2.

Nguyên tắc

Chất tạo màu anthocyanin dạng monome thay đổi màu sắc theo pH; tại pH 1,0 các anthocyanin tồn
tại ở dạng oxonium, tại pH 4,5 thì chúng chủ yếu ở dạng hemiketal không màu. Chênh lệch độ hấp
thụ của các chất màu ở bước sóng 520 nm tỷ lệ thuận với nồng độ của chất tạo màu. Các kết quả
được biểu thị theo cyanidin-3- glucoside.

Các anthocyanin ở dạng polyme không đổi màu khi pH thay đổi và không bao gồm trong phép đo vi
độ hấp thụ của chúng ở pH 4,5 và ở pH 1,0 là như nhau.

3. Dụng cụ, hóa chất

3.1. Axit clohydric đậm đặc, nồng độ từ 36,5 % đến 38,0 % (khối lượng).

3.2. Dung dịch kali clorua (KCI), 0,025 M (làm dung dịch đệm có pH 1,0)

Cân 1,86 g kali clorua cho vào cốc có mỏ, thêm nước đến khoảng 980 ml. Đo pH và dùng axit
clohydric (3.1) (khoảng 6,3 ml) để chỉnh pH đến 1,0. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1 lít và
thêm nước đến vạch.

3.3. Dung dịch natri axetat (NaCH3COO.3H2O), 0,4 M (làm dung dịch đệm có pH 4,5)

Cân 54,43 g natri axetat cho vào cốc có mỏ, thêm nước đến khoảng 960 ml. Đo pH và dùng axit
clohydric (3.1) (khoảng 20 ml) để chỉnh pH đến 4,5. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1 lít và
thêm nước đến vạch.

3.4. Máy đo pH, đã được chuẩn hóa bằng dung dịch đệm chuẩn có pH bằng 4,0 và 7,0, có thể đo
chính xác đến ± 0,05 pH.

3.5. Máy đo quang phổ khả kiến. Kiểm tra hiệu năng của máy ở bước sóng 520 nm bằng các dung
dịch đối chứng về độ chính xác của bước sóng, độ chính xác quang phổ, độ tuyến tính và ánh sáng
phân tán.

3.6. Cuvet thủy tinh hoặc cuvet dùng một lần, dùng cho máy đo quang phổ, chiều dài đường
quang 1 cm.

3.7. Bình định mức, dung tích 50 ml.

3.8. Pipet chia vạch, có các dung tích thích hợp.

4. Quy trình phân tích

4.1. Chuẩn bị dung dịch thử

Dùng pipet (4.5) chuyển phần mẫu thử tối đa 10 ml và bốn phần dung dịch đệm đựng trong bình định
mức 50 ml (4.4) sao cho không vượt quá khả năng đệm của thuốc thử.

Xác định hệ số pha loãng thích hợp bằng cách pha loãng phần mẫu thử với dung dịch đệm pH 1,0
[kali clorua (3.2)], cho đến khi độ hấp thụ ở 520 nm nằm trong dải tuyến tính của máy đo quang phổ.

CHÚ THÍCH: Đối với hầu hết máy đo quang phổ, độ hấp thụ phải từ 0,2 AU đến 1,4 AU.

Dùng hệ số pha loãng này để chuẩn bị hai dung dịch pha loãng của mẫu thử, một dung dịch
pha loãng dùng dung dịch đệm pH 1,0 [kali clorua (3.2)] và dung dịch pha loãng còn lại sử dụng dung
dịch đệm pH 4,5 [natri axetat (3.3)].
4.2. Xác định

Dùng máy đo quang phổ (4.2) đo độ hấp thụ của phần mẫu thử đã được pha loãng bằng dung dịch
đệm pH 1,0 [kali clorua (3.2)] và dung dịch đệm pH 4,5 [natri axetat (3.3)] ở cả bước sóng 520 nm và
bước sóng 700 nm. Đọc độ hấp thụ của các phần mẫu thử đã pha loãng so với cuvet mẫu trắng
được đổ đầy nước. Đo độ hấp thụ trong vòng 20 min đến 25 min sau khi chuẩn bị.

CHÚ THÍCH: Lý do đo độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm là để đo được chính xác. Tuy nhiên, nếu
phần mẫu thử đã pha loãng quá đục thì trước khi đo cần làm trong bằng cách ly tâm hoặc lọc.
Sử dụng bộ lọc không hấp thụ anthocyanin.

5. Tính kết quả

Nồng độ chất tạo màu anthocyanin tính theo đương lượng

cyanidin-3-glucoside, c, biểu thị bằng miligam trên lit (mg/l), được tính bằng công thức sau đây:

C =          (1)
Trong đó:

A là độ hấp thụ của phần mẫu thử, tính được tính như sau:

Trong đó:

: là độ hấp thụ của phần mẫu thử có pH bằng 1,0 đo được ở bước sóng 520 nm;

: là độ hấp thụ của phần mẫu thử có pH bằng 1,0 đo được ở bước sóng 700 nm;

: là độ hấp thụ của phần mẫu thử có pH bằng 4,5 đo được ở bước sóng 520 nm;

: là độ hấp thụ của phần mẫu thử có pH bằng 4,5 đo được ở bước sóng 700 nm;

DF là hệ số pha loãng trong 6.1;

MW là khối lượng phân tử của cyanidin-3-glucoside, bằng 449,2 g/mol;

I là chiều dài đường quang, tính bằng centimet (cm);

e là hệ số tắt phân tử (bằng 26 900) của cyanidin-3-glucoside, tính bằng L x mol-1 x cm-1;

103 là hệ số chuyển đổi từ gam sang miligam.

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, có thể biết trước hàm lượng một anthocyanin trong mẫu thử
và hàm lượng này khác với cyanidin-3-glucoside. Điều quan trọng là nêu rõ bước sóng, khối lượng
phân tử và độ hấp thụ nếu kết quả không được biểu thị theo đương lượng cyanidin-3-glucoside. Báo
cáo kết quả theo các anthocyanin monome, biểu thị theo đương lượng cyanidin-3-glucoside, tính theo
miligam trên lít.