Instrukcja

Kinetyka reakcji enzymatycznych na przykładzie reakcji transaminacji

1. Oznaczanie aktywności aminotransferazy alaninowej (AlAT)

Metoda oznaczenia oparta jest na zaleceniach Międzynarodowego Towarzystwa Chemii Klinicznej.
Aminotransferaza alaninowa (AlAT) katalizuje przeniesienie grupy aminowej z alaniny na 2-oksoglutaran
tworząc pirogronian i glutaminian:
AlAT
L-alanina + 2-oksoglutaran  pirogronian + L-glutaminian

Pirogronian jest następnie redukowany przez NADH, w wyniku czego powstaje mleczan i NAD:
LDH
pirogronian + NADH +H+  mleczan + NAD+

Maksimum absorbancji NADH ma miejsce przy 340 nm, natomiast forma utleniona (NAD+) nie absorbuje
światła przy tej długości fali. Szybkość zmian absorbancji (spadek absorbancji w wyniku utleniania NADH)
mierzona przy 340 nm, jest proporcjonalna do aktywności aminotransferazy alaninowej w badanej surowicy.

Wykonanie ćwiczenia:
Odczynnik roboczy zawiera L-alaninę, 2-oksoglutaran, NADH i LDH.
Do kuwety napipetuj 1000 l odczynnika roboczego i ogrzej do temperatury oznaczenia – 25-30oC.
Następnie dodaj 100 l badanej surowicy, dokładnie wymieszaj i po 1 min inkubacji odczytaj absorbancję
wobec powietrza lub wody przy długości fali 340 nm. Powtarzaj odczyty absorbancji po dokładnie 1, 2 i 3
kolejnych minutach. Wyznacz średnią zmianę absorbancji na minutę (A/min).
Obliczenia prowadzone są w oparciu o następujący wzór:
Vt x 105
aktywność AlAT [U/l] = -------------- x A/min
ε x l x Vs
gdzie:
Vt – całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej = 1,1 ml
ε – molowy współczynnik absorbancji NADH przy 340 nm = 6,3 x 10 2 m2/mol
l – długość drogi światła = 1 cm
Vs – objętość próbki = 0,1 ml

czyli:
aktywność AlAT [U/l] =1746 x A/min

Wartości referencyjne: AlAT < 40 IU/l