Chương 2

PHƯƠNG PHÁP LẤY, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU KIỂM

NGHIỆM VI SINH
2.1 Đặc điểm của mẫu
Trong mẫu thực phẩm vi sinh vật hiện diện ở mật độ thấp và không có sự phân bố
đồng đều trong mẫu
Trong quá trình chế biến thực phẩm vi sinh vật trong nguyên liệu và bán thành phẩm
thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánh
sáng…), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muối, dung môi, …) được
sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của vi sinh vật trong quá trình
chế biến. Sự tổn thương và sức sống yếu của các vi sinh vật cần phát hiện có thể làm sai
lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật.
Do vậy, hầu hết các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước và trong thực phẩm
đều có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn thương
và bước nuôi tăng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đối của vi sinh vật cần
phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác.
2.2 Phương pháp lấy và bảo quản mẫu
Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm
quan và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong công
tác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thực phẩm
sau này. Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu mặc dù
được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm nhưng lại là công đoạn rất quan trọng trong
quá trình thử nghiệm. Mọi sai sót trong công đoạn này đều có thể dẫn tới những sai lệch
nghiêm trọng kết quả thử nghiệm.
2.2.1 Nguyên tắc lấy mẫu
Việc lấy mẫu phải đảm bảo 02 điều kiện sau:
- Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng hay nơi lấy mẫu và được nhận dạng rõ ràng.
- Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ khi
lấy mẫu đến khi phân tích.
Khi lấy mẫu cần lưu ý các nguyên tắc sau:
- Người lấy mẫu đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng (tài liệu luôn có thể
sẵn dùng).
Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùng
một loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng một kích
thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình công nghệ.
- Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không và kiểm tra
tình trạng bao bì của lô hàng đó.
- Mẫu thực phẩm phải có tính chất đại diện cho cả một lô hàng thực phẩm đồng nhất.
- Tỉ lệ lấy mẫu từ 0,5 ÷1,0% tùy theo số lượng, nhưng mỗi lần không ít hơn lượng
cần thiết để phân tích.
- Mẫu hàng lấy để đưa đi kiểm phải là mẫu trung bình. Nghĩa là sau khi chia thành lô
hàng đồng nhất, mẫu sẽ lấy đều ở các góc, ở các phía trên dưới, giữa lô hàng và trộn đều.
- Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm. Mẫu kiểm của một lô hàng
lớn hơn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫu bao gói rồi tối thiểu
cần 100 g. Với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm còn nguyên mới được dùng để phân
tích. Đối với dạng lỏng (nước dùng trong chế biến, nước mắm..): 500ml…
- Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp.
- Dụng cụ lấy mẫu, bảo quản mẫu phải được tiệt trùng
- Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãn mẫu.
- Trên mẫu cần ghi:
+ Tên mẫu
+ Người lấy mẫu
+ Tên và địa chỉ nhà sản xuất
+ Số lượng mẫu lấy
+ Địa điểm, thời gian lấy mẫu.
Bảng 2.1 Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích
STT Tên thực phẩm Lượng mẫu Đơn vị

1 Thịt và các sản phẩm của thịt 100 gram

2 Cá, tôm, cua (nguyên con) 200 ÷ 500 gram

3 Trứng 5 ÷ 10 Quả

4 Nước mắm, nước chấm 500 ÷ 750 ml

5 Dấm 500 ÷ 750 ml

6 Sữa tươi 500 ÷ 750 ml

 7 Dầu, mỡ 500 ÷ 750 ml

8 Rượu các loại 750 ÷ 1000 ml

9 Bột ngũ cốc, sản phẩm của bột 250 ÷ 500 gram

10 Bánh, mứt, kẹo 250 ÷ 500 gram

11 Gia vị, muối 50 ÷ 100 gram

12 Phẩm màu 20 ÷ 50 gram

13 Đồ hộp, nước giải khát 5 ÷ 10 hộp, chai

Tùy theo lô hàng và yêu cầu kiểm nghiệm, thực phẩm có thể lấy nhiều hơn mức trên.
2.2.2 Kế hoạch lấy mẫu
* Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M
- Số mẫu được phép nằm trong khoảng giữa m và M (c);
- Số lượng mẫu cần thử (n);
- Giới hạn vi sinh vật, m & M
+ Chấp nhận (acceptable) (< m)
+ Ngưỡng lân cận giới hạn (Marginally acceptable) (> m and < M)
+ Không chấp nhận (Unacceptable) (> M);
Các loại kế hoạch lấy mẫu: Kế hoạch hai thuộc tính và kế hoạch ba thuộc tính.
* Kế hoạch hai thuộc tính
- Chỉ nêu ra m
- Nếu tất cả các mẫu  m hoặc  c mẫu trong số n mẫu thử > m thì chấp nhận lô
hàng, nếu > c mẫu trong số n mẫu thử > m thì từ chối lô hàng
* Kế hoạch ba thuộc tính
- Đặt ra cả m và M
- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP
- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và không chấp
nhận được
 - Nếu tất cả các mẫu  m hoặc  c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng > m
và  M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu > c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >
m và  M hoặc có một mẫu > M thì từ chối lô sản phẩm
* Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu
Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vi sinh vật quan tâm không được phép có trong
thực phẩm. Nếu cho phép một số lượng nhất định vi sinh vật trong một đơn vị thể tích thì
thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính.
VD: Số mẫu phải kiểm tra và giới hạn vi khuẩn cho thịt và thủy sản
Bảng 2.2 Giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong thịt và sản phẩm thịt
Kế hoạch lấy mẫu Giới hạn cho phép
Sản phẩm Chỉ tiêu
n c m M
Thịt và sản phẩm chế TSVSVHK 5 2 5 x 105 5 x 106
biến từ thịt sử dụng trực E. coli
5 2 5 x 101 5 x 102
tiếp không cần xử lý
nhiệt Salmonella 5 2 Không phát hiện
(trong 25g hoặc 25
ml mẫu)
Thịt và sản phẩm chế TSVSVHK 5 2 5 x 105 5 x 106
biến từ thịt phải qua xử E. coli 5 2 5 x 102 5 x 103
lý nhiệt trước khi sử
dụng Salmonella 5 2 Không phát hiện
(trong 25g hoặc 25
ml mẫu)
Bảng 2.3 Giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong thủy sản và sản phẩm thủy sản
Kế hoạch lấy mẫu Giới hạn cho phép
Sản phẩm Chỉ tiêu
n c m M
Nhuyễn thể hai mảnh E. coli 1 0 230 700
vỏ, động vật chân
Salmonella 5 0 Không phát hiện
bụng, động vật da gai,
hải tiêu (trong 25g hoặc 25
ml mẫu)
(tunicates)còn sống
Giáp xác và động vật E. coli 5 2 1 101
thân mềm có vỏ hoặc Staphylococci
5 2 102 103
đã bỏ vỏ gia nhiệt
phản ứng
 dương tính
với coagulase
Salmonella 5 0 Không phát hiện
(trong 25g hoặc 25
ml mẫu)
2.2.3 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu
2.2.3.1 Thu mẫu
Giá trị kết quả từ các phòng thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào vị trí và cách lấy
mẫu. Mẫu kiểm nghiệm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm, bằng không phải lấy
nhiều mẫu hơn. Trong các nhà máy chế biến thủy sản, thông thường mẫu dùng cho kiểm
tra vệ sinh công nghiệp được lấy với một khối lượng nhỏ tại nhiều thời điểm và nhiều công
đoạn khác nhau trong quá trình chế biến. Có thể tập trung lấy mẫu tại công đoạn thành
phẩm nhiều hơn, nhưng trong một số trường hợp cần thiết, điều này cũng có thể áp dụng
cho một vài công đoạn trọng yếu trong quá trình sản xuất. Đối với loại thực phẩm đã biết
chỉ nhiễm bề mặt thì cần dùng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hoặc
cắt lát với bề dày 2-3 mm để thu mẫu. Đối với các thực phẩm đã đóng gói, lấy các mẫu từ
các gói lớn từ đó lấy ra các đơn vị bao gói nhỏ hơn.
Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại chất liệu khác nhau như vật dụng dùng
để lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùng, hay các dao, thìa, kéo được hấp,
sấy hoặc rửa trong các dung dịch tẩy trùng… để cho mẫu vào trong bình chứa.
Đối với mẫu nước sử dụng dụng cụ chứa bằng bình nhựa có nắp (tránh sử dụng
dụng cụ thủy tinh dễ vỡ)
2.2.3.2 Bảo quản và vận chuyển mẫu
Đối với mẫu thực phẩm: Các mẫu sau khi lấy được bảo quản tách biệt nhau trong các
thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải được bảo quản sao cho
không được tan chảy quá nhanh trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng kiểm nghiệm.
Tại phòng kiểm nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay trong
thời gian có thể được. Nếu không thể phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC
cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không cần bảo quản đông thì có thể bảo quản ở
nhiệt độ 0-4oC để tránh sự biến động về thành phần đặc tính của mẫu cũng như vi sinh vật
nhưng không được quá 36 giờ, mẫu cần được để trong bao bì kín, tránh tiếp xúc trực tiếp
với nước đá. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm
khó hư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.
Đối với mẫu nước: Nếu có thể, phân tích các chỉ tiêu vi sinh ngay sau khi lấy mẫu
để tránh những thay đổi không lường trước được. Nếu mẫu không thể phân tích ngay trong
vòng 1 giờ sau khi lấy mẫu, phải bảo quản trong các thùng lạnh trước khi vận chuyển đến
các phòng kiểm nghiệm. Nếu kết quả phân tích có liên quan đến pháp luật, phải sử dụng
một phương tiện vận chuyển đặc biệt để chuyển đến phòng kiểm nghiệm chậm nhất là 6
giờ với một qui trình bảo quản đặc biệt. Nhiệt độ bảo quản nước uống, nước suối hay nước
bị ô nhiễm là dưới 10oC và thời gian vận chuyển không quá 6 giờ, bảo quản trong tủ lạnh
tại các phòng kiểm nghiệm cũng không được quá 2 giờ.
2.2.4 Chuẩn bị mẫu phân tích
- Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo, mứt… Cân 10g (hoặc 25g) mẫu
cho vào cối sứ nghiền nát, sau đó cho vào bao nylon (PE) vô trùng hoặc bình erlen dung
tích 200ml đã có sẵn bi thủy tinh và 90ml (hoặc 225ml) dung dịch pha loãng đã tiệt trùng.
Lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1.
- Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… cân 10g (hoặc 25g) mẫu (cả
cái lẫn nước) cho vào túi dập mẫu để dập mẫu. Thêm 90ml (hoặc 225ml) dung dịch pha
loãng vô trùng vào túi dập mẫu chứa mẫu, lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu,
ta có độ pha loãng 10-1.
- Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… Có thể hút trực
tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10ml mẫu cho vào túi
dập mẫu, thêm 90ml dung dịch pha loãng vô trùng vào túi dập mẫu chứa mẫu, lắc đều. Ta
có độ pha loãng 10-1
- Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE (Polyetylen),
đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên ở nhiệt
độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5oC trong 18h; hoặc 45oC trong 15 phút nếu cần (liên tục lắc
bình chứa mẫu nếu có thể để tăng tốc độ giải đông)
- Có thể dùng máy dập mẫu (Stomacher) để xử lý mẫu rắn
- Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước đệm photphat,
nước muối sinh lý (0.85%) trong buffer nếu cần.
Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bị phồng, biến dạng,
bị hở các mối ghép hay không? Ghi lại các nhận xét trên. Lau chùi bằng cồn phía ngoài,
đưa vào phòng vô trùng để kiểm. Chú ý chỉ kiểm các hộp phồng khi có yêu cầu.
Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín của
bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm nghiệm.