiële activiteit is bekend, maar het is de vraag of het in hele
organismen ook tot expressie komt. Vaak wordt een positieve correlatie
verondersteld tussen ER-binding, andere cellulaire oestrogeniteitstesten,
en in vivo effecten. Helaas blijken praktijk en theorie niet altijd volledig
overeen te komen. Echter, zelfs indien onder laboratorium-
omstandigheden oestrogene effecten eenduidig zijn, dan resteert de
vraag of ook in het natuurlijk milieu deze effecten optreden. Er kleven a
priori veel bezwaren aan extrapolatie van lab naar veld.

3. Waarnemingen van oestrogene werking van

stoffen
Het identificeren en karakteriseren van stoffen die werkzaam zijn als

'direct oestrogeen' kan op diverse manieren. Een aantal soorten
organismen kan experimenteel gebruikt worden in vivo - daarnaast
bestaan er diverse in vitro bioassays. Veel stoffen blijken oestrogene
activiteit te bezitten. Om echter gevoel te houden voor het belang van
xenobiotische stoffen in de hormonale homeostasis ten opzichte van
endogene sex-hormonen, wordt in bioassays meestal oestradiol als
referentiestof getoetst De hormonale werking van xeno-oestrogenen en
xeno-androgenen wordt zodoende uitgedrukt relatief ten opzichte van
oestradiol.
In het verleden is de oestrogene werking van stoffen vaak getest met

vogels. Ondanks de genetische verschillen tussen vogels en andere
diersoorten op het gebied van oestrogene/androgene regulatie, zijn
resultaten van vogelexperimenten altijd als representatief beschouwd
voor effecten bij andere diersoorten. In de meeste vogelexperimenten is
de ontwikkeling van het oviductgewicht gebruikt als parameter die
oestrogene activiteit weergeeft (Eroschenko and Palmiter, 1980).
Andere in vivo oestrogeniteitstesten zijn vaak uitgevoerd met
knaagdieren, waarbij juveniele vrouwtjes werden gebruikt, danwei
vrouwtjes waarvan het ovarium is verwijderd. In het artikel van Gaiey et
al., 1993 {en ook in Bulgar en Kupfer, 1983) worden voor- en nadelen
besproken van onderzoek waarbij meestal het uterusgewicht van de
testdieren werd gebruikt als oestrogeen-indicator.
Vissen zijn de derde diersoort die vaak worden gebruikt voor In vivo
oestrogeniteitstesten. Hierbij wordt meestal gekeken naar de productie
van een eiwit dat door vrouwtjes vissen wordt geproduceerd. Dit eiwit,
vitellogenine, wordt in de vissenlever aangemaakt onder invloed van
oestrogenen. Dit gebeurt in individuele cellen, waardoor ook in
hepatocyten van een vissenlever viteliogenese plaatsvindt. Er bestaan
dan ook diverse toetsen die gebruik maken van hepatocyten (Pelissero
et al., 1993). In vrouwtjes vissen treedt viteliogenese normaliter op als
voorfase van de oöcytose, het vitellogenine dient onder meer als
voedingsbron voor de ontwikkelende oöcyten. Het versterkt optreden
van viteliogenese bij vrouwtjes, danwei het optreden van dit fenomeen
bij mannetjes, is een sterke indicator voor de aanwezigheid van niet-
endogene oestrogene stoffen.
In de laatste jaren heeft het gebruik van in vitro oestrogeniteits-
bioassays enorm aan belang gewonnen. Momenteel worden er toetsen
ontwikkeld die een snelle en betrouwbare indicatie geven van de sterkte
van de oestrogene werking van stoffen ten opzichte van oestradiol. Veel
testen zijn gebaseerd op de meting van de bindingsaffiniteit van stoffen
aan de oestrogeenreceptor (ER). Klassiek is het gebruik van ER
verdringingsexperimenten. Hierbij wordt getest in welke mate een
teststof oestradiol van de ER kan verdringen. De meetlat voor de
oestrogene activiteit van de teststof is de overmaat waarin de teststof
moet worden toegediend aan de ER om 50% van oestradiol te
verdringen dat vooraf aan de ER is gebonden.
Populairder is momenteel het gebruik van hepatocyten en andere cellen
die een respons geven na de toediening van oestradiol, zoals diverse

soorten kankercellen. Proliferatie van cellen van bijvoorbeeld

endometriumkanker en borstkanker staat voor een belangrijk deel onder
oestrogene controle. Proliferatie van gekweekte cellijnen treedt dan ook
alleen op onder laboratoriumcondities indien oestradiol of een andere
oestrogene stof wordt toegediend. Veel van de belangrijkste studies
naar de activiteit van xeno-oestrogenen zijn gebaseerd op deze
testmethode (Soto et al., 1992, Welshons et a!., 1990, Markiewicz et al.,
1993, Korach, 1993). Hierbij is met name de MCF-7 cellijn (een onder
oestrogene controle staande cel geïsoleerd uit een soort borstkanker)
veel gebruikt - deze toets staat inmiddels bekend als de E-Screen.
Zoals reeds eerder aangegeven kunnen hepatocyten of primaire
levercellen van vissen worden gebruikt voor In vitro bioassays waarin
vitellogenese wordt bepaald. In dergelijke studies wordt behalve binding
aan de ER, de synthese van een bepaald eiwit bepaald.
In recente bioassay toetsontwikkeling wordt eveneens gebruik gemaakt
van de synthese van specieke eiwitten - nu echter nadat bepaalde cellen
met biotechnologische technieken gemodificeerd zijn. In het DNA van
de cellen wordt een extra stukje ingebracht. Dit extra stuk DNA bevat
de genetische code voor de transcriptie van een specifiek eiwit.
In opdracht van het RIKZ wordt door de Vakgroep Toxicologie van de
Landbouwuniversiteit Wageningen momenteel getracht DNA van het
eiwit luciferase in te bouwen in hepatocyten (transfectie). Hiermee moet
het mogelijk worden met gemodificeerde cellen op zeer eenvoudige
wijze oestrogene activiteit van stoffen te screenen. De bioassay (ookwel
CALUX-ER assay genoemd) is gebaseerd op de binding van oestrogeen
aan de ER, transport van het gevormde complex naar de celkern. Na
binding aan het DNA treedt transcriptie op van het Suciferase DNA
waarna het eiwit luciferase wordt gevormd. Cellen waarin dit eiwit is
gevormd, zijn in staat licht uit te zenden na stimulatie door luciferine en
ATP. De sterkte van het uitgezonden licht is een maat voorde sterkte
van activiteit van de oestrogene stof. Voorlopige resultaten van dit
onderzoek zijn veelbelovend (Legler, 1995). Experimenten met luciferase
gemodi-ficeerde MCF-7 borstkankercellen waarin DNA van de Aryl
Hydrocarbon (Ah) receptor was ingebouwd hebben reeds een zeer goed
resultaat opgeleverd (Murk et a l , 1996). Op basis van dezelfde
transfectiemethodiek zijn in andere laboratoria ontwikkelingen gaande
met andere eiwitten dan de in Wageningen gebruikte luciferase.
In Groot-Brittannië wordt tegenwoordig veel gebruik gemaakt van een
screen in gstest die gebaseerd is op transcriptie van de humane
oestrogeen receptor ingebouwd in de kern van gistcellen (Klein et al.,
1994; Routledge en Sumpter, 1996). Als reporter gen wordt het Lac-Z
gebruikt dat codeert voor p-galactosidase. Dit laatste wordt gebruikt om
de activiteit van de receptor te meten. Deze zogenoemde 'Yeast-Assay'
is ook geschikt voor het screenen van anti-oestrogenen. De test is
ontwikkeld door Glaxo (UK) en is niet commercieel beschikbaar.

4. Inventarisatie van xeno-oestrogenen
4.1 .Schadelijke xeno-oestrogene werking van therapeutische stoffen
4.1.1 DES en andere stilbenen

Dat niet-steroïden werkzaam kunnen zijn als oestrogeen is al vele
decennia bekend. Uit de arbeidstoxicologie is sedert het begin van de
twintigste eeuw bekend dat in bepaalde soorten chemische fabrieken
hoge prevalenties van vruchtbaarheidsstoornissen voorkwamen. Met
name bij de industriële productie van stilbenen, en gechloreerde
koolwaterstoffen zijn rapportages hierover bekend, De werking van
deze stoffen is echter lang onopgehelderd gebleven.
De aandacht voor xeno-oestrogenen is in een belangrijke
stroomversnelling geraakt nadat duidelijk werd dat een specifiek
stilbeen, het diethylstilbestrol (DES), sterk negatieve bijwerking had bij
toediening aan vrouwen - met name om spontane abortus tegen te
gaan (McLachlan en Dixon, 1976). Bij de dochters van vrouwen aan wie
DES was toegediend traden hoge prevalenties op van kanker in de
geslachtsorganen en borstkanker in de post-puberale fase. Daarnaast
kwamen bij jongens en meisjes van DES-moeders duidelijke
morfologische afwijkingen voor aan de geslachtsorganen met een
ongewoon hoge prevalentie. Verder zijn specifiek bij jongens frequent
psychologische afwijkingen gerapporteerd, mogelijk samenhangend met
verlaagde testosteron productie. De kwestie van de DES-dochters heeft
in Nederland, evenals in vele andere landen, veel publiciteit gehad.
DES werd in de humane farmacologie vooral gebruikt in de jaren '50 tot
'70. Negatieve effecten bij mensen werden in de begin jaren 70 voor het
eerst gerapporteerd. Al sedert het begin van de jaren 40 werd DES
gebruikt in de veterinaire farmacologie. De stof werd toegediend aan
pluimvee om de mannetjes te steriliseren en om de groei van schapen en
runderen te stimuleren. Later is duidelijk geworden dat de gebruikte
therapeutische doseringen in de veterinaire praktijk voldoende hoog
waren om significante residuen in hetconsumptievlees op te leveren -
residuen die hoog genoeg zijn om reproductie-effecten te veroorzaken
bij mensen (Newbold en McLachian, 1985).
Zowel in de humane studies als in de dierexperimenten is hoge
prevalentie van uterotrofie aangetoond, evenals inductie van enzymen
en eiwitten die onder oestrogene controle staan, zoals het progesteron
receptor-eiwit (McLachlan en Dixon, 1976; McLachlan, 1981).
Bovendien is herhaaldelijk sterke binding van DES aan de uterus-
oestrogeen-receptor gerapporteerd. Opmerkelijk is echter dat DES slecht
aan oestrogeen-bindende eiwitten in de bloedbaan lijkt te kunnen
hechten. Evenals bij mannen is ook bij proefdieren bij mannetjes een
negatief verband gevonden tussen DES-blootstelling en testosteron-
productie. Morfologische afwijkingen van epididermis en testis hangen
hiermee vaak samen. Voor zowel vrouwtjes als mannetjes knaagdieren
treedt een duidelijke verhoogde prevalentie op van kanker in de
geslachtsorganen en borsten (Bern et al„ 1985). Vertraagde
gesiachtsontwikkeling is waargenomen in muizen die In utero waren
blootgesteld aan DES; dit gold zowel voor mannetjes als vrouwtjes
(Newboid en McLachlan, 1985).
In de chemische industrie worden stilbenen zeer veel gebruikt, omdat

het de basisstructuur een grote variëteit van chemische reacties toestaat,

waarmee een zeer groot aantal soorten stoffen kan worden

geproduceerd. Met name is de basisstructuur geschikt om polymeren te
laten vormen - bij de vorming van poly-difenyl-ethyleen bijvoorbeeld
worden stilbenen gebruikt als uitgangsstof.
In de voorbij jaren is van tal van stilbeen-derivaten aangetoond dat er
enige oestrogene activiteit bestaat - met name zijn voor verschillende
stoffen ER bindingsstudies uitgevoerd. In het bijzonder is aandacht
besteed aan de groep van trifenyl-ethylenen, waarvan tamoxifen,
cloniphene en broparestroi de bekendste stoffen zijn. Met name van het
cis-tamoxifen is duidelijk geworden dat het sterke oestrogene werking
bezit; van de trans-isomeer is alleen anti-oestrogene activiteit
aangetoond. Opmerkelijk is dat in een studie van Jobling en Sumpter
(1993) tamoxifen niet actief bleek te zijn als inducer van vitellogenine bij
vissen (zie verder tabel 1 in paragraaf 4.2). Tamoxifen leek een duidelijk
anti-oestrogeen.
Bij stilbeenverbindingen is relatief veel onderzoek gedaan naar de
structuurkenmerken van isomeren die wel, of juist niet, oestrogeen zijn.
Hierbij is duidelijk geworden dat kleine structuurverschillen enorme
verschillen in oestrogene werking kunnen opleveren. Dit geldt zowel
voor sterische factoren, zoals verschillen tussen cis- en trans-isomeren,
als voor substituenten van de stilbenen.
4.1.2 Ethinyloestradiol en mestranol

Om het nakomelingschap van mensen en dieren te kunnen reguleren
worden diverse soorten middelen gebruikt die direct of indirect de
homeostase van geslachtshormonen beïnvloeden. In tal van studies zijn
de actieve componenten van 'de pil' bestudeerd met het oog op
mogelijk 'xeno-oestrogeniteit' die ook op andere dan de
doelorganismen invloed heeft. In de recent door het MAFF uitgevoerde
studie naar bronnen van oestrogene effecten in Brits oppervlaktewater
(Purdom et al., 1994; Sheanhan et al., 1994), is de hypothese dat het
synthetische hormoon ethinyloestradiol voor een deel verantwoordelijk
zou kunnen zijn, bevestigd (P. Matthiessen, MAFF, UK, pers. mede-
deting). Deze hypothese was geformuleerd op basis van eerder niet-
gepubliceerd onderzoek door het MAFF. Daaruit zou zijn gebleken dat
in slib van afvalwaterzuiveringsinstallaties de hydroxymetaboliet van
ethinyloestradiol geactiveerd kon worden tot een oestrogeen actieve
vorm. De hydroxymetaboliet is het uitscheidingsproduct als vrouwen de
anticonceptiepil gebruiken waarin ethinyloestradiol is toegepast. Deze
metaboliet is zelf niet oestrogeen, en bindt niet aan de ER. De in het slib
geactiveerde metaboliet zou wel ER binden en oestrogeen zijn. In het
meest recente onderzoek is een aanwijzing verkregen dat ethinyl-
oestradiol of metabolieten daarvan aanwezig waren In oppervlakte-
water.
Ethinyloestradiol is een zeer actief oestrogeen zoals werd aangetoond

door en Sheahan et al. (1994) en Nimrod en Benson (1995). In de
laatste studie bleek de affiniteit voor binding aan ratten-ER anderhalf
keer sterker voor ethinyloestradiol dan die van normaal 17JÏ-oestradiol.
Na interperatoneale injectie in meervallen bleek ethinyloestradiol ook
sterker oestrogeen dan oestradiol. De i.p. dosis om dezelfde vitellogene
respons te veroorzaken was 60% van die van oestradioi. Het eveneens
synthetische mestranol was even actief als ethinyloestradiol in vissen.
Van deze stof was reeds bekend dat het in zoogdierlever wordt omgezet
door ortho-demethylering tot ethinyloestradiol - dit lijkt in vissen dus
ook op te treden. Ook bij de bepaling van de hepatische-somatische-
index (HSI; een andere relatief ongevoelige maat voor oestrogene
werking in vivo vissen) leken ethinyloestradiol en mestranol sterker
oestrogeen dan oestradiol. Voor zowel de HSI als vitellogenese bleek de

oestrogene werking van mestranol en ethinyioestradiol die van

oestradiol te versterken bij gelijktijdige blootstelling. Onduidelijk is
echter of volledige addiviteit optrad. Bij een i.p, dosering van 0,66
mg/kg ethinyloestradiol werd vitellogenine aangetroffen in een
hoeveelheid die ongeveer 50.000 keer hoger was dan de
achtergrondswaarde in het vissenbloed. Voor mestranol werd ongeveer
hetzelfde gevonden. Voor oestradiol in ongeveer dezelfde blootstelling
(0,6 mg/kg) was de verhoging 25.000 keer de achtergrondswaarde (zie
verder hoofdstuk 5).
4.1.3 Andere therapeutische middelen

Tolbutamide, fenolftalëine en fenolftalol zijn therapeutische stoffen
waarvan in het begin van de jaren zeventig is beschreven dat zij een
uterotrope werking kunnen hebben bij hoge dosering (Calhoun et al.,
1971). Deze stoffen lijken echter zeer zwak te werken op dit gebied.
Momenteel worden fenolfthalëine en fenolftalol nog gebruikt als
commerciële laxeermiddelen. De chemische structuur van deze twee
stoffen toont overeenkomsten met trlfenyltin en in beperkte mate DDT
(zonder chloor, maar met hydroxy-groepen para gesubstitueerd). Het is
in deze zin niet verbazingwekkend dat er enige oestrogene werking
mogelijk zou kunnen zijn, gegeven de mogelijke binding aan de ER.
Tolbutamide wordt gebruikt als hypoglaecemisch middel, de chemische
structuur wijkt aanmerkelijk af van die van andere bekendere
oestrogene stoffen.
4.2, Alkylfenoi en alkylfenolethoxylaten
Aikylfenolethoxylaten (APE's) zijn oppervlakte actieve stoffen die op

grote schaal in de industrie en huishoudens worden gebruikt In
rioolwaterzuiveringsinrichtingen en het milieu worden ze afgebroken tot
alkylfenolen. Informatie over milieuchemische en toxicologische
eigenschappen staat vermeld in bijlage 2. Terwijl de wetenschappelijke
en politieke belangstelling voor de oestrogene werking van alkyfenolen
pas sinds het begin van de jaren '90 sterk is opgeleefd, was reeds sinds
1978 bekend dat alkylfenolen kunnen binden aan de oestrogeen-
receptor (Muller en Kim, 1978). Diverse soorten alkylfenolen bleken in
staat oestradiol van de oestradiol-receptor te kunnen verdringen. Hierbij
werd duidelijk dat para-substitutie van de hydroxy-groep en de alkyl-
groep een belangrijke structuurvoorwaarde is voor binding. Bovendien
bleek de oestradiol-verdringing sterker te zijn indien de alkylfenoi
hydrofober is - dit laatste wordt in hoofdzaak bepaald door de lengte
van de alkylketen. De bindingssterkte van APE's voor de oestrogeen-
receptor was tussen de 30.000 en 100,000 keer minder dan die van
17p-oestradiol. In de studie van Muller en Kim (1978) is nonyl-fenol niet
getest. Geen effecten werden gevonden na blootstelling aan
4-ethoxyfenol en 4-(alfa-hydroxy-isopentyl) fenol. Dit laatste
ondersteunt de hypothese dat de koolstofketen hydrofoob moet zijn als
randvoorwaarde voor oestrogene werking.
Omdat een van de toepassingen van alkylfenolen het zaaddodend

middel is in pasta's en crèmes, is in de jaren '80 veel onderzoek over
effecten gepubliceerd bij langdurige directe blootstelling. In de meeste
gevallen betrof het hierbij onderzoek naar de effecten van ethyleen-
oxide derivaten - in het bijzonder van nonylfenol. Een samenvatting van
deze literatuur is weergegeven in bijlage 2. Dat bij in vivo blootstelling
van zoogdieren oestrogene effecten op kunnen treden ten gevolge van
para-alkylfenolen was reeds in 1938 aangetoond met 4-n-propylfenol
en 4-tert-pentylfenol (Dodds en Lawson, 1938). Zij stelden ovarie-

geëctomiseerde ratten (die zelf dus geen oestradiol produceren) bloot

aan 100 mg teststof en vonden verharding van de vaginawand, een
effect dat normaal door oestradiol wordt veroorzaakt. Geen effect werd
gevonden na blootstelling aan 2-n-pentylfenol. In 1994 is onderzoek
gepubliceerd waarin de directe invioed van p-NP op de vruchtbaarheid
van mannetjes ratten werd aangegeven. Apicale dosering van 2 ml per
kg olie op de huid van ratten waarin 25% calcium alkylfenaat aanwezig
is gedurende een periode van 4 weken, 5 dagen per week, resulteerde
in een daling van het testiculair gewicht van 70%, terwijl sperma-
productie volledig stopte. Een herstelperiode van 30 dagen leidde slechts
tot een herstel van vruchtbaarheid bij een gedeelte van de populatie
(Hewsome, 1994).
Uit in vitro onderzoek werd pas in 1991 uit twee onafhankelijk verrichte
studies duidelijk dat p-nonylfenol een belangrijke oestrogene werking
bezit. Ten eerste bleek deze stof zeer goed in staat proliferatie van
borstkankercellen (MCF-7) te bewerksteliigen (Soto et al., 1991).
Eveneens bleek inductie op te treden van progesteronreceptoren. Ten
slotte werd bevestiging van oestrogene werking ook in vivo gevonden
door de waarneming van celproliferatie in ovarium-geëctomiseerde
ratten. Proliferatie van MCF-7 kankercellen werd gevonden bij
bjootstellingsconcentraties rond de 1 micromolair (220 microgram/liter)
terwijl voor 17p-oestradiol vergelijkbare effecten worden gevonden bij
een concentratie van 30 picomolair (330.000 keer lager).
In een studie van Sheahan en Harries (1992) bleek na blootstelling aan
p-nonylfenol vitellogenese op te treden in mannetjes vissen. Kort daarna
werd deze waarneming bevestigd door experimenten met hepatocyten
van de regenboogforel. In experimenten van Jobling en Sumpter (1993)
bleken diverse soorten alkyfenolen en alkylfenolethoxylaten in staat
oestradiol geïnduceerde vitellogenese te imiteren. In deze laatste studie
zijn niet hele vissen, maar hepatocyten gebruikt van regenboogforellen
(Oncorhynchus mykiss). Terwijl 1,81 nanomolair de blootstellings-
concentratie van 17p-oestradiol was waarbij 50% van de maximale
vitellogenine productie optrad, was dit voor p-NP 16,15 micromolair
(1000 keer hoger). De resultaten van deze studie zijn weergegeven in
tabel 1.
In verder onderzoek door dezelfde onderzoeksgroep (White et al., 1994)
is een aantal cellijnen die o.estradiol-responsief zijn, getest. De cellijnen
waren afgeleid van ZR-75-1 en MCF-7 borstkankercellen,
Tabel 1 Stof Gemiddelde ED-50

Oestrogene potentie van alkyfenolen
en alkylfenolethoxylaten om 17p-oestradiol 1,81 nanomolair
vitellogenese In hepatocyten van
regenboogforel op te wekken 4-t-butylfenol 2,06 micromolair
uitgedrukt als concentratie waarbij
5 0 % van maximum productiviteit 4-t-octylfenol 2,16 micromolair
wordt bereikt (Sumpter en Jobllng, 4-nonylfenol 16,15 micromolair
1993)
NP2EO 17,27 micromolair
NP9EO 82,31 micromolair
NP1EC 15,25 micromolair
2-t-butylfenol niet actief

3-t-butylfenol niet actief
NP40EO niet actief
Tamoxifen niet actief al

als inducer vitellogenese, wel actief als
antagonist bij AI's en NPnEOs

regenboogforel-hepatocyten, kippenembryo-fibroblastert en muizen-

oestrogeenreceptoren. De blootstellingsconcentraties waarbij respons
werd waargenomen verschilden niet veel in de testen - voor p-NP
meestal tussen de 1 en 10 micromolair. In gevallen dat p-octylfenol
werd getest, bleek deze stof meestal potenter te zijn dan p-NP, meestal
een factor 10 verschil. In de gevallen dat gecarboxyleerde metaboiieten
werden getest, bleken ook deze metaboiieten iets potenter, ook ai
waren de verschillen klein. Naast p-NP bleek ook p-NP-1EO te binden
aan de oestrogeen receptor. Daarentegen bleek NP-2EO geen binding te
vertonen. Oestrogene activiteit van NP2EO wordt daarom
toegeschreven aan metaboiieten van deze stof.
4.3 Fyto- en myco-oestrogenen
Fyto- en myco-oestrogenen zijn de termen die worden gegeven aan

stoffen die door respectievelijk planten en schimmels worden
geproduceerd en oestrogene werking hebben bij gewervelde
organismen. Dat een aantal verschillende klassen van natuurlijk
geproduceerde stoffen oestrogenen werking hebben, is reeds lange tijd
bekend. Sterke invloed op de voortplanting van schapen en varkens is
reeds vele tientallen jaren geleden gedocumenteerd, waarbij werd
aangegeven dat afwijkingen aan de geslachtsorganen waarneembaar
waren.
Klaverziekte bij schapen (in het bijzonder ooien) die fyto-oestrogeen
rijke klaver consumeren, uit zich in veranderd sexueei gedrag, verharde
cervale mucus en epitheel en verminderde of zelfs afwezige
vruchtbaarheid (Adams, 1977,1990). Blaasvormige proliferatie van het
endometrium en (sterk) verminderde spermaproductie zijn
gerapporteerd voor rammen (Setchell et al., 1984; Hughes, 1988).
Verschillende klassen van fyto- en myco oestrogenen zijn

geïdentificeerd. De vier belangrijkste klassen zijn;
- isoflavonoiden zoals genistein, equol, daidzeine,
- biochanin A en structuurverwante stoffen.
- coumestranen, waarvan voornamelijk coumestro! bekend is.
- l/gnanen, waarvan met name enterotectonen bekend zijn.
Daarnaast is apigenine een bekend fyto-oestrogeen dat onder andere

voorkomt in de bladeren van marihuana planten (Sauer et ai., 1983).
Zearalanone is de meest bekende fyto-oestrogeen, en komt voor in
schimmelend voedsel en graan.
In sommige planten komen de uiteenlopende soorten fyto-oestrogenen
simultaan voor. Helaas is er tot op heden weinig onderzoek bekend
waaruit blijkt welke stofklassen voor bepaalde plantensoorten het meest
van belang zijn. Testen met intacte organismen, celproliferatie en
oestrogeen receptor bindingsstudies zijn meestal uitgevoerd met
complete extracten, waardoor er geen informatie is over de extract-
samenstelling. Klaver en alfalfa zijn eetbare plantensoorten voor dieren
waarin de hoogste concentraties fyto-oestrogenen voorkomen. Voor de
mens is de soja-plant de belangrijkste bron. Dit geldt evenzeer voor
sommige dieren in gevangenschap, zoals is aangetoond voor gevangen
cheetahs die een standaarddieet krijgen, waarin de concentratie fyto-
oestrogenen (50 mg/kg) voldoende hoog is om effecten te veroorzaken
(Setchelietal.,1987).
Extracten waarin fyto-oestrogenen aanwezig zijn, blijken volgens
Miksicek (1993) direct te binden de oestrogeen receptor, en blijken
tevens celproliferatie te kunnen veroorzaken. Verder blijkt naast directe
receptorbinding ook uterotrofie te kunnen optreden na toediening van
Xeno-oestrogene stoffen in het aquatlsche milieu 25

extracten van bieren Bourbon aan knaagdieren (Rosenblum et al.,

1993).
Voorequol is duidelijk aangetoond dat oestrogeenreceptor-binding
optreedt, dat inductie van de synthese van de progesteronreceptor
plaatsvindt, dat proliferatie van de MCF-7 cellijn wordt waargenomen,
en dat het in heel-organisme studies het uterus-gewicht van vrouwelijke
exemplaren van knaagdieren het gevolg is van blootstelling (Thompson
et al., 1984). Voor veel andere fyto-oestrogenen zijn de studies minder
systematisch verricht.
In tal van studies is wel aangetoond dat effecten kunnen optreden bij
blootstelling aan hoeveelheden die door normale consumptie kunnen
worden bereikt. Dit geldt onder meer voor het optreden van
vitellogenese bij de Siberische steur na blootstelling aan sojaboon
extracten (Pilessero et al., 1991). Whitten en Naftolin (1992a,b)
toonden bovendien aan dat een normaal dieet voor mensen in principe
voldoende coumestrol bevat om een lichaamsspiegel te ontwikkelen die
bij ratten leidt tot uterotrofie. Frederick en medewerkers (1981) vonden
in een muizenstudie dat verstoring van reproductie al op kon treden bij
diëten waarin 50 tot 150 microgram per kg rat werd gevoerd.
Sojabonen en alfalfa bevatten ongeveer 71 tot 600 microgram
coumestrol per gram; een dieet van één gram sojabonen per kilogram
muis geeft dus al een coumestrolbelasting die reproductie-effecten kan
veroorzaken. Vergelijkbare resultaten zijn verkregen door Whitten en
Naftolin (1992a) met ratten. Zij toonden bovendien aan dat effecten
nog geruime tijd kunnen aanhouden nadat blootstelling is beëindigd.
Behalve de verstorende oestrogene werking van sommige planten-

stoffen is er mogelijk tegelijkertijd een heilzame werking. Dit geldt niet
zozeer voor het reproductiesysteem, maar wel voor de rol die
oestrogenen spelen bij hormonaal gereguleerde vormen van kanker. Uit
epidemiologisch onderzoek is gebleken dat vrouwen die een hoge
dagelijkse inname hebben van bepaalde soorten fyto-oestrogenen
(voornamelijk uit sojabonen) vaak minder tumoren ontwikkelen dan
vrouwen die een lage inname hebben (Coward et al., 1993; Mousavi en
Adlercreutz, 1993). Dit, terwijl oestrogenen meestal tumorontwikkeling
bevorderen. Bij mannetjes ratten bleek dat een rijk soja-dieet sterke
vermindering gaf van de prevalentie van prostaatkanker (Sharma et al.,
1992).
Een mogelijke verklaring voor deze effecten is dat fyto-oestrogenen de
productie van het eiwit SHBG (Sex Hormone Binding Globulin)
stimuleren. Dit bloedeiwit bindt sexhormonen zoals testosteron,
dihydrotestosteron en oestradiol, waardoor de vrij beschikbare
bloedspiegel van deze hormonen wordt verlaagd. Uit laboratorium-
experimenten is gebleken, dat voor proliferatie van getransformeerde
cellen van hormonale kankers juist vrij beschikbare sexhormonen nodig
zijn. Het is niet duidelijk of fyto-oestrogeen geïnduceerde SH8G-
productie invloed heeft op vruchtbaarheid en voortplanting.
4.4 Chloorkoolwaterstoffen
4.4.1 Chloordecone en Mirex

Twee stoffen die een moleculaire structuur hebben die totaal niet op
oestradiol lijkt, maar die toch een oestrogene activiteit hebben zijn
chloordecone (Kepone) en Mirex. Beide stoffen zijn in de Verenigde
Staten gebruikt als pesticide tegen mieren.
Al in de jaren '60 is aangetoond dat orale toediening van kleine
hoeveelheden chloordecone aan kippenkuikens (Sherman en Ross,
1961) en kwartels (AAcFarland en Lacy, 1969) kan resulteren in vergrote
oviducten.

In 1979 hebben Hammond en medewerkers aangetoond dat

chloordecone sterke receptorbinding geeft in cel-vrije bioassays. In
E-Screen-testen is recent aangetoond (Soto et al., 1992) dat
chloordecone een sterke proliferatie geeft van MCF-7 cellen, hetgeen op
een sterke oestrogene werking duidt. Beide resultaten suggereren dat
binding van chloordecone optreedt, dit terwijl lange tijd is verondersteld
dat een metabolisering van het hoofdproduct zou moeten optreden. Dit
laatste zou nog steeds wel voor Mirex een voorwaarde kunnen zijn. Het
is zelfs goed mogeüjk dat de zwakke oestrogene werking van Mirex
wordt gereguleerd door de snelheid van metabolisme. Enzymatische of
fotochemische oxidatie van Mirex resulteert in de vorming van
moleculaire structuren die grote gelijkenis hebben met die van
chloordecone.
De oestrogene werking van chloordecone is niet alleen in celvrije
bioassays of in de E-Screen nader aangetoond. In diverse studies met
vogels en zoogdieren zijn vrijwel alle effecten waargenomen die door
xeno-oestrogene stoffen kunnen worden opgewekt (Eroschenko en
Palmiter, 1980; Reel en Lamb, 1985). Bij vogels worden behalve
toename van het oviductgewicht ook gestimuleerde dooiereiwitsynthese
waargenomen. Tevens wordt hierbij verminderde ei-productie
geconstateerd. Voor mannelijke vogelexemplaren wordt testikelatrofie
gerapporteerd, terwijl in muizen significante vermindering van de
spermatogenese optreedt. In volwassen vrouwtjesmuizen waarvan het
ovarium is verwijderd, blijft de vagina functioneel intact na toediening
van chloordecone (Uphouse et al., 1984). Toediening van de stof aan
zwangere muizen resulteert in intoxicatie van de foeten waardoor
misvormingen ontstaan die vergelijkbaar zijn met overdosering van
oestradiol (Eroschenko, 1981).
De affiniteit van chloordecone voor de oestrogeen-receptor is ongeveer
1000 tot 5000 keer lager dan die van oestradiol (Eroschenko en
Palmiter, 1980). Uit het onderzoek van Williams en medewerkers (1989)
is gebleken dat de affiniteit voor binding aan oestrogeenreceptoren uit
de hersenen gelijk is aan die van receptoren uit de uterus. Wel werd
echter duidelijk dat de translocatie van het chioordecone-receptor
complex van het cytoplasma naar de kern beter verliep in cellen uit de
uterus dan in die uit de hersenen. In dit kader is het van belang dat in
onderzoek van Johnson en medewerkers (1992) is gebleken dat de
relatie tussen bindingsaffiniteit en in vivo activiteit niet altijd eenduidig
is. De bindingsaffiniteit van chloordecone is lager dan die van o,p'-DDT
terwijl de in vivo oestrogene werking juist sterker is.
Bij mensen is gebleken dat verhoogde blootstelling aan chloordecone
kan resulteren in een afname van de spermaproductie (Guzelian, 1982).
4.4.2 DDT en derivaten

Dichloordifenyltrichloorethaan (beter bekend als DDT) is in vele landen
langdurig gebruikt als insecticide. In industriële producten is p,p'-DDT
de hoofdcomponent en komt o,p'-DDT als tweede component voor (10
- 30%). Dit taaiste product blijkt de sterkst oestrogene activiteit te
bezitten in een aantal testen (Welch et al., 1969; Bitman et al., 1968;
Bulgar en Kupfer, 1983). Dit is onder meer aangetoond voor de
uterotrope werking van DDT-analogen bij ratten. Ook op
receptorniveau is dit gebleken, onder meer uit verdringingsexperimenten
met tritium gelabeld oestradiol en in experimenten met de E-Screen
(Soto et al., 1992). Voorafgaand aan de E-Screen testresultaten was al
eerder gebleken dat o,p'-DDT oestrogene activiteit bezit voor humane
tumorcellen uit uterus- en borstkankercelien (Mason en Schulte, 1980).
In receptor bioassays is verder gebleken dat ook o,p'-DDT metabolieten
(o,p'-DDE en o,p'-DDD en de hydroxy-metabolieten van o,p'-DDT)
oestrogene activiteit hebben. De bindingssterkte van orpr-DDT aan de

oestrogeenreceptor is ongeveer 2000 keer lager dan die van oestradiol

(Robinsoneta!., 1985).
Naast de werking van o,p'-DDT op het endocriene systeem zijn ook
gedragsafwijkingen aangetoond bij organismen na blootstelling aan
DDT analogen. Langdurige blootstelling aan DDT aan ovarium-
geëctomiseerde ratten resulteerde in vrouwelijk sexuele
gedragspatronen. Dit naast dat de gebruikelijke compenserende
hypertrofie van de uterus (zoals optreedt in niet blootgestelde
testdieren) werd geblokkeerd en de toename van het lichaamsgewicht
verminderde.
Geheel of gedeeltelijke geslachtsomkering na blootstelling aan DDT is bij
enkele andere soorten gewervelden waargenomen. Bij mosquito-vis
mannetjes trad vitellogenine productie op na blootstelling (Denison et
al.r 1981). In vogels (kwartel) is een breed scaia van oestrogene effecten
waargenomen. Hierbij gaat het onder meer om oviductgewichts-
toename en ontwikkeling. Daarnaast bleek bij toediening van DDT aan
eieren van kwartels, dat daarna uitgegroeide volwassen vrouwtjes een
veel lager broedsucces hadden. Bij meeuwen bleek na blootstelling in
eieren, dat feminisatie optrad van de uitgekomen mannelijke
exemplaren. Hierbij ontwikkelde de rechterkant van het oviduct zich tot
het vrouwelijk oviduct. In normale vrouwtjes ontwikkelt de linkerkant
zich bij vogels, terwijl bij normale mannetjes de rechterkant zich
ontwikkelt tot het mannelijk oviduct (Fry en Toone, 1981). Blootstelling
van vogels aan o,p'-DDT leverde in alle gevallen effecten op die
eveneens optraden na verhoogde oestradiol toediening.
Omdat sommige oestrogene stoffen redelijk effectief zijn als middel
tegen de proliferatie van hormonaal gereguleerde tumoren, zijn enkele
DDT-derivaten hierop getest. Voor o,p'-DDD is gerapporteerd dat het
gebruik, onder meer als middel tegen adrenocorticale tumor-
ontwikkeling, resulteerde in impotentie van de patiënten (Sparagana,
1987).
4.4.3 Methoxychloor
Methoxychloor is een pesticide dat veel is gebruikt nadat DDT aan
banden werd gelegd. De moleculaire structuur van deze stof toont grote
overeenkomst met die van DDT, en ook de toxicologische werking toont
veel gelijkenis (Cummings en Gray, 1987). Dat desondanks deze stof
wordt gebruikt is te danken aan de geringere persistentie en de lagere
acute orale toxiciteit voor bij ratten ( LD50 > 6000 mg/kg).
Niet methoxychloor zelf, maar de gedemethyleerde metaboiiet bindt
aan oestrogeen receptor (Kupfer en Bulgar, 1980). De monofenolische
metaboiiet bindt ongeveer 300 keer minder sterk dan oestradiol. De
difenolische metaboiiet heeft een bindingsaffiniteit die 100 keer minder
sterk is dan die van oestradiol (Ousterhout et al., 1981).
In muizenstudies vertoonden vrouwtjes toename van het gewicht van
het reproductiesysteem, verharding van de vagina en voortijdige
vaginale opening indien zij binnen 10 dagen na geboorte waren
geïnjecteerd met methoxychloor (Eroschenko en Cooke, 1990). Onder
identieke blootstellingscondities vertoonden mannetjes muizen
verminderde groei van de geslachtsorganen, alsmede een verlaagd
testosteron niveau in het bloed (Eroschenko en Cooke, 1990). Al deze
effecten komen overeen met die welke optreden tijdens neonatale
oestradiol toediening.
Behalve de oestrogene effecten bij neonatale blootstelling, is aange-
toond dat prenatale blootstelling van knaagdieren aan methoxychloor
resulteert in een vermindert reproductiesucces. Waarschijnlijk is dit een
gevolg van verlaagde implantatiesucces (Cummings en Perrault, 1990).

4.4.4 Polychloorbifenylen
Reeds in 1974 toonde Nelson aan dat er een correlatie bestaat tussen
binding van Aroclor 1254 en 1221 (belde industriële mengsels van
polychloorbifenylen - PCB's) aan de oestrogeenreceptor en de mogelijke
veroorzaker van uterotrofie in knaagdieren. Pas aan het eind van de
jaren '80 werd aangetoond dat met name een aantal metabolieten van
enkele PCB's grote affiniteit hebben voor de oestrogeenreceptor (Korach
et al., 1988). Het is inmiddels aannemelijk geworden dat uterotrofie
meer samenhangt met de aanwezigheid van PCB-hydroxymetabolieten
dan met de niet-gemetaboliseerde PCB's. In 1978 toonde Gellert aan
dat PCB's persistente vaginale oestrus kunnen stimuleren; dit syndroom
kan leiden tot vroegtijdige onvruchtbaarheid. Voor bepaalde soorten
zeezoogdieren, zoals de zeehond, zijn er voldoende aanwijzingen dat
ontwlkkelings- en hormonale stoornissen zijn gerelateerd aan het
voorkomen van hoge gehalten aan onder meer PCB's (Reijnders en
Brasseur, 1992).
Ten slotte is het belangrijk te vermelden dat de PCB's die significante
oestrogene activiteit (4-hydroxylatie producten van PCB congeneren)
vertonen, nauwelijks voor blijken te komen in technische mengsels.
Hoewel het eventuele risico van oestrogene activiteit van PCB's in het
milieu hierdoor op het eerste gezicht aanzienlijk zou verminderen
(Hamilton, 1995), staat hier tegenover dat 4-hydroxy metabolieten van
PCB's door chloorshifts in dieren kunnen ontstaan. Bergman et al.
(1994) hebben aangetoond dat de hoger gechloreerde PCB's in bloed
van zeehonden en mensen weliswaar langzaam worden gevormd, maar
zeer stabiel en lang aanwezig blijven.
4.4.5 Beta-hexachloorcyclohexaan
Beta-hexachloorcyclohexaan is een belangrijk bijproduct in industrieel
gamma-hexachloorcyclohexaan (lindaan) dat veel werd en wordt
toegepast als pesticide. De neurotoxische werking van dit pesticide
wordt veroorzaakt door de gamma-cyclohexaan isomeer. In milieu-
monster wordt echter vaak de beta-isomeer aangetoond, onder meer in
humaan voedsel en menselijk weefsel. In ratten is aangetoond dat de
bèta-isomeer-afname van hettestis/ovarium gewicht teweeg kan
brengen, bovendien is een toename in het gewicht van hypophyse en
bijnieren aangetoond (Van Velsen et al., 1986). Ook in de humane
borstkankercellijn MCF7 (E-Screen) blijkt beta-HCH oestrogene activiteit
te bezitten (Coosen en Van Velsen, 1989). Opmerkelijk is wel dat beta-
HCH zelf vrijwel niet bindt aan de oestrogeenreceptor. Deze
onduidelijkheid is nog niet opgehelderd.
Beta-HCH blootstelling leidde bij vissen (Japanse Medaka's) tot
hermafrodisme (Wester en Canton, 1986), en bij jonge guppen tot de
inductie van vitellogenese en afwijkende gonaden (Wester et al., 1985).
Inductie van vitellogenese bij vissen in open oppervlaktewater is
waargenomen in gebieden waar intensief gebruik is gemaakt van
lindaan, echter zonder dat lindaan-bepalingen zijn verricht in water,
sediment of organismen (Purdom et al., 1994).
Gamma-HCH lijkt minder oestrogene activiteit te bezitten dan de beta-
isomeer. Toch is bij meervallen afwijking van steroidogenese, sex-
hormoon niveaus in het bloed en lipiden niveaus gerapporteerd (Singh
en Singh, 1991).
Sterk verminderd implantatiesucces en maJformatie van foetussen is
gerapporteerd na blootstelling van lindaan bij muizen (Sircar en Lahiri,
1989). Deze effecten bleken te interfereren met die van oestradiol en
progesteron.

4.5 Overige stoffen
4.5.1 Dibenz(ah)anthraceen metabolieten

Polycyclische aromatische koolwaterstoffen komen langs verschillende
wegen in het milieu vrij. Meestal gaat het hierbij om PAK's die
onbedoeld worden geproduceerd, bijvoorbeeld tijdens
verbrandingsprocessen. Een van de meest voorkomende PAK's is het
benz(ah)anthraceen. Evenals veel andere PAK's met 5 of minder
aromatische ringen wordt deze stof snel gebiotransformeerd - de
gevormde metabolieten zijn meestal mono- of dihydroxyderivaten. In
experimenten met humane borstkankercellen bleek benz(a)anthraceen
proliferatie te bevorderen, hetgeen op oestrogene werking duidde
(Schneider et al., 1976). Uit bindingsstudies met de oestrogeen receptor
bleek dat het benz(a)anthraceen niet te binden is. Een metaboliet van
deze PAK, het 3,9 dihydroxy-dibenz(ah)anthraceen bleek echter wel te
binden aan de receptor. Bovendien bleek deze stof een uterotrofe
werking te hebben bij ratten - de sterkte van deze werking was
ongeveer drie keer zo zwak als die van oestradiol.
4.5.2 Organosiloxanen
Siloxane vloeistoffen worden de laatste decennia met voortdurend
toenemende toepassing geproduceerd en gebruikt. In rattenstudies is
gebleken dat deze stoffen uterotroof kunnen zijn. Bovendien kunnen zij
proliferatie van het endometrium bevorderen - twee redenen waarom
deze stoffen soms oestrogeen worden genoemd (LeFevre et al., 1972).
Omdat zij echter constante meto-oestrus veroorzaken, en niet zoals
oestradiol constante oestrus, zouden zij ook anti-oestrogeen kunnen
werken.
Helaas is er weinig bekend over de mogelijke oestrogene activiteit van
siloxaan vloeistoffen. Slechts van het cis-2,6,-difenylhexamethyl-
cyclotetrasiloxaan is bekend dat het redelijk goed bindt aan de
oestrogeen receptor (Katzenellenbogen et al., 1980).
4.5.3 Diversen
De lijst met stoffen die kunnen binden aan de oestrogeenreceptor
wordt voortdurend langer (Colborn et al., 1993; Colborn, pers.
mededeling), evenals die van stoffen die vitellogenese kunnen
opwekken. De vraag die daarom steeds moet worden beantwoord als
nieuwe risico-stoffen worden gesuggereerd, is die omtrent de relevantie
ten behoeve van in vivo situaties. Resultaten van bindingsstudies en
andere bioassays moeten in perspectief worden beschouwd.
In recent onderzoek is vastgesteld dat ook de pesticiden endosulfan,
toxafeen en dieldrin een met DDT en chloordecone vergelijkbare
oestrogene activiteit vertonen in de E-Screen-test met de MCF-7
borstkankercellijn (Sotoetal., 1994).
Verder hebben zeer recent Jobling et al. (1995) nieuwe risicostoffen
toegevoegd aan de reeds bestaande lijst xeno-oestrogenen. In
afvalwater hebben zij 20 hoofdcomponenten aangetoond en die
individueel getest op potentiële oestrogeniteit. In ER bindingsstudies
vonden zij geen verdringing van getritieerd oestradiol na toevoeging van
p-t-butylbenzoezuur, caféine, cholesterol, p-cresol, tolueen-butylether,
3,4-dimethylfenoi, p-hydroxybenzoezuur, 2-methyifenol, muskus-
xyleen, muskus-keton, en tolueen.
Van de 20 onderzochte stoffen bleken 9 andere wel in staat oestradiol
van de ER uit regenboogforel te verdringen, zij het in zeer beperkte
mate. Op basis van deze verdringingsexperimenten was natuurlijk nog
niet te zeggen welke stoffen oestrogeen danwei anti-oestrogeen zouden
kunnen werken. Daarom zijn de 9 stoffen verder getest met twee
humane cellijnen: ZR-75 cellen en MCF-7 (E-Screen). Uit deze testen is

verder niet gebleken dat benzofenon, n-butylbenzeen, 2,4-dichloor-

fenol, bis-(2-ethylhexyl)adipaat, 4-nitrobenzeen en bis-(2-ethylhexyl)
ftalaat in de humane cellijnen oestrogene activiteit bezaten. Dit werd
wel gevonden voor gebutyleerd hydroxyanisol (BHA) en twee
ftaalzuuresters - het butyl-benzyl-ftalaat (BBP) en di-n-butylftalaat
(DBP).
Uit de resultaten bleek BHA meer dan een miljoen keer minder te binden
aan ER dan oestradiol. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in de
borstkankercellijnen-experimenten. Aangezien BHA wel in afvalwater
voorkwam moet deze stof dus serieus worden genomen als mogelijk
xeno-oestrogeen. Echter gezien de potentie is het niet meer dan een
zeer zwak xeno-oestrogeen. Bovendien lijkt bioaccumulatie van deze
stof niet voor de hand te liggen, waardoor de concentraties in
organismen in ordes van grootte minder zullen zijn dan dfe van
endogeen oestradiol.
Belangrijker lijken de resultaten van twee ftaalzuuresters, BBP en DBP.
Deze stoffen worden zeer veel gebruikt in een breed scala van
toepassingen en worden op grote schaal in het milieu aangetroffen.
Bovendien kunnen zij in bepaalde mate bioaccumuleren in organismen
waardoor de problematiek vergelijkbaar dreigt te zijn met die van
alkylfenolen (zie ook hoofdstuk 5 en 6). De activiteit van de twee
stoffen in de testen was ongeveer 100.000 tot 10.000.000 keer minder
dan die van oestradiol - dit geeft aan dat het om zeer zwakke
oestrogene activiteiten gaat. De activiteiten van de twee ftaaizuuresters
(werkingsconcentraties in de range van 10 tot 100 micromolair) Is
aanmerkelijk minder dan die van octylfenol onder dezelfde
testomstandigheden (minder dan een micromolair).
Het feit echter dat van BBP en DBP, evenals van andere ftaalzuurresters,
bekend is dat zij in redelijk hoge concentraties kunnen voorkomen in
organismen, en bioaccumulerende stoffen zijn, zorgt ervoor dat deze
stoffen heel serieus genomen moeten worden als xeno-oestrogeen. De
concentraties van deze stoffen in organismen in het milieu zou
verschillende orde van grootte hoger kunnen zijn dan die van endogeen
oestradiol (zie verder hoofdstuk 5).
Al enige tijd wordt door MAFF gezinspeeld op de aanwezigheid van
andere oestrogeen-actieve stoffen in het afvalwater van
zuiveringsinstallaties waarvan de concentraties van alkylfenolen relatief
laag zijn. Met behulp van de 'Yeast-Assay' is een aantal oestrogene 'hot
fractions' geïdentificeerd in de wateroplosbare fractie van effluenten.
Door verdere fractionering en analytisch onderzoek heeft men de
verantwoordelijke stoffen kunnen identificeren. Zeer recent is bekend
geworden dat de geïdentificeerde stoffen natuurlijke oestrogenen (m.n.
17{i-oestradiol en oestron) en synthetische oestrogenen
(ethinytoestradiol) zijn (P. Matthiessen, MAFF, UK, pers. med.).
Conjugaten van deze hormonen blijken te kunnen worden gereactiveerd
(gedeglucuroniseerd) door o.a. micro-organismen zoals E. coli.
Van een breed scala van gehalogeneerde aromatische koolwaterstoffen
is bekend dat zij aan de ER kunnen binden. In de meeste gevallen gaat
het hierbij echter om stoffen die anti-oestrogeen zullen werken, zoals is
aangegeven door Safe et al. (1991).
Een stofklasse die sterke structuurverwantschap vertoont met DDT,

gehydroxyleerde PCB's en met alkyfenolen, is het bisfenol-A: dimethyl-
di-(p-hydroxyfeny!)-methaan. Deze stof wordt evenals alkylfenolen vaak
aan plastics (met name poiycarbonaat) toegevoegd. In 1993 werd door
Krishnan et al. aangetoond dat deze stof aan de ER kan binden. In 1995
is door Brotons et al. (1995) aangetoond, dat bisfenol-A ook in E-Screen
btoassays oestrogeniteit vertoont. Verder gaven de laatste onderzoekers
aan, dat in water dat in contact is geweest met poiycarbonaat

verpakkingsmateriaal bisfenol-A in belangrijke mate aantoonbaar is;

concentraties die in E-Screen oestrogene activiteit veroorzaken.

5. Xeno-oestrogenen: welke zijn belangrijk?
5.1 Structuur-activiteitsrelaties
Op het eerste gezicht zijn er vele soorten xeno-oestrogene stoffen;

stoffen waarvan de moleculaire structuren sterk verschillen. Studies naar
mogelijke structurele overeenkomsten hebben echter een aantal
belangrijke inzichten opgeleverd in welke factoren bijdragen aan
mogelijke oestrogene werking.
Een veel voorkomend structuurkenmerk is de para-hydroxy-substitutie
van aromatische koolwaterstoffen (Jordan et al., 1985). Bovendien
blijken verbindingen die meer para-fenol-fragmenten hebben sterker
oestrogeen, zoals onder meer wordt gevonden bij methoxychloor en
difenolische isoflanonoiden.
DDT en chioordecone hebben geen fenolische basis-structuur. Zoals
echter door Tas (1993) is aangegeven hebben zij wel enige
structuurgelijkenis op basis van de geometrische verdeling tussen polaire
en hydrofobe eigenschappen. Het chloor gesubstitueerde alifatische
koolstofatoom van DDT heeft een polair karakter, en is geometrisch
gelegen tegenover de hydrofobe fenylringen - dezelfde verdeling die is
terug te vinden bij alkylfenolen. Voor chioordecone en Mirex
metabolieten fungeert de epoxy-brug als polair centrum. Dezelfde
kenmerken zijn ook voor organotinverbindingen als karakteristiek
aangemerkt. Het is dan ook niet verbazingwekkend dat voor tributyltin
oestrogene activiteit is gemeld in studies met vissen. Voor stofklassen als
Ugilec en difenylethers is de basisstructuur vergelijkbaar; oestrogeniteit
of anti-oestrogene werking mag derhalve worden verwacht voor deze
stofklassen.
De fenolische ring, of de structuur-equivalent daarvan, is de groep die
waarschijnlijk in de binding-pocket van de oestrogeen receptor past. De
rest van het molecuul bepaalt waarschijnlijk in welke mate de stof werkt
als agonist of antagonist, afhankelijk van de mogelijkheden of geschikte
conformatieverandering tot stand is te brengen op het niveau van de
receptor (Duax en Griffin, 1987). Hoewel veel op dit gebied nog
onopgehelderd is, is wel duidelijk dat sterische rigiditeit van xeno-
oestrogene stof van belang is om goed aan de receptor te kunnen
binden. McKinney en Waller (1994) proberen de steroidewerking van
enkele specifieke PCB's te verklaren. Met name gaat het hierbij om de
oestrogene werking van para-hydroxy gesubstitueerde PCB's die
allemaal een ortho-chloorsubstitutie hebben. Van óeze ortho-
chloorsubstitutie is bekend dat het vrije ring rotatie sterk hindert,
waardoor deze PCB-congeneren een rigide structuur krijgen (Korach et
al., 1988).
Het concept van structuur-rigiditeit kan helpen verklaren waarom o,p'-
DDT wel, en p,p'-DDT vrijwel niet oestrogeen is (Kupfer en Buigar,
1980; Galand et al., 1987). De p,p' isomeer heeft veel meer rotatie-
vrijheid voor de chloorfenylringen dan de o,p' isomeer.
Muller en Kim (1978) toonden aan dat zuurstof in de alkylketen (als

ethoxy-verbinding of als aicohol) de binding met de oestrogeen receptor
sterk vermindert. Bovendien leek er sterkere binding op te treden bij
langere ketens. Dit iaatste is eveneens aangetoond door Soto en
medewerkers (1992). Bovendien bleek in de laatste studie dat
vertakking van de alkylketen resulteerde in sterkere binding.

5.2 Relatieve potentie van xeno-oestrogene stoffen
In tal van in vivo en in vitro testen is een scala van xeno-oestrogene

stoffen getest en onderling vergeleken. In vrijwel alle studies kan de
potentie van xeno-oestrogenen stoffen worden uitgedrukt als de
potentie ten opzichte van 17fi-oestradio!. De potentie wordt,
opmerkelijk genoeg, meestal uitgedrukt als de factor waarmee de
blootstelling verhoogd moet worden ten opzichte van oestradiol om
hetzelfde oestrogene effect te bewerkstelligen in de test. Een hoge
factor hoort dus bij een stof die slechts een zwakke oestrogene werking
heeft. 17Bèta-oestradiol heeft per definitie een factor 1,0. Als voorbeeld:
in de E-Screen test met de MCF-7 borstkankercellijn had Soto et al.
(1991) een concentratie van 10 micromolair nonylfenol nodig om
hetzelfde effect te krijgen als 30 picomolair oestradiol (de proliferatie tot
ongeveer 720.000 cellen per ml in 6 dagen). De potentie is in dit geval
dus 330.000 voor nonylfenol. In tabel 2 zijn de resultaten weergeven
van drie studies met de E-Screen bioassay.
Ondanks dat de resultaten zijn verkregen met een goed gedefinieerde
test blijken studies verschillen op te leveren. Coumestro! blijkt in de
studie van Mayr et al. (1992) 3500 minder oestrogeen te zijn dan 17(3-
oestradiol, in de studie van Whelsons et al. (1990) 900 keer minder,
Tabel 2 Stof potentie 1 potentie 2 potentie 3 potentie 4 potentie 5/6

Oestrogene potentie in ER bindings
assay. Potentie uitgedrukt als 17p-oestradiol 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
overmaat blootstelling om binding DES 0,4
te krijgen die gelijk is aan 17p- coumestrol 1.000
oestradiol. genistein 400
daidzeine 6.500
biochanin-A 65.000
equol 1.000
methoxychloor n.ü n.d.
monofenol methoxycti loor 300
bisfenolmethoxychloor 100
o,p'-DDT 1.000 n.d.
p,p'-DDT n.d.
chloordecone 12.000* 5.000(5)
1.000(6)
potentie 1 met ER uit uterus muizen (Rosenblum et al. 1993)

potentie 2 met ER uterus ratten (Pelllsero et al. 1991)
potentie 3 met ER uit uterus ratten (Nelson 1974 en Ousterhout, 1981)
potentie 4 met ER uit 'spotted seatrout' lever (Thomas en Smith, 1993)
potentie 5 met ER uit kippen (Eroschenko en Palmiter, 1980)
potentie 6 met ER uit uterus en hersenen ratten (Williams et al. 1989)
maar in de studie van Soto et al. (1992) 100.000 keer minder. Deze
verschillen zijn aanmerkelijk (meer dan een factor 100 tussen de
studies). De effect-concentraties waarbij oestradiol actief was, waren
wel vergelijkbaar in de drie studies.
Van de onderzochte stoffen bleek in de studies van Soto et al. (1992) en
die van Whelsons et al. (1990) dat DES de sterkste oestrogene werking
had - zelfs sterker dan oestradiol zelf.
In de studies van Mayr et al. (1991) en Whelsons et al. (1990) bleken de

diverse fyto- en myco-oestrogenen over het algemeen een vrij sterk
oestrogeen effect te kunnen veroorzaken. Met name zearalonol bleek in
de studie van Whelsons vrijwel even sterk oestrogeen te zijn als
oestradiol. Gezien de grote snelheid van metabolisme die kan optreden
bij fyto- en myco-oestrogenen stoffen speelt blootstelling aan deze

stoffen een belangrijke directe rol bij de beoordeling van risico's voor het
optreden van oestrogene effecten in het milieu.
De industriële stoffen, afgezien van DES, die in de testen van Soto et al.
(1992) zijn gebruikt blijken over het algemeen een veel geringere
oestrogene activiteit te hebben in de E-Screen.
4-Tert-butylfenol en nonylfenol lijken met een potentie van ongeveer
330.000 nog actiever dan Kepone, dieldrin, toxafeen, endosulfan, en de
twee DDT congeneren. Opmerkelijk is dat o,p' DDT en p,p' DDT geen
verschillende potentie lijken te hebben in deze testen.
Behalve de vergelijkende resultaten van de E-Screen zijn ook testen
uitgevoerd met de gestandaardiseerde in vitro regenboogforel
hepatocyt test (ontwikkeld door Pellisero et al., 1993). In deze test
waarin vitellogenese wordt gemeten blijkt nonylfenol slechts 9.000 keer
minder actief dan oestradiol; in de E-Screen is dit 330,000 keer. Voor
4-tert-butylfenol die in de E-Screen een potentie heeft van 350.000
keer, blijkt in de hepatocyt-bioassay nog siechts 1100 keer minder actief
dan oestradiol.
Er blijkt in de hepatocyt-bioassay een klein verschil in potentie tussen

alkylfenolen en de corresponderende ethoxyderivaten. De derivaten
blijken iets minder actief te zijn, en het is goed mogelijk dat eerst
metabolisme van de ethoxylaten moet plaatsvinden voordat oestrogene
werking tot stand komt.
Het is mogelijk dat de vitellogenine bioassays geen compleet beeld
geven van de oestrogene activiteiten van de verschillende stoffen.
Vitellogenine dat als gevolg van oestrogene werking van stoffen wordt
uitgescheiden door de hepatocyten wordt in het celmedium bepaald.
Hiervoor wordt een radioimmunoassay gebruikt waarbij polyclonale
antisera van regenboogforel worden toegepast. Antilichamen zijn
meestal specifiek, maar het is goed mogelijk dat de sera antilichamen
bevatten tegen andere epitiopen dan vitellogenine; er zijn geen
monoclonale antilichamen gebruikt.
Bij de ontwikkeling van zijn hepatocyten-bioassay heeft Pellisero et al.
(1993) een aantal van de bekende fyto- en myco-oestrogenen
gescreend. Hij vond voor Biochanin-A, coumestrol, daidzeine, equol en
genistein allemaal potenties tussen de 1000 en 2000. Deze potenties
blijken dus in de hepatocyten bioassay vergelijkbaar met die van
alkylfenolen, terwijl de laatste stoffen in de E-Screen beduidend minder
actief waren.
De resultaten van de regenboogforel hepatocyten bioassay zijn voor de
verschillende fyto-oestrogenen redelijk goed vergelijkbaar met in vivo
resultaten met de Siberisch steur (Pellisero et al., 1991a,b). Coumestrol
bijvoorbeeld bleek in de steur 500 keer minder potent dan oestradiol en
genistein 2000 keer. De volgorde van oestrogene werking was dezelfde
als in de hepatocyten bioassay oestradiol > coumestrol > genistein >
biochanin A > daidzeine. Deze volgorde is ook aangegeven in de E-
Screen door Whelsons et al. (1990).
De eigenschap van bepaalde stoffen te kunnen binden aan de

oestrogeenreceptor is een goede indicatie van oestrogene of anti-
oestrogene werking. Anti-oestrogeen zijn stoffen als zij na binding aan
de ER-receptor een inactief complex vormen, en daarmee de werking
van oestradiol belemmeren omdat oestradiol niet kan binden aan de ER,
ER kan uit verschillende organismen, en verschillende organen worden
geïsoleerd. Zoals reeds opgemerkt zijn er structuurverschillen tussen
diverse ER-typen. Een systematisch vergelijkend onderzoek is voor zover
bekend niet verricht met xeno-oestrogenen. Voor zover verschillende
ER's zijn gebruikt lijken de resultaten redelijk consistent. Meestal wordt
ervan uitgegaan dat oestradiol als referentiestof corrigeert voor

mogelijke verschillen tussen ER's. Het is echter twijfelachtig of hiermee

voor alle verschillen wordt gecorrigeerd.
Voor verschillende fyto-oestrogenen en xeno-oestrogenen zijn
bindingsexperimenten uitgevoerd. Een overzicht is gegeven in tabel 3.
Voor de meeste van de geteste stoffen geven de potenties aan dat
oestradiol 500 tot 5000 keer zo sterk bindt aan de ER's. In de studie van
Pellisero et al. (1993) is het opmerkelijk dat coumestrol en equol
ongeveer even sterk binden aan uterus-ER van ratten. Dit omdat in
Tabel 3 Stof potentie 1 potentie 2 potentie 3 potentie 4

Oestrogene potentie van xeno-
17P-oestradiol 1,0 1,0 1,0 1,0
oestrogenen In de MCF-7 bloassay.
DES 0,7 0,1
Potentie uitgedrukt als overmaat
zearalonon 25 100 100
blootstelling om binding te krijgen die zearalonol 1,8 100
gelijk Is aan 17|i-oestradiol, coumestrol 3.500 900 100.000
genistein 10.000 1.250
daidzeine 50.000 150.000
biochanin-A 85.000 20.000
Kepone 1.000.000 1.000.000
o,p'-DDT 1.000.000 1.000.000
p,p'-DDT 1.000.000
4-t-butylfenol 350.000
nonylfenol 350.000
endosulfan (technisch mengsel) 1,000.000

endosulfan 1.000.000
endosulfan 1.000.000
dieldrin 1,000.000
toxafeen 1 000.000
potentie 1 volgens Mayr et al, 1992

potentie 2 volgens Whelsons et al. 1990
potentie 3 volgens Soto et al. 1992
potentie 4 volgens Soto et al. 1994
andere oestrogeniteits-bioassays coumestrol een veel sterker oestrogeen

effect teweeg brengt.
Hetzelfde geldt voor de opmerkelijk sterke binding van daidzeine in de
studie van Rosenblum et al. (1993) met uterus-ER van muizen.
De resultaten van Thomas en Smith (1993) met ER uit tever van de
gevlekte zeeforel zijn nog opmerkelijker. Zij lijken geen binding van
orp'-DDT en p,p'-DDT te vinden; met name voor de eerste stof is dit
opmerkelijk. In de studie van Ousterhout (1981) met uterus-ER van
ratten wordt wel binding van o,p'-DDT gerapporteerd - potentie
ongeveer 1000 ten opzichte van oestradiol. Thomas en Smith (1993)
suggereren belangrijke verschillen tussen ER van de door hen gebruikte
vissoort en die van zoogdieren. De suggestie dat de structuurverschillen
tussen ER's van zoogdieren en teleostane vissoorten klein zijn, is slechts
gebaseerd op sequentie-informatie van slechts één vissoort
(regenboogforel), en op het feit dat DES en oestradiol dezelfde
agonistenwerking hebben (Pakdel et al., 1990; Lazier en MacKay,
1993). Onlangs gepubliceerd werk van Thomas lijkt aan te geven dat
prp'-DDT en met name o,p'-DDT wel aan ER binden van een andere
teleostane mariene vissoort - Atlantic croaker (Thomas et ai., 1995).
In de studie van Thomas en Smith (1993) blijkt evenals in een aantal
zoogdierstudies dat DES sterker aan de vissen-ER bindt dan oestradiol.
In de studie van Korach et al.(1988) blijken PCB-metabolieten soms zeer
sterk te binden aan de ER uit de uterus van muizen. De potentie van het
4-hydroxy-2',4',6r-trichloorbifenyl geeft aan dat het hier een van de
sterkst bindende xenobiotica betreft. Evenals de andere sterk bindende
PCB-metabolieten gaat het voornamelijk om para-hydroxy-gesubsti-

tueerde PCB's. Dat ER-binding oestrogene werking in vivo kan

veroorzaken, is onder meer gebleken voor het4,4'-dihydroxy-2-chloor-
bifenyl dat in de studie van Gellert (1978) uterotroof was voor ratten.
In het algemeen is er geen direct verband tussen uterotrofie en ER-
binding zoals uit de studie van Korach et al. (1988) bleek. Slechts voor
oestradiol en DES was er een perfecte verband tussen ER potentie en de
dosis die nodig is om in ratten een verdubbeling van het uterusgewicht
te bewerkstelligen. De sterk ER-bindende indenostrol A (ER-potentie
0,7) en pseudo-DES (ER-potentie 1,1) bleken veel minder tot uterotrofie
aanleiding te geven - respectievelijk 21 en 120 keer minder dan
oestradiol. Voor indanostrol gold echter het omgekeerde; relatief
geringe binding aan ER (60 keer zwakker) maar vrij sterke uterotrofische
effecten (12 keer minder).
De voorgaande resultaten geven eens te meer aan dat verschillende
oestrogeniteits-bioassays moeten worden gebruikt om een goede indruk
te krijgen omtrent de oestrogene werking van xenobiotica. Dit geldt
temeer voor stoffen die eerst moeten worden gemetaboliseerd alvorens
zij oestrogeert worden. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om PCB's, en zeker
ook methoxychloor. Hetzelfde lijkt te gelden voor ethoxylaatderivaten
van alkyfenolen.
In ER-bindingsstudies is aangetoond dat sommige alkylfenolen kunnen
binden aan ER. Nonylfenol is hierbij helaas niet getest (Muller en Kim,
1978). Wel is duidelijk geworden dat para-gesubstitueerde alifatische
groepen een sterkere binding vertoonden dat andere congeneren. De
afwezigheid van een interfererende ortho-gesubstitueerde groep was
eveneens van groot belang. Daarnaast was de lengte van de sustituent
van belang; een zijketen met 5-C bindt sterker aan ER dan een zijketen
met 4-C. Dit kan mede worden verklaard door de hydrofobiteits-
verschillen tussen de verschillende sustituenten. Op basis van deze
structuurkenmerken is het waarschijnlijk dat nonylfenol sterk bindt aan
de ER.


6. Stoffen die van belang zijn voor het Nederlandse

milieu - Speculaties
De meeste xeno-oestrogene stoffen lijken feitelijk slechts zwak-

oestrogeen te zijn in een aantal bioassays. De bindingsaffiniteit is veelal
honderden of duizenden malen kleiner dan die van oestradiol,
Bovendien geven zij in in vivo studies soms zwakke effecten vergeleken
met kunstmatige dosering van oestradiol. In tegenstelling tot oestradiol
echter blijken veel xeno-oestrogenen redelijk persistent te zijn en
bovendien hydrofoob. Deze twee eigenschappen in combinatie
betekenen vaak dat de stoffen btoaccumuleren in organismen, hetgeen
de interne blootstelling sterk verhoogt. Hierdoor zouden fysiologische
blootstellingsconcentraties kunnen worden opgebouwd in het lichaam
die aanleiding kunnen geven tot endocriene ontregeling. Dit is
bijvoorbeeld aangetoond voor endosulfan (Kepone). Voor deze stof is in
acute testen nooit enige oestrogene werking gevonden. Dosering
gedurende vele weken leidde echter wel tot oestrogene actie en de
daarmee samenhangende verstoring van de voortplanting (McLachlan
et al. 1984).
In het Nederlandse milieu zijn concentraties van xeno-oestrogene

stoffen vrijwel niet bekend. Slechts incidenteel worden concentraties
gerapporteerd van een of enkele stoffen (zie bijlage 3). Van het zwak
oestrogeen werkende beta-cyclohexaan, een bijproduct van het
bestrijdingsmiddel lindaan, zijn wel reguliere metingen bekend. De
concentraties zijn zo laag dat er weinig risico's zijn te verwachten van dit
xeno-oestrogeen. Van DDT zijn totaal-concentraties bekend, maar geen
informatie is beschikbaar van de eveneens oestrogeen-actieve
isomeer - het o,p'-DDT. Bovendien gaat het hier dan meestal om
concentraties in water en eventueel in sediment. Betrouwbare
concentraties in organismen zijn niet bekend; de enkele getallen die
sporadisch zijn verschenen in artikelen en rapporten zijn nooit
geverifieerd.
Naar andere stoffen, die in de internationale literatuur wel van belang

worden geacht voor het miiieu zijn nauwelijks metingen verricht in
Nederlandse watersystemen. In het bijzonder zou het hierbij moeten
gaan om stoffen zoals: alkylfenolen en polyethoxyderivaten;
verschillende soorten stilbenen, met name tamoxifen; verschillende
ftaalzuuresters; bisfenol-A; synthetische oestrogenen zoals
ethinyloestradiol. Andere risicostoffen mogelijk van belang voor de
Nederlandse situatie zijn met name: bepaalde PAK's, zoals
dibenz(ah)anthraceen; toxafeen (gechloreerde camfenen), en verder
endosulfan en dieldrin. Verder zijn er vele stofklassen waarvan
oestrogene activiteit niet bekend is maar waarvan de chemische
structuurkenmerken zoveel gelijkenis vertonen met stoffen die wel
bekend oestrogeen zijn, dat nader onderzoek hiernaar dringend gewenst
is. Ugilec en difenylethers zijn hiervan voorbeelden.
Door het ontbreken van (betrouwbare) gegevens wordt het heel

speculatief of het mogelijk of waarschijnlijk is dat oestrogene effecten in
het Nederlandse milieu optreden. Bovendien is niet eenduidig of

oestrogene effecten ook daadwerkelijk worden waargenomen.

De meest heldere identificatie en illustratie van risico's van xeno-
oestrogenen in het milieu, waarbij effecten kunnen worden verklaard
door opsporing van de bron, is onderzoek naar de kwaliteit van
oppervlaktewater in Groot-Brittannië.
Nadat er rapportage was geweest van dubbelgeslachtelijkheid bij vissen
door sportvissers (Tyler en Everett, 1993), is sedert het begin van de
jaren '90 onderzoek verricht naar de mogelijke oorzaken. Op veel
plaatsen in Groot-Brittannië is dit onderzoek verricht, waarbij met name
vitellogenese bij regenboogforel, vitellogenese bij regenboogforel
hepatocyten, de E-screen test en de 'Yeast-Assay' zijn gebruikt als
indicatoren voor de aanwezigheid van oestrogeen werkende stoffen.
Kort nadat in het laboratorium en in het veld kon worden bevestigd dat
watermonsters xeno-oestrogene stoffen kunnen bevatten, bleek op
sommige plaatsen dat alkylfenolen vrijwel het volledige effect te kunnen
veroorzaken (Jobling en Sumpter, 1993). In het bijzonder in de directe
omgeving van waterzuiveringsinstallaties bleken concentraties
alkylfenolen heel hoog en waren bovendien de oestrogene effecten zeer
sterk. Dit laatste geldt zowel in de situatie dat het water verder wordt
getest in het laboratorium, als in het geval dat vissen in kooien worden
geplaatst in water in de buurt van de afvalwaterzuiveringsinstallaties
(MAFF, 1994).
In situaties van uitstromend installatiewater in rivieren bleek het effect
evenredig met de verdunningsfactor van de rivier af te nemen in het
benedenstroomse gebied. Dit werd in een aantal situaties aangetoond.
Hoewel in eerste instantie alleen alkylfenolderivaten als bron werden
geïdentificeerd, wordt nu aangegeven dat het oestrogene effect van de
watermonsters mede kan worden verklaard door de aanwezigheid van
natuurlijke oestrogenen (17(i-oestradiol en oestron) en in mindere mate
synthetische oestrogenen afkomstig van de anticonceptiepil (ethinyl-
oestradiol).
Ook voor alkylfenolen is vaak gesuggereerd dat volledige afbraak in
waterzuiveringsinstallaties zou optreden. Evenzeer is herhaaldelijk
gesuggereerd dat afbraak in oppervlaktewater redelijk snel verloopt.
Desondanks is in studies aangetoond dat met name nonylfenol op zeer
veel plaatsen voorkomt. Voor 30 verschillende Amerikaanse rivieren zijn
concentraties nonylfenol tussen de 0,02 en 0,2 u,g per liter
gerapporteerd - in 70% van de monsters was de concentratie lager dan
0,1 jig per liter (Naylor, 1992). De laagst gemeten concentraties in 6
Britse rivieren zijn vergelijkbaar met die van Amerikaanse rivieren, terwijl
de hoogste concentraties oplopen tot nabij de 180 \ig per liter in de
rivier Aire (Blackburn et al., 1995). In de rivier Glatt in Zwitserland zijn
concentraties gevonden tussen de 0,3 en 45 jxg per liter - maar in de
meeste gevallen bleven die onder de 10 ug per liter (Ahel et al., 1993).
In de Nederlandse wateren is nog geen betrouwbare meting verricht

naar opgelost nonylfenol. Indicatieve metingen in de Maas geven
concentraties 4-nonylfenol van 10 |u,g/l (bron RIZA). Daarnaast is door
het RIKZ getracht voor enkele sedimentmonsters concentraties
nonylfenol te bepalen. Hierbij is gebruik gemaakt van niet-
geoptimaliseerde extractieprocedures en detectie met massa-
spectrometrie. Het detectiesysteem gaf in de meeste gevallen een
positieve identificatiekans tussen de 70 en 90% voor nonylfenol.
Hoewel kwantificering niet goed mogelijk was, liggen schattingen van
de concentraties rond de 1 mg per kilogram sediment (RIKZ
werkdocument RIKZ/IT 95.630x). Indien dit getal indicatief zou zijn voor
een steady state situatie, dan kan door gebruik te maken van de
geschatte sorptiecoëfficiënt (2000 kg/l; zie bijlage 2) worden

gesuggereerd dat de concentraties nonylfenol in delen van de

Nederlandse wateren rond de 1 u.g per liter liggen. Dit komt redelijk
overeen met gemeten waarden in het buitenland. Hierbij moet echter
wel worden benadrukt dat de schattingen voor Nederlandse waarden
heel onzeker zijn. Tevens moet worden opgemerkt dat het gaat om
schattingen voor concentraties van sedimenten uit estuaria. Uit het
onderzoek van Blackburn et al. (1995) is duidelijk naar voren gekomen
dat concentraties in estuaria een orde van grootte lager zijn dan die in
rivieren in Groot-Brittannië.
Indien de situatie in Nederland vergelijkbaar is met die in Groot-
Brittannië, dan is er zeker reden voor zorg. De laagste concentraties
waarbij oestrogene effecten bij regenboogforellen worden
waargenomen, en waarbij reproductieverstoring ook optreedt bij
watervlooien, is rond de 20 u,g per liter (Comber et al., 1993 en Jobling
et al,, 1996). Vitellogenese bij blootstelling aan n-NP wordt al
aangetoond in regenboogforel bij blootstellingsconcentraties rond de 10
u,g per liter (Jobling et al. 1996). In sommige monsters uit Britse rivieren
en in veel monsters van afvalwater blijken de concentraties nonylfenol
vaak in deze ranges te liggen. Duidelijk is hiermee dat de marge tussen
laagste effect-concentraties en mogelijk hoogste concentraties in
Nederlandse wateren niet heel groot zal zijn. Het verschil tussen de zeer
ruw geschatte steady state concentratie in estuaria en de laagste effect-
concentratie is slechts een factor 10 tot 20. Lokaal en incidenteel, zoals
voor de Maas, is de indicatieve waarde zelfs gelijk aan 10 jig/l. Ook is
het nog maar de vraag of watervlooien en regenboogforellen geschikte
keuzes zijn op basis van gevoeligheid. Het is zeer goed mogelijk dat
andere organismen al bij veel lagere blootstellingsconcentraties effecten
vertonen. Bovendien komen er een breed scala van oestrogene stoffen
als mengsel voor in het milieu. Additiviteit van oestrogene stoffen is in
sommige experimenten aangetoond, hoewel in andere experimenten
gelijktijdige blootstelling resulteerde in anti-oestrogenen werking. Het
risico van additiviteit is echter aanzienlijk, zeker gezien de kleine marge
tussen blootstellingsconcentraties en effect-concentraties.
De geschatte steady state concentratie in estuariene water ligt rond de 1

microgram per liter water. Dit gegeven gecombineerd met geschatte
bioconcentratie factoren geeft een schatting van weefselconcentraties in
vissen en andere waterorganismen tussen de 1 en 5 mg/kg. Deze
schattingen komen goed overeen met die in sommige biotische weefsels
zijn gemeten in het buitenland. In Groot-Brittannië werd in vissen tussen
de 1 en 2 mg/kg gerapporteerd voor de concentraties NP, NP1 EO en
NP2E0 (Ahel et a!., 1993). In mosselen en macroalgae werd iets minder
dan 1 mg/kg gerapporteerd doorWahlenberg en medewerkers (1990)
en Marcomini et al. (1990).
Consumptie van vis of andere waterorganismen kan gezien de

aanwezigheid van APE's en andere xeno-oestrogene stoffen, resulteren
in een aanmerkelijke blootstelling van hogere organismen, inclusief de
mens. In sommige landen maakt de overheid zich zorgen over de
inname door mensen via drinkwater omdat de concentratie p-NP rond
de 1 microgram per liter ligt. Bij consumptie van 2 liter water wordt via
deze route echter niet meer dan 2 microgram p-NP opgenomen, terwijl
consumptie van 100 gram vis mogelijk resulteert in een opname van
100 tot 500 microgram p-NP. Voor een persoon van 60 kg is dit een
dosering van 1,5 tot 8,0 microgram NP per kg lichaamsgewicht. Stoffen
met vergelijkbare hydrofobiteit en afbreekbaarheid (zoais enkele
chloorbenzenen) geven in biomagnificatie-experimenten met aquatische
en terrestrische organismen bij dergelijke doseringen weefsel-
concentraties die minstens een factor 10 lager zijn dan de dosering.

Maximale te schatten concentraties in weefsel van predatoren komen

derhalve niet boven de 0,15 tot 0,8 microgram per kg uit.
Corresponderende concentraties in het weefselvocht zijn dan rond de
1 - 5 nanomolair of minder. De veiligheidsmarge voor hogere dieren
tussen weefsel-vochtconcentraties en cellulaire effectconcentraties voor
oestrogene werking lijken daarmee ruimer voor hogere organismen dan
voor organismen die APE's direct uit het water kunnen opnemen.
Desondanks blijft de marge klein. Zeker indien het consumptiepatroon
van in het wild levende predator-organismen volledig uit water-
organismen is samengesteld, is het mogelijk dat de marges dusdanig
klein worden dat effecten voor gevoelige soorten niet mogen worden
uitgesloten. Zeker als hierbij in ogenschouw wordt genomen dat
verschillende xeno-oestrogenen in prooidieren zullen voorkomen, en
mogelijk hun werking gezamenlijk zullen uitoefenen.

7. Aanbevelingen
Zoals uit de inventarisatie van dit rapport blijkt, zijn bepaalde

milieuverontreinigingen in staat het endocriene systeem van organismen
te ontregelen. Aangezien deze zogenaamde oestrogeen-actieve stoffen
(moederstoffen en metaboiieten) een potentiële bedreiging vormen voor
de voortplanting en gezondheidsstatus van in het witd levende dieren en
van mensen, is het nodig op korte termijn meer kennis over de effecten
van deze stoffen te vergaren, zodat in het beleid de nodige maatregelen
kunnen worden vastgesteld. Nader onderzoek is vooral gewenst om een
wetenschappelijk onderbouwde uitspraak te kunnen formuleren over de
waarschijnlijkheid van reproductiestoornissen ten gevolge van de
huidige blootstellingsniveaus van oestrogeen-actieve stoffen in
organismen in Nederlandse wateren. Met het oog hierop bevelen wij
hieronder verschillende vormen van onderzoek aan die zo snel mogelijk
zouden moeten worden geïnitieerd.
Metingen door middel van chemische analyse-technieken
Aangezien er in Nederland weinig tot niets bekend is over de mate

waarin oestrogeen-actieve stoffen voorkomen in water, waterbodems of
organismen, moeten er dringend metingen worden uitgevoerd die
informatie verschaffen over de aanwezigheid van xeno-oestrogene
stoffen in de Nederlandse oppervlaktewateren. Met bestaande en te
ontwikkelen chemische technieken kunnen de meest verdachte stoffen
(groepen) worden geïdentificeerd: alkylfenolen en alkylfenolethoxylaten,
ftaalzuuresters, bisfenol-A, natuurlijke en synthetische oestrogenen.
Het gebruik van in vitro bioassays
Bioassays spelen bij het onderzoek naar effecten van milieuveront-

reinigingen een belangrijke rol. Een aantai robuuste en snelle
screeningsassays is reeds aanwezig (bijvoorbeeld de 'Yeast-Assay') om
mogelijke oestrogene effecten op te sporen en binnenkort komen er
andere toetsen beschikbaar (onder andere de CALUX-ER-screentest).
Van de meeste milieuverontreinigingen is nog niet bekend of zij
oestrogene effecten veroorzaken, terwijl de lijst stoffen die zich kunnen
binden aan de oestrogeen receptor met de dag langer wordt. Stoffen
zoals bepaalde PAK's (met name dibenz(ah)anthraceen),
bestrijdingsmiddelen zoals toxafeen, endosulfaan, dieldrin, en verder
stoffen ais Ugilec en difenylethers moeten dringend worden onderzocht
op mogelijk oestrogene effecten. Wel moet hiervoor nog worden
nagegaan welke vorm van dosis-respons dergelijke bioassays opleveren,
en welke betrouwbaarheid de resultaten hebben op het niveau van
organismen. Ook dient rekening te worden gehouden met de
mogelijkheid van optreden van biotrans-formatie waardoor oestrogene
effecten niet worden opgemerkt in in vitro systemen maar wel optreden
in de in vivo situatie. Daarnaast dient met deze bioassays het optreden
van additieve en synergistische effecten door combinaties van
oestrogene stoffen nader te worden onderzocht.
In dit verband zouden studies over structuur-activiteits relaties van

oestrogene chemicaliën, die nog niet bekend zijn, kunnen bijdragen aan
de prioriteitstelling van chemicaliën voor toetsing.
Ontwikkeling van in vivo bioassays, biomarkers en modelsystemen
Voor het vaststellen van de toxiciteit van hormoonverstorende stoffen

en combinaties van deze stoffen is de verdere ontwikkeling en validatie
van in vivo toxiciteitstoetsen en diagnostische biomarkers van groot
belang. De in vivo vitellogenine test van de regenboogforel kan hier
bijvoorbeeld al voor worden gebruikt. Waar mogelijk zouden model-
ecosystemen (in de vorm van mesokosmos-experimenten) kunnen
worden ontwikkeld waarmee de schadelijke effecten van enkele
bekende oestrogene stoffen op verschillende ecologische niveaus
kunnen worden voorspeld.
Studies naar bioaccumulatie van xeno-oestrogene stoffen
In de literatuur is helaas weinig bekend over de gevolgen van

bioaccumulatie van xeno-oestrogene stoffen. Aangezien deze stoffen in
het algemeen slecht afbreekbaar en bovendien vaak hydrofoob zijn,
vertonen zij de neiging zich op te hopen in sedimenten en in
organismen. Na bioaccumulatie kunnen concentraties worden bereikt
die mogelijk oestrogene werking opwekken. Aangezien de blootstelling
vooral langetermijneffecten heeft, zal het enige tijd duren voordat
genomen maatregelen resultaten kunnen opleveren. Herhaaldelijk is
aangetoond dat gebioaccumuleerde stoffen in zwangere vrouwen en
knaagdieren een bron van blootstelling vormen voor de zich
ontwikkelende foeten. Juist in de periode van organogenese (de
ontwikkeling of groei van de organen) is blootstelling uiterst riskant,
zoals goed bekend is uit onderzoek naar de effecten van het
synthetische oestrogeen DES. Bij dit onderzoek is aangetoond dat
blootstelling via de moeder aan dergelijke stoffen vele jaren later bij het
kind op latere leeftijd kan leiden tot een scala van schadelijke effecten.
In vitro bioassays vertellen ons weinig over de effecten van
bioaccumulatie van deze stoffen. Nader onderzoek is daarom nodig naar
de gevolgen van ophoping van enkele xeno-oestrogene stoffen. In het
bijzonder zou hierbij op zeer korte termijn aandacht geschonken moeten
worden aan alkylfenolen, verschillende soorten bestrijdingsmiddelen
(met name o,p'-DDT en o,p'-DDE), en de hydrofobe ftaalzuuresters.
Indien voor deze stoffen geen additionele informatie beschikbaar komt,
dan moet worden aangenomen dat zij door de combinatie van
oestrogeniteit en bioaccumulatie actief oestrogeen zijn in het milieu. Dit
zou aanleiding kunnen zijn voor ingrijpende beleids- en
beheersmaatregelen. Voor bepaalde bestrijdingsmiddelen zoals DDT is,
gezien de bestaande verboden, aanvullend beleid niet nodig.
Onderzoek naar andere hormoonverstorende stoffen
Hoewel in deze inventarisatie bijna uitsluitend aandacht is geschonken

aan xeno-oestrogene stoffen die direct via binding met de oestrogeen-
receptor werken, is het eveneens van belang kennis te vergaren over
hormoonverstorende stoffen met andere werkingsmechanismen en deze
bij de beoordeling van gezondheidsrisico's van milieucontaminanten te
betrekken. In eerste instantie wordt hierbij gedacht aan stoffen die het
mannelijke geslachtshormoon kunnen nabootsen of remmen
(androgenen/anti-androgenen) en aan stoffen die een anti-oestrogene

werking hebben. Van organotinverbindingen is inmiddels aangetoond

dat zeer kleine hoeveelheden van deze androgene stoffen (ppt-gebied)
geslachtsveranderingen veroorzaken bij slakken in onze kustwateren.
Naast stoffen die de reproductie op directe wijze ontregelen, bestaan er
relatief veel stoffen die de enzym- of hormoonhuishouding op indirecte
wijze verstoren, Inventarisatie van de reeds beschikbare kennis op dit
gebied kan hierover meer helderheid verschaffen.
De noodzaak van monitoring
De sleutelvraag is wat het totale effect van oestrogene (en andere

hormoonverstorende) stoffen op populatieniveau en daarmee op het
ecosysteem is. Door gebrek aan eco-epidemiologische gegevens kan
deze vraag niet adequaat worden beantwoord. Er is derhalve dringend
behoefte aan een monitoring van mogelijke reproductie-effecten in de
veldsituatie, mede gebruik makend van betrouwbare biomarkers en
bioassay-gestuurde fractionering waardoor het mogelijk wordt de
verantwoordelijke actieve fracties en de individuele stoffen te
identificeren. Als geschikte doelorganismen voor hetaquatisch milieu
komen bijvoorbeeld platvissen (zoals de bot en de schol) en de brasem
in aanmerking. Langetermijn ecologische gegevens zijn voor deze
soorten beschikbaar; onderzoek naar en analyse van reproductie-
relevante parameters kunnen derhalve op korte termijn meer inzicht
verschaffen.


Literatuur
Abrutyn, V.M.D.; McKenzie, D.V.M.; Nadaskay, B.S. (1982). Teratotogy

study of intravaginally administered nonoxynol-9-containing
contraceptive cream in rats. Fertil. Steril. 37:113.
Adams, N.R. (1977). MorphologicaS changes in the organs of ewes

grazing oestrogenic subterranean dover. Res. Vet. Science 22: 216-221.
Adams, N.R. (1990). Permanent infertility in ewes exposed to plant

oestrogens. Australian Veterinary Journal 67:197-201.
Adkins-Regan, E. (1987). Hormonesand differenttation. p. 1-30. IN:

Norris, D.O.; Jones, R,E, (eds.). Hormonesand reproduction in fishes,
amphibians and reptiles. Plenum Press, New York and London.
Ahel, M.; Giger, W. (1993). Partitioning of alkylphenols and alkylphenol

polyethoxylates between water and organic solvents. Chemosphere 26:
1471-1478.
Ahel, M.; Giger, W.; Koch, M. (1994a). Behaviour of alkylphenol

polyethoxylate surfactants in the aquatic environment-1. Occurrence
and transformation in sewage treatment. Wat. Res. 28:1131-1142.
Ahel, M.; Giger, W.; Schaffner, C. (1994b). Behaviour of alkylphenol

polyethoxylate surfactants in the aquatic environment - If. Occurrence
and transformation in rivers. Wat. Res. 28:1143-1152.
Ahel, M.; Hrsak, D.; Giger, W. (1994c). Aerobic transformation of

short-chain alkylphenol polyethoxylates by mixed bacterial cultures.
Aren. Environ. Contam. Toxicol. 26: 540-548.
Ahel, M.; McEvoy, J.; Giger, W. (1993). Bioaccumulation of the

lipophilic metabolites of nonionic surfactants in freshwater organisms.
Environ. Poilut. 79: 243-248.
Ahel, M.; Scully, F.E.; Hoigné, J.; Giger, W. (1994). Photochemical

degradation of nonylpheno! and nonylphenol polyethoxylates in natural
waters. Chemosphere 28: 1361-1368.
Argese, E.; Marcomini, A.; Miana, P.; Bettiol, C; Perin, G. (1994).

Submitochondrial particle response to linear atkylbenzene sulfonates,
nonylphenol polyethoxylates and their biodegradation derivatives.
Environ. Toxicol. Chem. 13: 737-742.
Astroff, B.; Safe, S. (1990). 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin as an

antiestrogen:effecton rat uterine peroxidase acttvity. Biochem.
Pharmacol. 39: 485-488.
Bail, H.A.; Reinhard, AA.; McCarty, P.L. (1989), Biotransformation of

halogenated and nonhalogenated octylphenol polyethoxylate residues
under aerobic and anaerobtc conditions. Environ. Sci. Technol. 23:
951-961.

Bern, H.A.; Mills, K.T.; Jones, L.A. (1983). Critical period for neonatal
estrogen exposure in occurrence of mammary gland abnormalities in
adultmice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172: 239-242.
Bitman, J.; Cecil, H.C.; Harris, S.J.; Fries, G.F. (1968). Estrogenic activity
of o,p'-DDT in the mammalian uterus and avian oviduct Science 162:
371-372.
Blackburn, M.A.; Waldock, M.J. (1995). Concentrations of alkylphenols

in rivers and estuaries in England and Wales. Wat. Res. 29:1623-1629.
Bortone, S.A.; Davis, W.P. (1994). Fish intersexuality as indicator of

environmental stress. Bioscience 44:165-172.
Bromwich, P.; Cohen, J.; Stewart, I.; Walker, A. (1994). Decline in sperm
counts: an artefact of changed reference range of 'normal'? Br. Meel.).,
309, 19-22.
Brotons, J.A.; Olea-Serrano, M.F.; Villalobos, M.; Pedraza, V.; Olea, IM.
(1995). Xenoestrogens released from lacquer coatings in food cans.
Environ. Health Perspect 103: 608-612.
Brunner, P.H.; Capri, S.; Marcomini, A.; Giger, W. (1988). Occurrence

and behaviour of linear alkylbenzenesulphonates, nonylphenol,
nonylphenol mono- and nonylphenol diethoxylates in sewage and
sewage sludge treatment. Wat. Res. 22:1465-1472.
Buiger, W.H.; Kupfer, D. (1983). Effect of xenobiotic estrogens and

structurally related compounds on 2-hydroxylation of estradiol and
other monooxygenase activities in ratliver. Biochem. Pharmacol. 32:
1005-1010.
Buttar, H.S.; Swierenga, S.H.H.; Matula, T.l. (1986). Evaluation of the

cytotoxicity and genotoxicity of the spermicides nonoxynol-9 and
octoxynol-9. Tox. Lett 31: 65-73.
Carlsen, E.; Giwercman, A.; Keiding, N.; Skakkebaek, N.E. (1992).

Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. B. Med.
J. 305:609-613.
CES (1993). Uses, fate and entry into the environment of nonyiphenol
ethoxylates. Kent Consultants Environ Sci Ltd.
Chvapil, M.; Eskelson, CD.; Stiffel, J.A.; Owen, J.A.; Droegemuller, W.

(1980). Studies on nonoxynol-9. Il Intravaginal absorption, distribution,
metabolism and excretion in rats and rabbits. Contraception 22: 325-
339.
Chakravorty, S.; Lal, B.; Singh, T.P. (1992). Effect of endosulfan

(thiodan) on vitellogenesis and in tnodulation by different hormones in
the vitellogenic catfish Clarias batrachus. Toxicoi. 75:191-198.
Colborn, T.; Clement, C. (1992). Chemically-induced alterations in

sexual and functional development: The wildlife/human connection.
Advances in Modern Environmental Toxicology. (Vol. 21). Princeton
Scientific PublishingCo., Inc, Princeton, NJ.

Colborn, T.; Saai, F.S. vom; Soto, A.M. (1993). Developmental effects of
endocrine-disrupting chemicafs in wildlife and humans. Environ. Health
Perspect. 101: 378-384.
Comber, M.H.I.; Williams, T.D.; Stewart, K.M. (1993). The effects of

nonylphenol on Daphnia magna. Wat. Res. 27: 273-276.
Cooper, R.L.; Chadwick, R.W.; Rehnberg, G.L.; Goldman, J.M.; Booth,

K.C.; Hein, J.F.; McElroy, W.K. (1989). Effect of lindane on hormonal
control of reproductive function in the female rat. Toxicol. Appl.
Pharmacol., 99, 384-394.
Coward, L; Barnes, N.C.; Setchell, K.D.R. (1993). The tsofiavones

genistein and daidzein in soy based foods from American and Asian
diets. J. Agr. Food Sci. 41: 1961-1967.
Cummings, A.M.; Gray Jr, L.E. (1987). Methoxychlor affects the

decidual cell response of the uterus but not other progestational
parameters in female rats. Toxicol. Appl. Pharmacoi. 90: 330-336.
Cummings, A.M.; Perreault, S.D. (1990). Methoxychlor accelerates

embryo transport through the rat reproductive tract. Toxicol. Appl.
Pharmacol..
Daston, G.P. et al. (1995). Invited debate/commentary: Do hormonally

active chemicals in the environment pose a significant risk foradverse
reproductive effects and cancer? In: Human and Ecological Risk
Assessment: Vol. 1, No. 2, pp 1-42.
Denison, M.S.; Chambers, J.E.; Yarbrough, J.D. (1981). Persistent

vitellogenin-like protein and binding of DDT in the serum of
insecticide-resistant mosquitofish (Gambusia affinis). Comp. Biochem.
Physiol. 69C: 109-112.
Dodds, E.C.; Lawson, W. (1938). Molecular structure in relation to

oestrogenic activity. Compounds without a phenantrene nucleus. Proc.
Royal Soc. London, B 118: 222-232.
Duax, W.L.; Griffin, J.F. (1987). Structural features which distinguish

estrogen agonists and antagonists. J. Steroid. Biochem. 27: 271-280.
Ekelund, R.; Bergman, A.; Granmo, A.; et al. (1990). Bioaccumulation of

4-nonylphenol in marine animals - a re-evaluation. Environ. Pollut. 64:
107-120.
Eroschenko, V.P. (1981). Estrogenic activity of the insecticide

chlordecone in the reproductive tract of birds and mammals. J. Toxicol.
Environ. Health 8: 731-742.
Eroschenko, V.P.; Cooke, P.S. (1990). Morphological and biochemical

alterations in reproductive tracts of neonatal female mice treated with
the pesticide methoxychlor. Biology of Reproduction 42: 573-583.
Eroschenko, V.P.; Palmiter, R.D. (1980). Estrogenicity of Kepone in birds

and man. p. 305-325. IN: McLachlan, J.A. (ed.). Estrogens in the
environment, ElsevierSct. Publishing Co. Inc., New York, NY.
Faber, K.A.; Hughes, Jr, CL. (1991). The effect of neonontal exposure
to diethylstilbestrol, genistein, and zearalenone on pituitary

responsiveness and sexually dimorphic nucleus volume in the castrated

ad uit rat. Bioi. Reprod. 45: 649-653.
Fredricks, G.R.; Kincaid, R.L; Bondioli, K.R.; Wright, R.W. (1981).

Ovulation rates and embryo degeneracy in female mice fed the
phytoestrogen, Coumestrol (41156). Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 167:
237-241.
Fry, D.M.; Toone, C.K. (1981). DDT-induced feminization of guil

embryos. Science 213: 922-924.
Galand, P.; Mairesse, N.; Degraef, C; Rooryck, J. (1987). o,p'-DDT

(1,1,1-trichloro-2 (p-chlorophenyl) 2-(o-chlorophenyl) ethane is a
purely estrogenic agonist in the rat uterus in vivo and in vitro. Biochem.
Pharmacol. 36: 397-400.
Galeyr F.D.; Mendez, L.E.; Whitehead, W.E.; et al. (1993). Estrogenic

activity in forages: diagnostic use of the dassical mouse uterine bioassay.
J. Vet. Diagn. In vest. 5: 603-608.
Gellert, R.J. (1978). Uterotrophic activity of polychlorinated biphenyls

(PCB) and induction of precocious reproductive aging in neonatally
treated rats. Environ. Res. 16:123-130.
Gellert, R.J.; Wilson, C. (1979). Reproductive function in rats exposed

prenatally to pesticides and polychlorinated biphenyls (PCB). Eviron. Res:
437-443.
Giger, W.; Brunner, P.H.; Schaffner, C. (1984). 4-nonylphenol in

sewage sludge: accumulation of toxic metaboütes from nonionic
surfactants. Science 225: 623-625.
Ginsburg, J.; Okolo, S.; Prelevic, G. (1994). Residence in Londen area

and sperm density. Lancet 343: 230.
Granmo, A.; Ekelund, R.; Magnussen, K.; Berggren, AA. (1989). Lethal
and Sublethal Toxicity of 4-nonylphenol to the common mussel
(Mytilus eduiis L). Environ. Pollut 59: 115-127.
Gray Jr, L.E.; Ferrell, J.; Ostby, J.; Rehnberg, G.; Linder, R.; Cooper, R.;
Goldman, J.; Slott, V.; Laskey, J. (1989). A dose response analysis of
methoxychior-induced alterations of reproductive development and
function in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 121: 92-108.
Guiliette Jr, L.J.; Gross, T.S. (1994). Pesticide induction of developmental

abnormalities of the reproductive system of alligators (Alligator
mississippiennsis) and turtles (Trachemys scripta). Abstract from:
Estrogens in the Environment III: Global Health Implications, National
Institute of Environmental Health Sciences, Washington, DC, jan. 9-11,
1994.
Guzelian, P.S. (1982). Comparative toxicology of chlordecone (Kepone)

in humans and experimentai animais. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 22:
89-113.
Hallers-Tjabbes, C.C.T.; Kemp, J.F.; Boon, J.P. (1994). Imposex in

whelks (Buccinum undatum) from the open North Sea: relation to
shipping traffic intensities. Mar. Pollut. Buil. 28: 311-313.

Hammond, B.; Katzenellenbogen, 8.S.; Krauthammer, N.; McConnel, J.

(1979). Estrogen activity of the insecticide chlordecone (Kepone) and
interaction with uterine estrogen receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 76
(12): 6641-6645.
Hamilton, S.B. (1995). Estrogenicity of environmenta! PCBs.

Correspondence. Envir. Health Persp., 103, p. 12.
Hansen, P.-D.; von Westemhagen, H.; Rosenthal, H. (1985).

Chlorinated hydrocarbons and hatching succes in Baltic herring spring
spawners. Mar. Environ. Res. 15: 59-76.
Harries, J.E.; Sheahan, D.A.; Jobling, S.; Matthiessen, P.; Neall, P.;
Routledge, E.; Rycroft, R.; Sumpter, J.P.; Tylor, T. (1996). Sun/ey of
Estrogenic activity in UK inland waters. Environ. Toxicol. Chem. 15:
1993-2002.
Harries, J.E.; Sheahan, D.A.; Jobling, S.; Matthiessen, P.; Neall, P.;
Sumpter, J.P.; Tylor, T.; Zaman, N. (1996). Estrogenic activity in five
U.K. rivers detected by measurements of vitellogenesis in caged male
trout. Environ. Toxicol. Chem. (in prep)
Harries, J.E.; Sheahan, D.A.; Jobling, S.; Matthiessen, P.; Sheahan, D.A.;
Sumpter, J.P. (1995). Effects of Tracé Organics on Fish- Phase 2. Report
to the Department of the Environment, Foundation for Water Research,
Marlow. Report no. FR/D 0022,90 pp.
Harrison, P.T.C.; Humfrey, C.D.N.; Litchfield, M.; Peakall, D, Shuker, LK

(1995). IEH assessmenton environmental oestrogens: Consequences to
human health and wildlife, MCR Institute for Environment and Health.
Leicester, UK.
Herman, R.L.; Kincaid, H.L. (1988). Pathological effects of orally

administered estradiol to rainbow trout. Aquaculture 72:165-172.
Hewstone, R.K. (1994). Environmental health aspects of lubricant

additives. Sci. Total Environ. 156:243-254.
Hileman, B. (1993). Environmental estrogens linked to reproductive

abnormalities and cancer. Chem. Eng. News, 31 January 1994; 19-23.
Hines, M. (1992). Surrounded by estrogens? Considerations for

neurobehavioral development in human beings. p. 261-281. IN:
Colborn, T.; Clement, C. (eds.). Chemically-induced alterations in sexual
and functionai development: the wildlife/human connection. Advances
in modern environmental toxicology. (Vol. 21). Princeton Scientific
PublishingCo., Inc., Princeton, NJ.
Ho, S.M. (1987). Endocrinology of vitellogenesis. p. 145-170. IN:

Norris, D.O.; Jones, R.E. (eds.). Hormones and reproduction in fishes,
amphibians and reptiles. Plenum Press, New York and London.
Holcombe, M.; Phipps, G.L.; Knuth, M.L; Felhabert, T. (1984). Acute

toxicity of selected substituted phenols, benzen and benzoic acid esters
to fathead minnows Pimephates promelas. Environ. Pollut, (Series A):
367-381.
Holt, M.S.; Mitchell, G.C.; Watkinson, R.J. (1992). The environmenta!

chemistry, fate and effects of nonionic surfactants. p. 90-145. In:

Hutzinger, O.; Oude, N.T, de (eds.). The handbook of environmental

chemistry. Anthropogeniccompounds: detergents (part F). Vol. 3.
Springer-Verlag, Berlin.
Hughes Jr, CL. (1988). Phytochemicai mimicry of reproductive

hormones and modulation of herbivore fertility by phytoestrogens.
Environ. Health Perspect. 78: 171-175.
Hunter, G.A.; Donaldson, E.M. (1983). Hormonal sex control and its
application to fish culture. In W.S. Hoar, DJ. Randall and E.AA.
Donaidson, eds., Fish Physiology. Academie, New York. NY, USA, pp.
223-303.
Janssen, P. (1996). Reproduction of the flounder, Platichthys flesus (L)

in relation to environmental pollution: Steroids and vitellogenesis. Acad.
Thesis, University of Utrecht, The Netherlands. 174 pp.
Jick, H.; Walker, A.M.; Rothman; et ai. (1981). JAMA 245: 1329-1332.
JobÜng, S.; Reynolds, T.; White, R.; et al. (1995). A variety of

environmentally persistent chemicals, including some phthalate
plasticizers, are weakly estrogenic. Environ. Health Perspect. 103:
582-587.
jobling, S.; Sheahan, D.A.; Osborne, J.A.; Matthiessen, P.; Sumpter, J.P.
(1996). Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolfc chemicals. Environ. Toxicol.
Chem. 15: 194-202.
Jobling, S.; Sumpter, J.P. (1993). Detergent components in sewage

effluent are weakly oestrogenic to fish: an in vitro study using rainbow
trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes. Aquat. Toxicol. 27: 361-372.
Johnson, D.C.; Sen, M.; Dey, S.K. (1992). Differential effects of

dichlorodiphenyltrichloroethaneanalogs, chlordecone, and 2,3,7,8-
tetrachlorodibenzo-p-dioxin on establishment of pregnancy in the
hypophysectomized rat. Soc. Exp. Biol. Med. Vol. 199.
Johnstone, R.; Simpson, T.H.; Youngson, A.F. (1978). Sex reversal in

salmonid cultures. Aquaculture 13: 115-134.
Jones, R.E. (1987). Ovulation:lnsight aboutthe mechanisms based on a

comparative approach. p. 203-240. IN: Norris, D.O.; Jones, R.E. (ed.).
Hormones and reproduction in fishes, amphibians, and reptiles. Plenum
Press, New York and London.
Jordan, V.G.; Mittal, S.; Gosden, B.; Koch, R.; Lieberman, M.E. (1985).
Structure-activity relationships of estrogens. Environ. Health Perspect.
61:97-110.
Katzenellenbogen, J.A.; Katzenellenbogen, B.S.; Tatee, T.; Robertson,

D.W.; Landvatter, S.W. (1980). The chemistry of estrogens and
anti-estrogens: relationships between receptor binding and biological
activity. p. 305-325. IN: McLachan, J.A. (ed.). Estrogens in the
environment. Elsevier, North Holland, The Netherlands.

Kenneth.AF; Hughes, J.R. (1991). The effect of neonatal exposure to

Diethylstilbestrol, Genistein, and Zearalenone on pituitary
responsiveness and sexualiy dimorphic nucleus volume in the castrated
adult rat. Siology of Reproduction 45: 649-653.
Kime. (1995). The effects of pollution on reproduction in fish. Reviews

Fish Biology Fisheries 5: 52-96.
Klein, K.O.; Baron, J.; Colli, M.J.; et al. (1994). Estrogen levels in
childhood determined by an ultrasensitive recombinant celi bioassay. J.
Clin. Invest. 94; 2475-2480.
Knaak, J.B.; Eldridge, J.M.; Sullivan, LJ. (1966). Excretion of certain

polyethylene glycol ether adducts of nonylphenol by the rat. Toxicol.
Appl. Pharmacol. 9: 331-340.
Korach, K.S. (1993). Surprising places of estrogenic activity.

Endocrinology 132: 2277-2278.
Korach, K.S.; Chae, K.; Cibson, F.; Curtis, S. (1991). Estrogen receptor
stereochemistry: ligand binding and hormonal responsiveness. Steroids
56: 263-270.
Korach, K.S.; Sarver, P.; Chae, K.; et al. (1988). Estrogen

receptor-binding activity of polychlorinated hydroxybiphenyls:
conformationally restricted structural probes. Mol. Pharmacol. 33:
120-126.
Krishnan, A.V.; Stathis, P.; Permuth, S.F., et al. (1993). Bisphenol-A: an

estrogenic substance is released from polycarbonate flasks during
autoclaving. Endocrinology 132: 2279-2286.
Krieger, N.; Wolff, M.S.; Hiatt, R.A.; et al. (1994). Breastcancer and
serum organochlorines: a prospective study among white, black and
Asian women. J. Natl. Cancer Inst. 86: 589-599.
Kupfer, D.; Bulger, W.H. (1980). Estrogenic proporties of DDT and

analogs. p. 239-263. IN: McLachlan, J.A. (ed.). Estrogens in the
environment. Elsevier, North Holland, The Netherlands.
Kvestak, R.; Terzic, S.; Ahel, M. (1994). Input and distribution of

alkylphenol polyethoxylates in a stratified estuary. Marine Chem. 46:
89-100.
Lazier, C.B.; MacKay, M.E. (1993). Vitellogenin gene expression in

teleostfish. p. 391-405. IN: Hochachka; Mommeson (ed.). Biochemistry
and molecular biology of fishes. Vol. 2. Elsevier Science Pubiishers,
Amsterdam, The Netherlands.
Legler, J. (1995). Preliminary study on the development of a functional

screening test for (anti) estrogens. Report of Department of Toxicology,
Agricultural University of Wageningen, NL. Financied by RIKZ/RWS. 48
pp.
Leonards, P.E.G.; Vethaak, A.D.; de Voogt, P. (red.) (1996).

Oestrogeen-actieve stoffen in het milieu. Verslag studiedag 23 februari
1996. Uitgave SENSE/RIKZ, Rijkswaterstaat, Middelburg, NL, 80 pp.
ISBN 90-369-0415-3.

Lewis, M A (1990). Chronic toxicities of surfactants and detergent

builders to algae-a review and risk assessment. Ecotoxicol. Environ. Saf.
20: 123-140.
Lewis, M.A. (1991). Chronic and sublethal toxicities of surfactants to

aquatic animals - a review and risk assessment. Wat. Res. 25:101-113.
Mably, T.A.; Moore, R.W.; Peterson, R.E. (1992). In utero and

lactationa! exposure of mate rats to 2,3,7,8,-tetrachlorodibenzo-
p-dioxin: 1. Effects on androgenic status. Toxicol. Appl. Pharmacol. 114:
97-107.
MAFF (1994). Aquatic environment monitoring report, no 40, Ministry

of Agriculture, Fisheries and Food, Directorate of Fisheries Research,
Lowestoft, UK.
Maki, H.; Masuda, N.; Fujiwara, Y.; Ike, M.; Fujita, M. (1994).
Degradation of alkylphenol ethoxyiates by Pseudomonas sp. strain
TROL Appl. Environ. Microbiol. 60: 2265-2271.
Marcomini, A.; Capel, P.D.; Lichtensteiger, T.; Brunner, P.H.; Geiger, W.

(1989). Behaviour of aromatic surfactants and PCBs in sludge-treated
soil and landfills. J. Environ. Qual. 18: 523-538.
Marcomini, A.; Pavoni, B.; Sfriso, A.; Orio, A.A. (1990). Persistent
metabolites of alkylphenol polyethoxylates in the marine environment.
Marine Chem. 29: 307-323.
Markiewicz, L; Garey, J.; Adlercreutz, H.; et ai. (1993). In vitro

bioassays of non-steroidal phytoestrogens. J. Steroid. Biochem. Molec.
Biol. 45: 399-405.
Mason, R.R.; Schulte, GJ. (1980). Estrogen-iike effects of o,p'-DDT on

the progesterone receptor of rat uterine cytosol. Res. Com. Chem. Path.
Pharmac. 29: 281.
Mayr, U.; Butsch, A.; Schneider, S. (1992). Validation of two in vitro test
systems for estrogenic activities with zearalenone, phytoestrogens and
cereai extracts. Toxicol. 74: 135-149.
McKinney, J.D.; Waller, CL. (1994). Polychlorinated biphenyls as

hormonally active structural analogues. Environ. Health Perspect. 102:
290-297.
McLachian, J.A. (1981). Rodent models for perinatal exposure to

diethylstilbestrot and their relation to human disease in the male. pp.
148-157. IN: A.L. Herbstand H.A. Bern (eds,). Developmental Effects of
Diethylsttlbestrol (DES) in Pregnancy.» Thieme-stratton Inc. New York.
McLachian, J.A.; Dixon, R.L (1976). Transplacental toxicity of

diethylstilbestrol: A special problem in safety evaluation. pp. 423-448.
IN M.A. Mehlman. R.E. Shapiro and H. Blumentha!. (eds.). Advances in
Modern Toxicoiogy. Hemisphere, Washington, DC. USA.
McLachian, J.A.; Korach, K.S.; Newbold, R.R.; Degen, G.H. (1984).

Diethylstilbestrol and other estrogens in the environment. Fundam.
Appl. Toxicol., 4, 686-691.
McLachian, J.A.; Newbold, R.R.; Teng, C.T.; Korach, K.S. (1992).
Xeno-oestrogene stoffen in het aquatisctie milieu 54

Environmental estrogens: orphan receptors and genetic imprinting. p.

107-112. IN: Colborn, T.; Clement, C. (eds.). Chemically-induced
alterations in sexual and functional development: the wildlife/human
connection. Advances in modern environmental toxicology. (Vol. 21).
Princeton Scientific Publishing Co., Inc., Princeton, NJ.
McLachlan, J.A.; Korach, K.S. (1995). Symposium on estrogens in the

environment III. Environ. Health Perspect. 103 Suppl, 7.
McLeese, D.W,; Zitko, V.; Sergeant, D.B.; Burridge, L,; Metcaife, CD.
(1981). Lehality and accumulation of Alkylphenols in aquatic fauna.
Chemosphere 10: 723-730.
Mensink, B.P.; van Hattum, B.; Vethaak, A.D.; Boon, J.P. (1996). The
development of imposex in relation to organotin contamination in the
common whelk, Buccinum undatum. NIOZ rapport 1996-3, 38 pp.
Meyer, O.; Andersen, P.H.; Hansen, E.V.; Larsen, J.C. (1988).

Teratogenicity and in vitro mutagenfcity studies on nonoxynol-9 and
-30. Pharmacol. Toxicol. 62: 236-238.
Miksicek, A. (1993). Commonly occurring plant flavonoids have

estrogenic activity. Mol. Pharmacol. 44: 37-43.
Mousavi, Y., Adlercreutz, H. (1993). Steroids 58: 301-304.
Mueller, C C ; Kim, U.H. (1978), Displacement of estradio! from

estrogen receptors by simple alkyl phenols. Endocrinology 102:
1429-1435.
Murk, A.J.; Legler, M.S.; Denison, J.P.; Giesy, C; Van de Guchte, C;

Brouwer, A. (1996). Chemical-activated luciferase gene expression
(CALUX): a novel in vitro bioassay for Ah receptor active compounds in
sediment and pore water. Fundam. Appl. Toxicol, 33: 149-160.
Nayler, G.C.; Mierure, J.P.; Weeks, J.A.; Castaldi, R.J.; Romana, R.R.
(1992), Alkylphenol ethoxylates in the environment. J. Am, Oif Chemist.
Soc. 69; 695-703,
Nelson, J.A. (1974). Effects of dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT)

analogs and polychlorinated biphenyl (PCB) mixtures on
17p[3H]estradiol binding to rat uterine receptor. Biochem. Pharmacol.
23:447-451.
Newbold, R.R.; McLachlan, J.A. (1985). Diethylstilbestrol associated

defects in murine genital tract development. p. 288-318. IN: (J.A.
McLachlan, ed.), Estrogens in the Environment II: Influences on
Development. Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York.
Nimrod, A.C.;Benson, W.H. (1996). Environmental estrogenic effects of

alkylphenol ethoxylates. Crit. Rev. Tox. 26 (3): 335-364.
Norris, D.O. (1987). Regulation of male gonaducts and sex accessory

structures. p. 327-354. IN: Norris, D.O.; Jones, R.E. (eds.). Hormones
and reproduction in fishes, amphibians and reptiles. Plenum Press, New
York and London.

Olsen, G.W.; Bodmer, K.M.; Ramlow, J.M.; Ross, C.E.; Lipshultz, L.J.
(1995). Have sperm counts been reduced 50% in 50 years? A statistical
model revisited. Fertil. SteriJ. 63: 887-893.
Ousterhout, J.; Struck, R.F.; Nelson, J.A. (1981). Estrogenic activities of

methoxychlor metabolites. Biochem. Pharmacol. 30: 2869-2871.
Pakdel, F.; Le Grac, F.; Le Goff, P.; et al. (1990). Full-length sequence
and in vitro expression of rainbow trout estrogen receptor cDNA. Mol.
Cell Endocrinol. 71: 195-204.
Pelissero, C; Bennetau, B.; Babin, P.; et al. (1991). The estrogenic

activity of certain phytoestrogens in the Siberian sturgeon Acipenser
baeri. J. Steroid. Biochem. Molec. Biol. 38: 293-299.
Peüssero, C; Fïouriot, G.; Foucher, J.L.; et al. (1993). Vitellogenin

synthesis in cultured hepatocytes; an in vitro lest for the estrogenic
potency of chemicals. J. Steroid. Biochem. Molec. Biol, 44: 263-272.
Pelissero, C ; Le Menn, F.; Kaushick, S. (1991). Estrogenic effect of

dietary soya bean meal on vitellogenesis in cultured Siberian sturgeon
Acipenser baeri. Gen. Comp. Endocrinol. 83: 447-457.
Peter, R.E. (1981). Gonadotropin secretion during reproductive cycles in

teleosts: Influence of environmental factors. Gen. Comp. Endocrinol. 45:
294-305.
Purdom, C.E.; Hardiman, P A ; Bye, V.J.; et al. (1994). Estrogenic effects

of effluents from sewage treatment works. Chem. Ecol. 8: 275-285.
Raloff, J. (1994). That feminine touch: Are men suffering from prenatal
or childhood exposures to 'hormonal'toxicants? Science News 145:
49-64.
Reel, J.R.; Lamb, J.C. (1985). Reproductive toxicology of chlordecone

(Kepone). p. 357-392, SN: Thomas, J.A.; Korach, K.S.; McLachlan, J.A.
(ed.). Endocrine toxicology, target organ toxicology series. Raven press,
New York, NY.
Reijnders, P.J.H.; Brasseur, S.MJ.M. (1992). Xenbiotic induced hormonal

and associated developmental disorders in marine organisms and related
effects in humans; An overview. p. 159-174. IN: Colborn, T.; Clement,
C. (eds.). Chemically-induced alterations in sexual and functional
development: the wildlife/human connection. Advances in modern
environmental toxicology. (Vol. 21). Princeton Scientific Publishing Co.,
Inc., Princeton, NJ.
Reinhard, M.; Goodman, N.; Mortelmans, K.E. (1982). Occurrence of

brominated alkylphenol polyethoxy carboxylates in mutagenic
wastewater concentrates. Environ. Sci. Technol. 16: 351-362.
Robison, A.K.; Schmidt, W.A.; Stancel, G.M. (1985). Estrogenic activity

of DDT: estrogenic-receptor profiles and the responses of individual
uterine cell types following o,p'-DDT administration. J. Toxicol. Environ.
Health 16: 493-508.
Robison, A.K.; Sirbasku, D.; Stancel, G.M. (1985). DDT supports the
growth of an estrogen-responsive tumor. Tox. Lett. 27:109-113.

Rogan, W.J.; Gladen, B.C.; McKinney, J.D.; et al. (1987).

Polychlon'nated biphenyls (PCBs) and dichlorodiphenyl dichloroethene
(DDE) in human mifk: effects on growth, morbidity and duration of
lactation. Am. J. Public Health 77:1294-1297.
Rosenblum, P.M.; Pudney, J.; Gallard, I.P. (1987). Gonadal morphology,

enzyme histochemistry and plasma steroid levels during the annual
reproductive cycle of male and female brown bullhead catfish, Ictalurus
nebulosus Lesueur. J. Fish Biol, 31; 325-341.
Rosenblum, P.M.; Stauber, R.E.; Van Thiel, D.H.; Campbell, I.M.;

Gavaler, J.S. (1993). Assessment of the estrogenic activity of
phytoestrogens isolated from bourbon and beer. Alcoholism: Clinical
and Experimental Research 17, No 6:1207-1209.
Routledge, E.J.; Sumpter, J.P. (1996). Estrogenic activity of surfactants

and some of their degradation products assessed using a recombinant
yeast screen. Environ. Toxlcol, Chem. 15: 241-248.
Saad, DJ.C; Kirsch, R.M.; Kaplan, L.L; Rodwell, D.E. (1984).

Teratoiogy of intravaginally administrered contraceptive jelly containing
octoxynol-9 in rats. Teratoiogy 30: 25-30.
Safe, $.; Astroff, B.; Harris, M. (1991). 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-

p-dioxin (TCDD) and related compounds as antiestrogens:
characterization and mechanism of action. Pharmacol. Toxicol. 69:
400-409.
Safe, S.H. (1994). Dietary and environmental estrogens and

antiestrogens and their possible role in human disease. Environ. Sci.
Pollut Res. 1:29-33.
Sauer, M.A.; Rifka, R.M.; Hawks, R.L.; Culter, G.B.; Loriaux, D.L
(1983). Marijuana: Interactlon with the estrogen receptor. J. Pharmacol.
Exp. Ther. 224: 404-407.
Schneider, S.; Alks, U; Morreal, CE.; et al. (1976). Estrogenic properties

of 3,9 dihydroxybenzo(a)anthracene, a potential metabolite of benzo(a)
anthracene. J. Natl. Cancerlnst 57:1351-1354.
Setchell, K.D.R.; Borriello, S.P.; Hulme, P.; et al. (1984). Nonsteroidal

estrogens of dietary origin: possible roles in hormone-dependent
disease. Am. J. Clin. Nutr. 40: 569-578.
Setchell, K.D.R.; Gosselin, S.J.; Welsh, M.B.; et al. (1987). Dietary

estrogens - a probable cause of infertility and liver disease in captive
cheetahs. Gastroenterology 93: 225-233,
Sharma, O.I.; Aldercreutz, H.; Strandberg, J.D.; Zimkin, B.R.; Coffey,

D.S.; Ewing, L.L. (1992). Soy of dietary source plays a prevantive role
againstthe pathogenisis of protatitis in rats. J. Steroid Biochem. Molecul.
Biol. 43: 557-564.
Sharpe, R.M.; Skakkebaek, N.E. (1993). Are estrogens involved in falling

sperm counts and disorders of the male reproductive tract? Lancet 341:
1392-1395.
Sheahan, D.A.; Bucke, D.; Matthressen, P.; Sumpter, J.P.; Kirby, M.F.;
Neall, P.; Waldock, M. (1994). The effects of low levels of

17[3-ethynylestradiol upon plasma viteilogenin levels in male and female

rainbow troutr Oncorhynchus mykiss (Walbaum) held at two
acclimation temperatures. p. 99-112. IN: Muller, R.; Lloyd, R. (eds.).
Sublethal and Chronic Effects of Pollutants on Freshwater Fish. Fishing
News Booksr Oxford, UK.
Singh, P.B.; Singh, T.P. (1991). Impact of gamma-HCH on sexsteroid

levels and their moduiation by ovine luteinizing hormone-releasing
hormone and Mystus gonadotropin in the freshwater catfish,
Heteropneustesfossilis.Aquat. Toxicol. 21: 93-102.
Sircar, S.; Lahiri, P. (1989). Lindane (c-HCH) causes reproductive failure

and fetotoxicity in mice. Toxicol. 59:171-177.
Soto, A.M.; Justicia, H.; Wray, J.W. (1991). p-nonyl-phenol: an

estrogenic xenobiotic released from 'modified' polystyrene. Environ.
Health Perspect. 92:167-173.
Soto, A.M.; Lin, T.M.; Justicia, H.; et al. (1992). An 'in culture' bioassay
to assess the estrogenicity of xenobiotics (E-screen), p. 295-309. IN:
Colborn, T.; Clement, C. (eds.). Chemically-induced alterations in sexual
and functiona! deveiopment: the wüdlife/human connection. Advances
in modem environmental toxicology (Vol. 21). Princeton Scientific
Publishing Co., Inc., Princeton, NJ.
Soto, A.M.; Chung, K.L; Sonnenheim, C. (1994). The pesticides

endosulfan, toxaphene, and dieldrin have estrogenic effects on human
estrogen-sensitive cells. Environ. Health Perspect 102: 380-383.
Sparagana, M. (1987). Primary hypogonadism associated with o,pr-

DDD (Mitotane) therapy. Clin. Toxicoi. 25: 463-472.
Stone, R. (1994). Environmental estrogens stir debate. Science 265:

308-310.
Sumpter, J.P. (1995). Feminized responses in fish to environmental

estrogens. Tox. Lett. 82-3: 737-742.
Sumpter, J.P.; Jobling, S. (1995). Vitellogenesis as a biomarker for

oestrogenic contamination of the aquatic environment. Environ. Health
Perspect. 103: (Suppl 7): 173-178.
Tas, J.W. (1993). Fate and effects of triorganotins in the aqueous

environment. Dissertation. University of Utrecht, The Netherlands.,
205 pp.
Thomas, G.B.; McNeily, A.S.; Cibson, F.; Brooks, A.N. (1994). Effect of
pituitary-gonadal suppression with a gonadotrophin-releasing hormone
agonist on fetal gonadotrophin secretion, fetal gonadal deveiopment
and maternal steroid secretion in the sheep. J. Endocrinol. 141:
317-324.
Thomas, J.A. (1991). Toxic responses of the reproductive system. p.

484-520. IN: M.O. Amdur, J. Doull and CD. Klaassen (eds.). Casarett
and Doull's Toxicology: The Basic Science of Poisons. Pergamon Press,
New York.
Thomas, K.B.; Colborn, T. (1992). Organochlorine endocrine disruptors

in human tissue, p. 365-394. IN: Colborn, T.; Clement, C. (eds.).

Chemically-induced alterations in sexual and functional development:

the wildlife/human connection. Advances in modem environmentat
toxicology. (Vol. 21). Princeton Scientific Publishing Co., Inc., Princeton,
NJ.
Thomas, P. (1990). Effects of Arochlor 1254 and cadmium on

reproductive endocrine function and ovarian growth in Atlantic croaker.
Mar. Environ. Res. 24:179-183.
Thomas, P.; Smith, J. (1993). Binding of xenobiotics to the estrogen

receptor of spotted seatrout: a screening assay for potential estrogenic
effects. Mar. Environ. Res. 35: 147-151.
Thompson, M.A.; Lasley, B.L.; Rideout, B A ; Kasman, L.H. (1984).

Characterization of the estrogen proporties of a nonsteroidal estrogen,
Equol, extracted from urine of pregnant macaques. Biology of
Reproduction 31: 705-713.
Toppari, J.; Larsen, J.C.; Christiansen, P.; et al. (1995). Male

reproductive health and environmental chemicals wtth estrogenic
effects. Miljoprojekt. (nr.290). Ministry of the Environment and Energy,
Danish Environmental Protection Agency, Copenhagen K.
Tryphonas, L; Buttar, H.S. (1982). Genital tract toxicity of

nonoxyxnol-9 in female rats: Temporal development, reversibility and
sequelae of the induced lesions. Fundam. Appl. Toxicol. 2: 211-219.
Tryphonas, L; Buttar, H.S. (1986). Effects of the spermicide

nonoxynol-9 on the pregnant uterus and the conceptus of rat. Toxicol.
39: 177-186.
Tyler, C.R.; Everett, S. (1993). Incidences of gross morphologica!

disorders in Barbel (Barbus barbus) in three rivers in southern England.
Rev. Fish 8iol. Fish. 43: 739-748.
Umbreit, T.H.; Gallo, M.A. (1988). Physiological implications of estrogen

receptor modulation by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Tox. Lett.
42:5-14.
Umbreit, T.H.; Scala, P.L.; Mackenzie, S.A.; Gatlo, M.A. (1989).

Alteration of the acute toxicity of 2,3,7,8-tetrachiorodibenzo-p-dioxin
(TCDD) by estradio! and tamoxifen. Toxicol. 59:163-169.
Uphouse, L; Mason, G.; Hunter, V. (1984). Persistent vaginal estrus and

serum hormones after chlordecone (Kepone) treatment of adult female
rats, Toxicol. Appl. Pharmacol. 72:177-186.
Van Velsen, F.L.; Danse, L.H.J.C.; Van Leeuwen, F.X.R.; Dormans,

J.A.M.A.; Van Logten, MJ. (1986). The subchronic oral toxicity of the
(Hsomer of hexachlorocyclohexane in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 6:
697-712.
Van Wezel, A. (1995). Residue-based effects of narcotic chemicals in

fish and in lipid bilayers. Dissertation. University of Utrecht, The
Netherlands, 187 pp.
Wahlberg, C; Renberg, L; Wideqvist, U. (1990). Determination of

nonylphenol ethoxylates as their pentafluorobenzoates in water, sewage
sludge and biota. Chemosphere 20:179-195.
Xeno-oestrogene stoffen in het aquatisehe milieu 59

Waldock, M.J.; Thain J.E. (1986), Environmental concentrations of

4-nonylphenol following dumping of anaerobically digested sewage
sludges: a preliminary study of occurrence and acute toxicity. !CES CM
1986/E: 16(mimeo).
Welen, R.M.; Levin, W.; Conney, A.H. (1969). Estrogenic action of DDT
and its analogs. Toxicol. Appi. Pharmacol. 14: 358-367.
Weishons, W.V.; Rottinghaus, G.E.; Nonneman, D.J.; Dolan-Timpe, AA;

Ross, P.F. (1990). A sensitive bioassay forthe detection of dietary
estrogens in animal feeds. J.vet. Diag. Invest. 2: 268-273.
Wester, P.W.; Canton, J.H. (1986). Histopathological study of Oryzias

iatipes (medaka) after long term p-hexach!orocyclohexane exposure.
Aquat Toxicol. 9: 21-45.
Wester, P.W.; Canton, J.H. (1987). Histopathoiogical study of Poecilia

reticulata (guppy) after long-term exposure to bis tri-n-butyltin oxide
(TBTO) and di-n-butyltinchloride (DBTC). Aquat Toxicol. 10: 143-165.
Wester, P.W.; Canton, J.H. (1992). Histopathological study of Poecilia

reticulata (guppy) exposed to methyl mercury chloride. Toxicol. Pathol.
20:81-92.
Wester, P.W.; Canton, J.H.; Bisschop, A. (1985). Histopathological study

of Poecilia reticulata (guppy) after long-term fï-hexachlorocyclohexane
exposure. Aquat. Toxicol. 6: 271-296.
White, R.; Jobling, S.; Hoare, S.A.; et al. (1994). Environmentally

persistent alkylphenolic compounds are estrogenic. Endocrinology 135:
175-182.
Whitten, P.L.; Naftolin, F. (1992a). Effects of a phytoestrogen diet on

estrogen-dependent reproductive processes in immature female rats.
Steroids 57: 56-61.
Whitten, P.L.; Naftolin, F. (1992b). Xenoestrogens and neuroendocrine

development. IN: Needleman, A.L.; Bellinger, D. (eds.). Prenatal
exposure to environmental toxicants:environmental consequences. John
Hopkins University Press, Baltimore, MD, USA.
Willford, W.A. (1988). Persistent toxic substances and the health of fish
communities in the Creat Lakes. Toxic contaminants and ecosystem
health: a great iakes focus 28: 549-569.
Williams, J.; Eckols, K.; Uphouse, L (1989). Estradiol and chlordecone

interactions with the estradiol receptor, Toxicol. Appl. Pharmacol. 98:
413-421.

Bijlage 1
Fysiologie van oestrogene stoffen: de sexuele
ontwikkeling onder invloed van oestrogenen
Oestrogene hormonen en voortplanting
In vele soorten organismen zijn de rollen van oestrogene en androgene

stoffen onderzocht. Het gebruik van een groot aantal soorten
proefdieren is voor een belangrijk deel het gevolg van de wens de
hormonale regulering van geslachtshormonen bij vrouwen en mannen
te kunnen begrijpen en te kunnen beïnvloeden. Voorafgaand aan het
gebruik van chemicaliën bij zwangerschapsregulering of
geboortenbeperking zijn, en worden, op grote schaal experimenten met
proefdieren uitgevoerd. Gebaseerd op de veelheid van gegevens neemt
het inzicht toe op het gebied van de rol die verschillende hormonen
individueel, of in samenhang met andere, spelen. Voor verschillende
diersoorten zijn hormonale cycli in redelijk detail bekend, en kunnen
ontregelingen door externe invloeden worden begrepen en voorspeld,
en zelfs doelbewust worden opgewekt. Bij andere diersoorten is er
echter minder bekend; soms blijken hormonale cycli sterk afwijkend.
Bovendien blijken sommige verstoringen specifiek op bepaalde
organismen wel, en op andere geen, invloed te hebben. Het vergelijken
van de endocrinologie op het gebied van oestrogene en androgene
effecten is nog lang niet altijd mogelijk. Met name de rol die
oestrogenen en androgenen spelen bij ongewervelde organismen is
onduidelijk.
Geslachtshormonen en sexuele ontwikkeling
In gewervelde organismen worden vrouwelijke steroïd sexhormonen

voornamelijk geproduceerd in het ovarium. Oestrogenen zijn
verantwoordelijk voor het vrouwelijk fenotype van de meeste
gewervelde organismen. Bovendien reguleren zij de reproductie bij de
vrouwtjes - zo ook bij de mens. Voorafgaand aan de produktie van
oestrogenen worden in zoogdieren twee gonadotropinen afgescheiden
in de hypophyse, te weten het luteïniserend hormoon (LH) en hetfollicle
stimulerend hormoon (FSH). Een vergelijkbare fysiologie is actief bij
vissen, waarbij inmiddels ook twee gonadotropinen zijn aangetoond
(Peter, 1981). LH en FSH komen in de hypophyse vrij onder invloed van
het Genadotropin Releasing Hormone (GnRH) en het Gonadotropin
Release Inhfbitory Factor (GRIF) die beide afgescheiden worden door de
hypothalamus.
Onder invloed van LH en FSH worden in het 'hormone synthesizing
tissue' van het ovarium oestrogenen geproduceerd. Het 17(l-oestradiol
is hiervan de belangrijkste, maar zeker niet het enige. In mannetjes
zoogdieren worden oestrogenen geproduceerd in de testis waarbij de
regulering vergelijkbaar is met die van de productie in het ovarium van
vrouwtjes. Daarnaast worden bij mannetjes oestrogenen geproduceerd
in de hersenen bij de aromatiseringsreactie van testosteron.
Oestrogenen en androgenen hebben een zeer breed scala van
fysiologische werkingsmechanismen zoals de sexuele differentiatie,

Figuur 1.
Ontwikkeling van geslachtsorganen VROUW MAN
tussen genotype en fenotype In
zoogdieren. WY AANWEZIG
XX
Ka naai van Muller Kanaal van Wolff
GONADFH
TDF
GONADE TESFIS
MIH
Testosteron
OVARIUM TFSTIS
r/mi:jr. PROSTAAT EN
EXTERNE ORCANÉN
inclusief de organogenese van geslachtsorganen, en de endocriene en

fysiologische regulering van geslachtsrijpheid.
In organismen spelen oestrogenen een rol in een groot aantal

fysiologische processen. Bij zoogdieren, vissen en vogels is het meest
van belang de rol die deze stoffen spelen bij de ontwikkeling van de
geslachtsorganen en de controle van cycli van geslachtelijke
vruchtbaarheid. Bij zoogdieren en vissen bevatten normale diploïde
cellen paren van gelijke chromosomen - in de menselijke cel zijn dit er
22. Daarnaast bevat de diploïde cel nog twee chromosomen die als een
paar kunnen voorkomen X,X of als een combinatie X,Y waarbij in het
laatste geval een kleine afwijking aan een chromosoom waarneembaar
is. De XrX of de X,Y combinatie bepaalt de geslachtelijke ontwikkeling
van mensen. De orgaanontwikkeling van een embryo die een genotype
X,X cellen bevat resulteert bij zoogdieren en de meeste vissoorten tot
het vrouwelijk fenotype. De organogenese van het ovarium vindt in een
vroeg stadium van ontwikkeling plaats. Bij de menselijke embryo zijn de
eerste 42 dagen de gonaden niet verschillend, na die tijd wordt
ontwikkeling van ovarium of testis waarneembaar. Voor de differentiatie
is de aanwezigheid van genetische informatie die voor het H-Y antigen
coderen van groot belang. In aanwezigheid van deze H-Y antigen
coderende genen ontwikkelen de cellen van de gonaden zich voor een
belangrijk deel tot Leydig cellen, die karakteristiek zijn voor het
mannelijk geslachtsorgaan. De organogenese van de testis gaat gepaard
met de degeneratie van het kanaal van Muller - dit wordt gestimuleerd
door het macromolecule 'Müllerian duet inhibitory factor' dat door
Sertoli celien in de testis wordt afgescheiden. Daarnaast resulteert het in
de differentiatie van het kanaal van Wolff wat leidt tot de ontwikkeling
van de prostaat uit de urogenitale sinus, alsmede in de ontwikkeling van
de penis als extern genitaal kenmerk. De ontwikkeling van de penis is
sterk afhankelijk van de werking van testosteron, in het bijzonder de 5
alpha-gereduceerde metaboliet- het dihydrotestosteron. In de

mannelijke foetus wordt testosteron geproduceerd in de Leydig cellen -

waarschijnlijk in eerste instantie autonoom, later gestimuleerd door hCG
en LH die geproduceerd worden in de hypophyse. In afwezigheid van
H-Y antigen coderende genen, of bij onderdrukking daarvan, treedt er
geen differentiatie op van de gonaden, waar na zich automatisch een
ovarium ontwikkeld, Het kanaal van Muller ontwikkelt zich tot uterine
tubes, uterus en cervix. Bij ontwikkeling van de Müiler-duct treedt er in
principe geen ontwikkeling op van het kanaal van Wolff. Tijdens de
organogenese van het ovarium ontwikkelen gonadecellen zich eerst tot
oögonia, waarna zij in de tweede helft van de ontwikkelingstijd van het
ovarium verder ontwikkelen tot oöcyten. Zonder invloeden van
buitenaf, en in afwezigheid van een testis, resulteert de fenotype-
ontwikkeling van zoogdieren dan in de vorming van vagina en andere
vrouwelijke geslachtskenmerken.
De fenotypische ontwikkeling bij vogels wijkt sterk af van die bij andere
gewervelde organismen. In plaats van de normale ontwikkeling tot het
vrouwelijk fenotype bij de meeste gewervelde, is het primaire fenotype
bij vogels het mannetje.
De sexuele differentiatie van organismen wordt voor een belangrijk deel

bepaald door genetische factoren. Bij humane geslachtscellen zijn genen
coderend voor regulering voor geslachtsontwikkelmg gelegen op X en Y
chromosomen - diploïde XX cellen bepalen het vrouwelijk geslacht en
XY het mannelijke geslacht. De aanwezigheid van een specifiek gen (het
SRY-gen) op het Y chromosoom kan zorgen voor de synthese van het
eiwit TDF (Testis Determining Factor) dat een cruciale rol speelt bij de
synthese van androgenen in het lichaam. In aanwezigheid van het TDF
begint het kanaal van Wolff zich te ontwikkelen in een vroege fase van
de organogenese van de geslachtsorganen tot testis, Tijdens dit
ontwikkelingsproces wordt tevens het Müller-lnhibitie Hormoon (MIH)
afgescheiden, wat resulteert in een onderdrukking van de ontwikkeling
van het kanaal van Muller. Indien de sequentie van het SRY-gen, het
TDF-eiwit en het MIH hormoon afwezig is, dan ontwikkelt het kanaal
van Muller zich wel. Gonaden ontwikkelen zich dan tot ovarium,
gevolgd door de ontwikkeling van de vrouwelijke geslachtsorganen.
Deze ontwikkelingen treden veel later op dan die bij de organogenese
van mannelijke geslachtsorganen. Na de ontwikkeling van de
mannelijke testis worden door dit orgaan testosteron en
dihydrotestosteron uitgescheiden. Deze twee sexhormonen stimuleren
de proliferatie van weefsel en cellen van het kanaal van Wolff - onder
meer de ontwikkeling van een penis is hiervan het resultaat. Tevens
ontwikkelen zich in de hersenen androgeenreceptoren die in de
levensfase van geslachtsrijpheid een belangrijke rol spelen (Faber en
Hughes, 1991).
De sexuele differentiatie verloopt bij vele soorten organismen

vergelijkbaar met die van de mens. Vele diersoorten hebben normale
diploïde cellen, en zijn gonochoristisch zoals zoogdieren - zij zijn
mannelijk of vrouwelijk, waarbij het verschil is bepaald door genetische
code. In tegenstelling tot de menselijke geslachtschromosomen, is bij de
meeste diersoorten geen optisch verschil waarneembaar tussen de
mannelijke en vrouwelijke geslachtschromosomen. Bij vele andere
diersoorten is de genetische codering van geslachtskenmerken niet
beperkt tot slechts 1 chromosoom. Sommige soorten vissen, reptielen en
amfibieën bijvoorbeeld kunnen hermafrodiet zijn (hebben testis en
ovarium). Bovendien wordt de ontwikkeling van testis of ovarium niet
altijd direct gereguleerd door het eiwit TDF. De aanwezigheid van
exogene oestrogenen en androgenen kan van groter belang zijn -
misschien speelt TDF soms in het geheel geen rol (Hunter en Donaldson,

1983). Ook externe omstandigheden zoals temperatuur kunnen

bepalend zijn voor het voorkomen van fenotypische mannetjes of
vrouwtjes. Het is mogetijk dat dit veroorzaakt wordt door verschillen in
enzym-activiteiten bij verschillende temperaturen, waardoor de balans
tussen oestrogene en androgene activiteit kan verschuiven.
Doordat bij verschillende diersoorten de genetische invloed op het

fenotype beperkt is, kan het ook voorkomen dat geslachts-omkeer
optreedt in het leven van organismen. Bij vissen is dit een regelmatig
voorkomend verschijnsel. Mannelijke en vrouwelijke gonaden en
geslachtskenmerken kunnen op hetzelfde moment worden
aangetroffen, maar kunnen ook verschillen in verschillende levensfasen.
Figuur 2.
Hypothalamus - hypophyse - gonade ZOOGDIEREN

controle In zoogdieren (bovenpaneel)
en vissen {onderpaneel van HERSENEN UTERUS/VAGINA
oestradiolsynthese en oestrogene
werking. Gonadotropine Releasing
\ \
Hormone (GnRF) en Gonadotropln
GnRH GRIF
Inhibltory Factor <GR!F) reguleren OESTRADIOL
afgifte van gonadotroplnen (GtH) in
hypophyse, die op zijn beurt de
\J \
synthese en afgifte van oestradiol In
HYPOPHYSE OVARIUM
het ovarium reguleert. Verhoogde
oestradiol afgifte stimuleert
ontwikkeling vrouwelijke
geslachtskenmerken, en bij vissen (en VISSEN
soms bij amfibleën en reptielen) de
afgifte van vltellogenine door de lever. HERSENEN LEVER
\
CnRH GRIF Vitellogenine
OESTRADIOL
GtH \
HYPOPHYSE OVARIUM
Feminisatie en masculanisatie wordt voor het overgrote deel bepaald

door de aanwezigheid van hoeveelheden oestrogenen en androgenen,
alsmede door de balans hiertussen. In verschillende weefsels en cellen
hebben testosteron en oestradiol dezelfde werking. Slechts in beperkte
delen van het lichaam treden verschillen op; het gaat hierbij met name
om de aanwezigheid van deze stoffen in specifieke delen in de hersenen
en in de geslachtsorganen. Verschillen treden voornamelijk op in
weefsels waarin de activiteit van het enzym aromatase laag is - dit
enzym zet testosteron om in oestradiol door een aromatiserende
reductiereactie.
Androgenen en oestrogenen zijn op cellulair niveau actief na binding

aan specifieke receptoren, de androgeenreceptor (AR) en de
oestrogeenreceptor (ER). Tot voor kort was er weinig bekend over de
werking van de AR; meer is bekend over de ER. Beide receptoren zijn
actief in de celkem waar het hormoonreceptor1 complex bindt aan de
hormoon responsieve elementen van het DNA, voor ER en AR
respectievelijk het ERE en ARE. De oestrogeenreceptor bestaat in de
meeste diersoorten uit zes regio's. Voorzover bekend komen slechts
Xeno-oestrogene stoffen in hetaquatische milieu 64

twee van deze regio's (C het DNA bindend gedeelte en E het ligand
gedeelte) voor verschillende diersoorten voor met grote gelijkenis - voor
de andere regio's blijken grote diersoortverschillen te bestaan. Sterke
binding van oestradiol is wel gemeenschappelijk voor alle ER's. Zoals bij
veel receptoren, hebben een beperkt aantal stoffen een sterke binding
met de ER. Enerzijds kunnen kleine structuurverschillen aanleiding geven
tot grote verschillen in bindingsaffiniteit (Katzeneüenbogen et al., 1980),
anderzijds kunnen ook stoffen met totaal verschiliende moleculaire
structuur binden aan ER's (zie ook hoofdstuk 5). Ondanks vele pogingen
(Katzenellenbogen et al., 1980 en Duax en Griffin, 1987) is nog immer
niet helder welke structuur moleculen moeten hebben om sterk aan de
ER te binden.
Literatuur
Duax, W.L.; Griffin, J.F. (1987). Structural features which distinguish

estrogen agonists and antagonists. J. Steroid. Biochem. 27: 271-280.
Faber, K.A.; Hughes, Jr, C.L. (1991). The effect of neonontal exposure
to diethylstilbestroi, genistein, and zearalenone on pituitary
responsiveness and sexualiy dimorphic nucleus volume in the castrated
adult rat. Biol. Reprod. 45: 649-653.
George, F.W.; Wilson, J.D. (1994). Sex determination and

differentiation. IN: The physiology of reproduction. KNobil, E; Neill, J.D.
(eds). Raven Press Ltd New York, Chapter 1, pp 1-28.
Katzenellenbogen, J.A.; Katzenellenbogen, B.S.; Tatee, T.; Robertson,

D.W.; Landvatter, S.W. (1980). The chemistry of estrogens and
anti-estrogens: relationships between receptor binding and biological
activity. p. 305-325. IN: McLachan, J.A. (ed.). Estrogens in the
environment. Elsevier, Nortri Holland, The Netherlands.
Peter, R.E. (1981). Gonadotropln secretion during reproductive cycles in

teleosts: Influence of environmental factors. Gen. Comp. Endocrinol. 45:
294-305.

Bijlage 2
Milieuchemische en toxicologische informatie
alkylfenolen en ethoxyderivaten.
Alkylfenolethoxylaten (APE's) zijn niet-ionogene surfactanten die sedert

de jaren 40 op grote schaal in vele toepassingen gebruikt worden als
detergent, emulsificeerder, 'wetting agent' en als dispersiemiddel.
Opmerkelijk is het gebruik van nonyl- en octylfenol ethoxylaten in
zaaddodende crèmes, schuimen en pasta's.
In 1987 was het aandeel van APEs ongeveer 10% van het totale
surfactanten gebruik in de wereld. In 1988 was de jaarproductie
ongeveer 360.000 ton {Ahel et al., 1993). De surfactant werking
ontstaat door de combinatie van de hydrofobe alkylfenolgroep en de
para-gesubstitueerde polaire keten van repeterende ethyleen-oxide
fragmenten. De ethyleen-oxide keten kan 1 tot ongeveer 50 -100
fragmenten bevatten - hoe langer de keten hoe beter de oplosbaarheid
in water. Normaliter is de alkyl-groep een vertakte nonyl-octyl- of
dodecyl-keten. Nonylfenolethoxylaten komen het meest voor in
industriële toepassingen. Zij beslaan ongeveer 80% van de APE's en
worden soms ook aangeduid met de namen nonoxynol, ethononyl-
fenol, polyethyleen nonylfenol ether of nonylfenoxypoiy (ethyleenoxy)
ethanol. Octylfenolethoxylaten nemen ongeveer de resterende 20%
voor hun rekening. Nonylfenol en nonylfenolethoxylaten worden
meestal afgekort met NPE's en NPnEO's waarbij n voor het aantal
ethyleenoxide eenheden staat. Tijdens de synthese van APE's ontstaat
normaal een mengsel van homologen, oligomeren en isomeren. Bij de
synthese ten behoeve van NPnEO's voor schoonmaakdoeleinden is n
meestal volgens een Poisson verdeelt met maxima voor n gelijk aan 9 of
10. In praktijk is het vrijwel niet mogelijk een zuivere oligomeer in
handen te krijgen. Tijdens en na synthese treedt herverdeling op van
groepen waardoor een mengsel ontstaat.
Sedert het midden van de jaren 70 zijn APE's steeds minder gebruikt in
huishoudelijke schoonmaakmiddelen - de reden is gelegen in het
herhaaldelijk optreden van stabiele scbuimvorming in beken en andere
oppervlaktewateren. De toepassing van APE's voor industriële
toepassingen is echter onverminderd omvangrijk. !n vrijwel alle
toepassingen gaat het om 'open' systemen waaruit APE's vrijelijk in het
milieu kunnen komen (CES, 1993).
Naast het gebruik van NPE als surfactant is met name in Duitsland,
trisnonylfenolfosfiet gebruikt als anti-oxidant in plastics en als barium of
cadmium-zout als stabilisator in PVC (CES, 1993). Deze toepassing is in
de meeste andere landen niet gebruikelijk.
Door het wijdverspreide gebruik en de vele toepassingen komen APE's

op vele vaak diffuse manieren in het milieu, waarbij in vrijwel alle
gevallen oppervlaktewater het ontvangende medium is. Op basis van de
chemische structuur mag verwacht worden dat biodegradatie door
micro-organismen een belangrijke rol speelt in de lotgevallen van deze
stoffen (Dorn, 1993; Maki et al., 1994).
De eerste stap in de afbraak van APE's is de hydrolytische verwijdering

van de ethoxylaat-fragmenten. Deze stap verloopt snel en resulteert in

de vorming van alkylfenolen, alkylfenol-mono-ethoxylaten en
alkylfenol-di-ethoxylaten, zoals voor NPnEO is aangetoond (Naylor,
1992). De afbraak van NP, NP1 EO en NP2EO verloopt aanmerkelijk
trager (Brunner, 1988), Een mogelijke metabole omzetting is de
carboxylering van het terminale koolstofatoom van de ethoxylaatgroep
(Ahel et al., 1994). De primaire metabolieten van NPnEOs zijn door de
afsplitsing van de ethoxylaatketen dus hydrofober dan de
uitgangsstoffen. Door sorptie aan sediment of organisch materiaal wordt
de biologische beschikbaarheid een belangrijk deel van de gevormde
stoffen beperkt waardoor de afbraak wordt gehinderd. Zelfs in
afvalwaterzuiveringsinstallaties kan daardoor een belangrijk deel van de
APE's uiteindelijk overblijven als alkylfenol. Giger en medewerkers
(1984) toonden restconcentraties aan van 0,45 tot 2,53 g/kg droge stof,
in afvalwaterzuiveringsinstaSlaties. Door Brunner (1988) is geschat dat
ongeveer 50% van de hoeveelheid NPE's die een zuiveringsinstallatie
ingaat uiteindelijk overblijft als NP. Tijdens een workshop in Veldhoven
over surfactantia in 1993 (Fate and Effects of Surfactants) is door de
aanwezige deskundigen unaniem aangegeven dat dit een overschatting
van de residue-concentratie is. Een percentage van maximaal enkele
procenten werd realistischer geacht.
Desondanks worden relatief hoge restconcentraties gerapporteerd in
effluenten van waterzuiveringsinstallaties, in het begin van de jaren 80
rapporteerde Giger en medewerkers (1984) in enkele Zwitserse
effluenten concentraties tussen de 36 en 202 microgram per liter water
(1982) voor NP, NP1EO en NP2EO. In recent onderzoek in Engelse
afvalwaterzuiveringsinstallaties rapporteerde Blackbum en medewerkers
(1995) concentraties tot 180 microgram per liter in riviermonsters nabij
effluenten.
De verschillende studies naar restconcentraties in effluenten van
waterzuiveringsinstallaties toont aan dat oppervlaktewateren nog steeds
in aanzienlijke mate belast kunnen worden met APE's, in het bijzonder
met NP.
Het hydrofobe karakter van nonylfenol is een drijvende kracht achter

sorptie en bioaccutnulatie.
Bioaccumulatie: In studies (Ward en Boeri, 1991) metfathead minnow

zijn bij respectievelijk blootstellingsconcentraties van 4,9 en 22,7
microgram NP per liter bioconcentratiefactoren van 270 l/kg en 340
l/kg aangetoond na 20 dagen blootstelling. Steady state concentraties
werden gevonden na ongeveer 10 dagen bij continue blootstelling.
Berekende opnamesnelheidsconstanten waren respectievelijk 133 ml/g
per dag en 193 ml/g per dag. Deze waarden zijn iets lager (factor 5) dan
voor hydrofobe stoffen zoals chloorbenzenen en PCB's. De eliminatie-
snelheidsconstanten waren na de lage en de hoge blootstellingscondities
respectievelijk 0,49 en 0,50 per dag. De biologische halfwaardetijd is
derhalve iets meer dan een dag. Vergelijkbare resultaten zijn verkregen
in studies van Ekelund et al. (1990) (bioaccumulatiefactor van 300 l/kg).
Sorptie; In een studie naar de sorptie van NP in bodem zijn

experimenten uitgevoerd met drie typen bodem (Weston, 1990). De
bodems hadden organisch koolstof gehalten van respectievelijk 0,82 ,
10,2 en 8,6%, De kation exchange capacity was respectievelijk 28,4 ,
46,2 en 24,6 meq/100 g. De sorptie data bleken het best overeen te
komen met Freundlich isothermen. In de bodem met het hoogste
organisch koolstof gehalte bleek een eenvoudig partitie model de data
goed te verklaren. De sorptie coëfficiënt was daarbij 2.300 l/kg. De
organisch koolstof genormaliseerde sorptiecoëfficiënt was ongeveer

23.000 l/kg. In tegenstelling tot dat wat veelal wordt gevonden voor
hydrofobe stoffen bleken de bodems met lagere organisch koolstof-
gehalten iets hogere sorptiecoëfficiënten op te leveren tijdens de testen
(factor 2 hogere sorptie coëfficiënt).
Of de gevonden waarden voor bioaccumulatie en sorptie vergelijkbaar
zijn voor NP als die voor stoffen met vergelijkbare hydrofobiteit is helaas
moeilijk aan te geven. Dit wordt veroorzaakt doordat de twee veel
gebruikte parameters voor hydrofobiteit, de oplosbaarheid in water en
de octanol/water partitie coëfficiënt, niet goed te bepalen zijn vanwege
de oppervlakte-actieve werking van de stoffen. Bepalingen van de
octanol/water partitie coëfficiënt van 4-nonylfenol bij verschillende pH
en zoutcondities leverden waarden van log Kd,oct/w tussen de 3,7 en
de 4,8 (Weston, 1990). De gebruikte testconcentratie had sterke invloed
op de resultaten.
Zoogdiertoxicologie: De acute toxiciteit van APE's voor zoogdieren in

niet groot; de orale LD50 waarden voor ratten en muizen variëren
tussen de 2 en 4 g/kg. Bij lagere doseringen (5 tot 500 mg) op de huid
van zoogdieren is vaak huidirritatie waargenomen, evenals ernstige
oogirritatie na doseringen in dezelfde range.
Directe humane blootstelling is in principe beperkt tot de toepassing van
nonoxynol-9 als spermaticide. Uit onderzoek is gebleken dat deze stof,
en zijn metabolieten, bij intravaginale dosering snel opgenomen worden
in het bloed (Chvapi! et al., 1980). Hoewel in deze studie voornamelijk
het nonoxynol-9 met de negen ethyleenoxide-fragmenten bleek te
worden opgenomen en uitgescheiden via de urine, werd ook
aangetoond dat nonylfenol en geglucoronideerde metabolieten
voorkwamen zoals ook reeds eerder was aangetoond door Knaak et al.
(1966).
Hoewel in ratten ongeveer 50% van het nonoxynol in 6 dagen wordt
afgebroken na orale dosering, blijken deze stof en zijn metabolieten
reeds twee uren na dosering voor te komen in moedermelk van
[acterende vrouwtjes. In niet-lacterende vrouwtje biijkt ongeveer 50%
van de dosering te bioaccumuleren in spierweefsel (Chvapil et al., 1980).
De spermaticide werking van nonoxynol-9 is gebaseerd op de
membraan-oplossende eigenschappen van deze oppervlakte-actieve
stof. Bij doseringen die 20 keer zo hoog zijn als de klinische dosis van
2,5 mg/kg treedt ernstige aantasting en etsing van epitheel weefsel van
vagina, cervix en uterus op (Tryphonas en Buttar, 1982 en 1986). Bij
klinische doses in de eerste week van zwangerschap trad bij ratten
embryotoxiciteit op. Het aantal implantaties verminderde drastisch,
mogelijk een gevolg van de veranderende structuur van het
oppervlakteweefsel. Naast verminderde implantatie trad bij dosering tot
250 mg/kg extra rib-vorming op bij de nakomelingen (Meyer et al.t
1988). Bij meer realistische dosering (40 mg/kg en Sager) werd geen
duidelijk vermindering van reproductiesucces en misvorming
waargenomen (Abrutyn et al., 1982), Bij doseringen van vergelijkbaar
lage doses octoxynol-9 werden evenmin schadelijk effecten
waargenomen (Saad et al., 1984). De mogelijke rol van APE na gebruik
als spermaticide bij humane teratogenese is voor het eerst gesuggereerd
in 1981 door i\ck en medewerkers (1981). In deze studie werd een
verband gelegd tussen congenitale misvormingen en het gebruik van
APE-spermaticides. Laboratorium bevestiging van deze studies is echter
niet verkregen. Bovendien is de studie van Jick en medewerkers in 1989
geëvalueerd door Manjuck (1989) die concludeerde dat eerdere
conclusies getrokken waren op basis van onjuiste statistische
methodieken en foutief geïnterpreteerde data. Nieuwe evaluatie van de
data gaf geen aanleiding tot het suggereren van een verband tussen het
gebruik van APE-spermaticides en reproductiestoornissen. In de Ames

test (Meyer et al,, 1988), is geen Indicatie gevonden voor een mogelijke
mutagene werking van nönoxynol-9, en zijn metabolieten. Ook in
studies naar mogelijke DNA-schade is geen indicatie gevonden voor
mogelijke genetische effecten van APE blootstelling (Buttar et al., 1986).
In studies met een muizen-embryo cellijn zijn echter wel nonoxynol-9
geïnduceerde transformaties waargenomen (Long et al,, 1982), In welke
mate eventuele genetische transformaties van belang zijn voor
ontregeling van de organogenese of andere reproductie-effecten is nog
steeds niet helder.
Ecotoxicologie: Zoals vrijwel alle oppervlakte-actieve stoffen zijn APEs

erg toxisch voor aquatische organismen. Hierbij lijkt te gelden dat de
toxiciteit toeneemt met toenemende hydrofobiteit van de APE
(McCleese et al., 1981). Kortere ethoxyleenketen, dan wel langere
alkylketen, zorgt voor snellere opname en tragere eliminatie van
hydrofobe stoffen en daarmee tot grotere bioaccumulatie. De 48 uurs
LC50 van nonylfenol is bij voorbeeld 1,4 mg/l voor de Japanse Medaka,
terwijl die voor NP-9-EO 11,2 mg/l is en 110,0 mg/l voor NP-16-EO
(Yoshimura, 1986). In twee rapporten zijn de afgelopen jaren
toxicteitsdata samengevat (CES, 1993; Naylor, 1992). Op basis van
beschikbare rapportages wordt een No Observable Effect Concentration
tussen de 6,7 en 24 microgram per liter gesuggereerd voor nonylfenol in
de invertebraten Mysidopsis bahia en Daphnia magna. De EC 50 is
ongeveer een factor 10 hoger (180 microgram per liter). De 96-uurs
LC50 voor de groene alg Skelatonema costatum is ongeveer 27
microgram per liter, terwijl die voor vissen (voornamelijk zalmachtigen)
130 tot 480 microgram per liter is. Indien uitgegaan wordt van een
bioconcentratie van ongeveer 500 g/ml in een testperiode van 4 dagen,
dan is de interne letale concentration (letale body burden) tussen de 65
en 240 kg/gram voor nonylfenol, oftewel tussen de 0,3 en 1,0 tnmol/g.
Dit laatste getal komt overeen met de letale body burden van andere
stoffen die bekend staan als polair narcotiserend (Van Wezel, 1995). Het
is dus de vraag of letaliteit veroorzaakt wordt door ontkoppeling van de
energie-produktie voor de cel zoals recent is gesuggereerd (Argese et
al., 1994). Een meer algemeen narcotiserend effect lijkt plausibeler.
Echter dat ontkoppeling van de energieproduktie op kan treden is wel
aangetoond. Hierbij is gebleken dat NP en NP1EO ontkoppeling
veroorzaken bij ongeveer dezelfde blootstellingsconcentratie. De
gecarboxyleerde metaboliet (het NP1 EC) was even actief bij een 5 keer
hogere blootstellings-concentratie (8,2 mg/l) (Argese et al., 1994).
Literatuur
Abrutyn, V.M.D.; McKenzie, D.V.M.; Nadaskay, B.S. (1982). Teratology

study of intravaginatly administered nonoxynol-9-containing
contraceptive cream in rats. Fertil. Steril. 37: 113.
Ahel, M.; McEvoy, J.; Gtger, W. (1993). Bioaccumulation of the

lipophilic metabolites of nonionic surfactants in freshwater organisms.
Environ. Pollut 79: 243-248.
Ahel, M.; Hrsak, D.; Giger, W. (1994). Aerobic transformation of

short-chain alkylphenol polyethoxylates by mixed bacterial cultures.
Arch. Environ. Contam, Toxicol. 26: 540-548.

Argese, E.; Marcomini, A.; Miana, P.; Bettiol, C; Perin, G. (1994).

Submitochondrial particle response to linear alkytbenzene sulfonates,
nonylphenol polyethoxylates and their biodegradation derivatives.
Environ. Toxicol. Chem. 13: 737-742.
Blackburn, M.A.; Waldock, M.J. (1995). Concentrations of alkylphenols

in rivers and estuaries in England and Wales. Wat. Res. 29:1623-1629.
Brunner, P.H.; Capri, S.; Marcomini, A.; Giger, W. (1988). Occurrence

and behaviour of linear alkylbenzenesulphonates, nonylphenol,
nonylphenol mono- and nonylphenol diethoxylates in sewage and
sewage sludge treatment. Wat. Res. 22:1465-1472.
Buttar, H.S.; Swierenga, S.H.H.; Matula, T.l. (1986). Evaluation of the

cytotoxicity and genotoxicity of the spermicides nonoxynol-9 and
octoxynol-9. Tox. Lett. 31: 65-73.
CES (1993). Uses, fate and entry into the environment of nonylphenol
ethoxylates. Kent Consultants Environ Sci Ltd.
Chvapil, M.; Eskelson, C.D.; Stiffet, J.A.; Owen, J A ; Droegemuller, W.

(1980). Studies on nonoxynol-9. II Intravaginal absorption, distribution,
metabolism and excretion in rats and rabbits. Contraception 22: 325-
339.
Ekelund, R.; Bergman, A.; Granmo, A.; et al. (1990). Bioaccumulation of

4-nonylphenol in marine animals-a re-evaluation. Environ. Pollut 64:
107-120.
Giger, W.; Brunner, P.H.; Schaffner, C. (1984). 4-nonylphenol in

sewage sludge: accumulation of toxic metabolites from nonionic
surfactants. Science 225: 623-625.
Jick, H.; Walker, A.M.; Rothman, K.J.; et al. (1981). JAMA245: 1329-
1332.
Knaak, J.B.; Eldridge, J.M.; Sullivan, L.J. (1966). Excretion of certain

polyethylene glycol ether adducts of nonylphenol by the rat. Toxicol.
Appl. Pharmacol. 9: 331-340.
Maki, H.; Masuda, N.; Fujiwara, Y.; lker M.; Fujlta, M. (1994).
Degradation of alkylphenoi ethoxylates by Pseudomonas sp. strain
TROL Appl. Environ.Microbiol. 60: 2265-2271.
Manjuck, J.E. (1989). Relationship of vaginal spermicides of birth

defects. J. Flla Med. Assoc, 76: 316-321.
McLeese, D.W.; Zitko, V.; Sergeant, D.B.; Bunidge, L; Metcalfe, CD.

(1981). Lethality and accumulation of Alkylphenols in aquatic fauna.
Chemosphere 10: 723-730.
Meyer, O.; Andersen, P.H.; Hansen, E.V.; Larsen, J.C. (1988).

Teratogenicity and in vitro mutagenicity studies on nonoxynol-9 and
-30. Pharmacol. Toxicol. 62: 236-238.
Nayler, G.C.; Mierure, J.P.; Weeks, J.A.; Castaldi, R.J.; Romana, R.R.
(1992). Alkylphenoi ethoxylates in the environment. J. Am. Oil Chemist
Soc. 69: 695-703.

Saad, D.J.C.; Kirsch, R.M.; Kaplan, L.L; Rodwell, D.E. (1984).

Teratology of intravaginally administrered contraceptive jelly containing
octoxynol-9 in rats. Teratotogy 30: 25-30.
Tryphonas, L.; Buttar, H.S. (1982). Genital tract toxicity of

nonoxyxnol-9 in female rats: Temporal development, reversibility and
sequelae of the induced lesions. Fundam. Appl. Toxicol. 2: 211-219.
Tryphonas, L; Buttar, H.S. (1986). Effects of the spermicide

nonoxynol-9 on the pregnant uterus and the conceptus of rat. Toxicol.
39: 177-186.

Bijlage 3
Concentraties van enkele 'xeno-oestrogene'
stoffen in Nederlandse watersystemen.
stof |aartal compartiment concentratie artikel
dodecylfenol? 1992 zeevogels (veren) _ Sula 6 (1)1992

nonylfenol 1991 zeevogels (veren) 9,7 mg/kg Sula5(3)1991
C6-feno! 1990 Rijnwater <0,1 ug/l (max. 0,2) RIWA jaarrapport 90-91
t-butylfenol 1990 Rijnwater <0,1 ug/l (max. 0,1) RIWA jaarrapport 90-91
C9-feno! 1989 Maaswater 0,1 ug/l (max. 0,9) RIWA jaarrapport 89-92
C9-feno! 1990-1991 Maaswater 0,2 ug/l (max. 1,0) RIWA jaarrapport 89-92
C7-fenol 1990-1991 Maaswater <0,1 ug/l (max. 0,5) RIWA jaarrapport 89-92
dibenzo(ah)antraceen 1993 bodem ca. 10 ug/kg CCRX-jaarverslag

dibenzo(ah)antraceen 1991 lagere org. Rijn <0,006 mg/kg MO 91-205 RIVO
dibenzo(ah)antraceen 1991 garnalen/mosselen <1 ug/kg LAC jaarverslag
d ibenzo(ah)antracee n 1990-1991 Rijnwater 0,01 ug/l (max. 0,02) RIWA jaarrapport 90-91
dibenzo(ah)antraceen 1990-1991 IJsselmeerwater <0,01 ug/l RiWA jaarrapport 90-91
dibenzo(ah)antraceen 1989-1992 Maaswater <0,01 ug/l (max. 0,04) RIWA jaarrapport 89-92
dibenzo(ah)antracee n 1993 Rijnwater max. 0,01 ug/l RIWA jaarrapport 1993
dibenzo(ah)antraceen 1993 Maaswater 0,01 ug/l (max. 0,20) RIWA jaarrapport 1993
Sp,p-DDT 1978-1980 vis (gewichtsbasis) 0,82-1,4 mg/kg CA 81-05 RIVO 1981

Sp,p-DDT 1977-1985 rode aal (gew. basis) 260-352 ug/kg MO 86-02 RIVO
£p,p-DDT 1992 kabeljauwlever 889-484 ug/kg jaarverslag RIVO
Sp,p-DDT 1992 rode aal (gew. basis) tot 193 ug/kg jaarverslag RIVO
Sp,p-DDT 1988 aal/voorn tot 150 ug/kg MO 88-01 RIVO
2p,p-DDT 1991 lagere org. Rijn tot 0,3 ug/kg MO 91-205 RIVO
Sp,p-DDT 1991 blankvoorn/spiering tot 0,94 ug/kg MO 91-205 RIVO
2p,p-DDT 1992 rode aal tot 270 ug/kg visserij RIVO/DLO
Ip,p-DDT 1993 rode aal tot 241 ug/kg visserij RIVO/DLO
Sp,p-DDT 1993 aal (Maas) 14 ug/kg organohal.verb. RIVO
Sp.p-DDT 1992 aal (Maas) 17 ug/kg MO 920205 RIVO
Sp,p-DDT 1990 rode aal tot 374 ug/kg jaarverslag RIVO
2p,p-DDT 1990 scholvlees tot 0,61 ug/kg jaarverslag RIVO
Ip,p-DDT 1991 kabeljauwlever tot 300 ug/kg jaarverslag RtVO
Sp,p-DDT 1991 rode aal tot 360 ug/kg jaarverslag RIVO
totaal DDT 1992 paling (Twentekan.) tot 220 ug/kg Inspectie gezondh.
totaal DDT 1991 vee ca. 0,10 mg/kg vet LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 tong 1,9 ug/kg LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 kabeljauw 0,9 |Jg/kg LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 haring 16 ug/kg LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 garnalen 0,5 ug/kg LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 mosselen 2,2 ug/kg LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 snoekbaars 3,7 ug/kg LAC jaarverslag
totaal DDT 1991 aal 210 ug/kg LAC jaarverslag
p,p-DDT 1991-1992 Maaswater <0,01 ug/l RIWA jaarverslag 89-92
p,p-DDT 1993 Rijn- en Maaswater <0,01 ug/l RIWA jaarverslag 1993

stof Jaartal compartiment concentratie artikel
6-HCH 1978-1980 vis (gewichts basis) geen CA 81-05 RIVO 1981

ft-HCH 1992 kabeljauwlever 2,6-13 ug/kg jaarverslag RIVO
B-HCH 1992 rode aal (gew. basis) tot 120 ug/kg jaarverslag RIVO
(Ï-HCH 1988 aal/voorn tot 310 ug/kg MO 88-01 RIVO
ft-HCH 1991 lagere org. Rijn tot 0,40 ug/kg MO 91-205 RIVO
li-HCH 1991 blankvoorn/spiering tot 4,2 ug/kg MO 91-205 RIVO
ft-HCH 1992 rode aal tot 15 MgAg visserij RIVO/DLO
6-HCH 1993 rode aal tot 9,6 ug/kg Visserij RIVO/DLO
G-HCH 1993 aal (Maas) 1,1 ug/kg organohal. verb. RIVO
6-HCH 1992 aal (Maas) 1,9 ug/kg MO 92-205 RIVO
ft-HCH 1990 rode aal tot 20 ug/kg jaarverslag RIVO
S-HCH 199Q scholvlees tot 0,29 yg/kg jaarverslag RIVO
B-HCH 1991 kabeljauwlever tot 8,7 ug/kg jaarverslag RIVO
B-HCH 1991 rode aal tot 42 ug/kg jaarverslag RIVO
ft-HCH 1992 zoet/zee water sterk gedaald IPCS
ft-HCH 1988 sediment 9-214 ug/kg dr.st IPCS
6-HCH 1981 stortplaatsen 30-15- ug/kg dr.st. IPCS
6-HCH 1970-80 voedsel/bloed IPCS
B-HCH 1992 paling (Twentekan.) tot 277 ug/kg Inspectie gezondh.
B-HCH 1991 vee ca. 0,02 mg/kg vet LAC jaarverslag
B-HCH 1991 kabeljauw 0,2 ug/kg LAC jaarverslag
15-HCH 1991 haring 2,4 ug/kg LAC jaarverslag
ft-HCH 1991 garnalen 0,3 ug/kg LAC jaarverslag
ft-HCH 1991 mosselen 0,2 ug/kg LAC jaarverslag
ft-HCH 1991 snoekbaars 0,4 ug/kg LAC jaarverslag
B-HCH 1991 aal 26 ug/kg LAC jaarverslag
B-HCH 1991 Rijnwater <0,01 ug/kl RIWA jaarverslag 90-91
B-HCH 1993 Rijn- en Maaswater max. 0,01 ug/l RIWA jaarverslag 1993
methoxychloor 1991 vee <0,05 mg/kg vet LAC jaarverslag

Ministerie van Verkeer en Waterstaat
Directoraat-Generaal Rijkswaterstaat
Rijksinstituut voor Kust en Zee/fiHCZ
Aan
Geadresseerde
Contactpersoon Doorkiesnummer
Dr. A.D. Vethaak 0118-672311
Datum Bijlage(n)
30-05 1997 1
Ons kenmerk Uw kenmerk
RIKZ/OS
Project
STOF*VELD
Onderwerp
Aanbieding rapport RIKZ 96.015
Geachte heer/mevrouw,
Dat er onlangs een verhitte discussie in de media en de wetenschappelijke wereld is ontstaan over
de zogenaamde oestrogenenhypothese zal u waarschijnlijk niet zijn ontgaan. De omstreden
hypothese houdt in dat bepaalde stoffen in plastics, bestrijdingsmiddelen en allerlei industriële
producten kunnen fungeren als hormonen, met als mogelijk gevolg dat zij het endocriene systeem
van organismen nadelig beïnvloeden. Vooral de mogelijke relaties tussen enerzijds de
blootstelling aan zogenaamde xeno-oestrogene stoffen en anderzijds de vermindering van de
kwaliteit van mannelijk sperma of de verhoogde incidentie van bepaalde vormen van kanker, zijn
op dit moment belangrijke onderwerpen in het humane onderzoek. Niet alleen de menselijke
gezondheid is in het geding, ook in de natuur worden opmerkelijke veranderingen waargenomen.
Er zijn soorten die tekenen van vervrouwelijking vertonen en andere die van geslacht veranderen.
Ook effecten op het immuunsysteem en het gedrag vormen een onderdeel van de discussie.
In Nederland zijn er duidelijke aanwijzingen dat zich effecten van oestrogene en ander
hormoonverstorende stoffen voordoen. Eerder is u het verslag van de studiedag "Oestrogeen-
actieve stoffen in het milieu" toegestuurd, dat een overzichtelijk beeld geeft van de vorderingen
van het onderzoek in Nederland op dit terrein.
In de onderhavige studie is de geringe kennis van het voorkomen van xeno-oestrogene stoffen
in het Nederlandse watermilieu in kaart gebracht. Op grond van de literatuur worden de
belangrijkste stoffen en stofgroepen behandeld die van belang kunnen zijn voor de Nederlandse
situatie. De studie is uitgevoerd in het kader van het onderzoekprogramma "Toxische stoffen"
dat het RIKZ samen met het RIZA uitvoert in opdracht van de hoofddirectie van Rijkswaterstaat.
OSC97.9
Vestiging Middelburg Telefoon 01180-72200
Postbus 3039, 4 3 3 0 EA Middelburg Telefax 01180-16500
Bezoekadres Grenadlerweg 31
Bereikbaar 20 minuten loopnfstand vanaf station Middelburg ridltJnj industriegebied Amuteln, trelnttxl
RIKZ/OS
Om een wetenschappelijk onderbouwde uitspraak te kunnen doen over de waarschijnlijkheid van

reproductiestoomissen in organismen in Nederlandse wateren als gevolg van blootstelling aan
xeno-oestrogene stoffen is nader onderzoek dringend gewenst. Voor verdere invulling van dit
onderzoek zijn in het rapport verschillende aanbevelingen opgenomen. Inmiddels is R1KZ in
samenwerking met PJZA, RIVO en LUW en een aantal andere instellingen in Nederland en
Engeland begonnen met een intensief onderzoek naar deze nieuwe problematiek van hormoon-
ontregelende stoffen. Wij zullen u in de nabije toekomst blijven informeren over de diverse
producten die in dit verband door het RIKZ zullen worden gepubliceerd.
Ik hoop dat de informatie, die in dit rapport is gebundeld, een bijdrage levert aan de
beleidsonderbouwing van maatregelen die de risico's van hormoonverstorende stoffen in de
Nederlandse situatie zullen beperken.
Als het rapport aanleiding is om meer over bepaalde aspecten van deze nieuwe problematiek te
weten te komen, dan kuntu inlichtingen verkrijgen bij Dr. Dick Vethaak (telefoonnummer 0118-
672311) van mijn dienst.
Hoogachtend,
de hoofdingenieur-directeur,
namens deze, fl
prof.dr. J. Drotfki
View publication stats

Xeno Oestrogene Stoffen in Het Aquatische Milieu in Nederland Een Verkennende

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Xeno Oestrogene Stoffen in Het Aquatische Milieu in Nederland Een Verkennende

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu in Nederland: een

Technical Report · December 1996

Andre Dick Vethaak Antoon Opperhuizen

SEE PROFILE SEE PROFILE

ICON prject View project

Human health hazards of exposure to micro- and nanoplastics View project

The user has requested enhancement of the downloaded file.

Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ

In het kader van de voorbereiding en de uitvoering van beleid op het

De studie is grotendeels gebaseerd op een literatuurstudie die het

Uitgebreide samenvatting met conclusies en aanbevelingen 5

2 Ontregeling van geslachtshormonen 17

3 Waarnemingen van oestrogene werking van stoffen 19

5 Xeno-oestrogenen: welke zijn belangrijk? 33

5.2 Relatieve potentie van xeno-oestrogene stoffen 34

6 Stoffen die van belang zijn voor het milieu in Nederland 39

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

In dit rapport wordt een verkennend onderzoek beschreven naar het

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

Uitgebreide samenvatting met conclusies en

De potentiële bedreiging die hormoonverstorende stoffen, en meer in

Afbakening en Inhoud van de studie

In deze literatuurstudie zal de nadruk bijna uitsluitend liggen op in het

1) het inventariseren van milieuvervuilende stoffen die aantoonbaar

Ontregeling van de endocrinologie van geslachtshormonen

De reproductie bij alle gewervelde en diverse ongewervelde dieren

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

steroiden zijn van vitaal belang bij het vrouwelijke voortplantings-

De werking van direct oestrogene stoffen heeft hoofdzakelijk plaats

Screeningsmethoden voor oestrogene stoffen

In de literatuur is van tientallen stoffen die in het milieu voorkomen

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

luciferase reporter gen (CALUX: Chemical-Activated Luciferase Gene

Behalve de in vitro bioassays worden testen met intacte organismen

Stoffen die van belang zijn voor het Nederlandse milieu

In Nederland is weinig tot niets bekend over de mate waarin xeno-

Nader onderzoek naar de effecten van xeno-oestrogene stoffen is vooral

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

oestrogene effecten veroorzaken. Het optreden van additieve en

Aangezien in de literatuur nog maar weinig bekend is over de

Het is eveneens van belang kennis te vergaren over hormoon-

Er is ten slotte dringend behoefte aan monitorïng van reproductie-

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

Xeno-oestrogens in the Dutch aquatic environment: an inventory

This inventory, undertaken by the National Institute for Coastal and

The aims of this inventory study are:

Summary of the main findings in the study

In the Netherlands, little attention has so far been paid to formulating

As far as the important xeno-oestrogens recorded in the international

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu

phthalates, biphenol-A, o,p'-DDT, o,p'-DDE, natural oestrogens (17(3-

There are many other compounds for which there is insufficient

Research into oestrogenic sensitivity tests has resulted in the

In addition to in vitro bioassays, in vivo tests have been used to detect

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu 10

In the Netherlands, experiments to detectthe presence of sources of

Research is also needed into the biodegradability of some xeno-

The real risk that xeno-oestrogens and other endocrine disrupting

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu 11

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu 12

Oestrogene en androgene stoffen zijn geslachtshormonen die door

In de afgelopen jaren zijn er steeds meer publikaties verschenen waarin

Xeno-oestrogene stoffen in het aquatische milieu 13