AMİNO ASİT VE PROTEİNLERİN BAZI ÖZELLİKLERİNİN

İNCELENMESİ

Amino asitler proteinlerin yapı taşlarıdır. Peptid (amid) bağlarıyla bağlana-

rak polimerik yapıdaki proteinleri oluştururlar.

Amino asitler polar olmayan organik çözgenlerde çok az, etanolde az, suda
çok çözünürler ve nötral çözeltiler verirler. Hem asidik hem de bazik çözeltilerde
artan bir çözünürlüğe, yani amfoter bir karaktere sahiptirler. Erime veya bozunma
noktaları 120- 300oC aralığındadır ve bu değerler ısıtma hızına bağımlı olarak
değişir. Protein zincirinin ana yapısı, nötral olduğu halde yan zincirler (R grupları)
aspartik ve glutamik asitte olduğu gibi asidik, lizin ve arginin de olduğu gibi bazik
gruplar içerebilir. Yani proteinler de amino asitler gibi amfoterik özellik gösterirler.
Amino asit ve proteinlerin nitel ve nicel belirlenmelerinde çeşitli renk
reaksiyonları vardır. Aşağıdaki tabloda bu renk reaksiyonları ve reaksiyona esas
teşkil eden grup veya amino asit türleri belirtilmiştir.

Reaksiyon Reaktif Amino Asit Renk

Ninhidrin reaksiyonu Ninhidrin Serbest NH2 Mor
grubu
Biüre reaksiyonu alkali Cu SO4 Mavi
Lowry reaksiyonu Fosfomolibdo tungstat Tyr. Mavi
Millon reaksiyonu HNO3, HNO2, HgNO3 Tyr. Kırmızı
Ksantoprotein Kaynar Der. HNO3 Trp, Tyr, Phe Sarı
reaksiyonu
Hopkins Cole reaksi- D.H2SO4 te glioksalik asit Trp. Erguvan
yonu
Ehrlich reaksiyonu D.HCl de p- dimetilamino Trp. Mavi
benzaldehid
Sakaguchi - Naftol, NaOCl Arg. Kırmızı
Nitroprussiyat sey.NH3’ta sodyum nitro- Cys. Kırmızı
reaksiyonu prussiyat
Sullivan reaksiyonu Sodyum 1,2, Naftokinon- Cys. Kırmızı
4-sülfonat ve NaHSO3
Pauly reaksiyonu Diazo sülfanilik asit His, Tyr Kırmızı
 Tabii proteinin yapısındaki herhangi bir değişim denatürasyon olarak
adlandırılır. 4- 8 M gibi yüksek konsantrasyonda üre ve guanidin hidroklorür gibi
maddeler dönüşümlü denatürasyon yaratırlar. Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve diğer
deterjanlar, Cl3CCOOH, HClO4 ve fosfotungstik asit gibi asitlerin orta
konsantrasyonları komple denatürasyona neden olur. 50oC den daha yüksek
sıcaklık da genellikle denatürasyona sebep olur. Alkaliler, sülfür grubunu
yükseltgeyen veya indirgeyen maddeler ve iyodoasetat, diizopropil fosfofluoridat
gibi seçimli maddeler protein yapılarının ve biyolojik aktivitelerinin değişimlerine
neden olurlar.
Proteinlerin saflaştırılmasında tüm proteinlere uygulanabilen tek ve basit bir
yol yoktur, fakat belirli temel prensipler vardır ve belirli tekniklerin sıra ile
uygulanması gerekir. Sulu çözeltinin dielektrik sabitinin veya iyon şiddetini
değiştiren reaktifler proteinin çözünürlüğünü etkiler. Denatürasyonu önlemek
amacı ile özellikle düşük temperatürde etanol, aseton veya amonyum sülfat gibi
bazı tuzların ilavesi heterojen protein çözeltisinden belirli fraksiyonların
çöktürülmesinde kullanılabilir.

Deneysel İşlemler:

Deney 1. Amino Asitlerin Çözünürlüğü ve Aktivitesi:

Glisinin çözünürlüğünü ölçmek için bir kaç kristalini 2 ml distile su içine
atınız. Oluşan çözeltinin asitliğini pH kağıdı ile kontrol ediniz. Denemeyi L- glutamik
asit, L- arginin ve L- tirozin ile de tekrarlayınız.

Deney 2. Tirozin ve Kazeinin Amfoterik Özellikleri:

2 ayrı tüpte 0,1 gr tirozin ve 0,05 gr kazeinin 2 ml sudaki süspansiyonlarına
1’er ml % 10’luk NaOH çözeltisi ilave edip çalkalayarak sonucu not ediniz.
Çözeltilere bir parça pH kağıdı atıp % 10’luk HCl den, çözeltiler tamamen asidik
oluncaya kadar, damla damla ilave ediniz. Tüpleri çalkalayıp sonuçları gözleyiniz.

Deney 3. Glisin ve Kazeinin Nitröz Asitle Reaksiyonları:

Primer amino grubu içeren amino asitler soğukta nitröz asit ile reaksiyona
girerek azot gazı açığa çıkarırlar. Reaksiyon sonucu oluşan gazın hacmi ölçülerek
peptid veya proteinlerdeki serbest amino gruplarının sayısı saptanır (Van Slyke
Yöntemi).
İki ayrı tüp içindeki 0,1 gr glisin ve 0,05 gr kazeine 5 er ml % 10’luk NCl
çözeltisi koyunuz. Kontrol amacı ile üçüncü bir tüpe de 5 ml % 10 ‘luk HCl çözeltisi
koyunuz. Bütün tüpleri buz banyosunda 0oC’ye kadar soğutup her birine 1 ml %
5’lik sodyum nitrit çözeltisi ilave ediniz ve sonuçları gözleyiniz.

Deney 4. Millon Reaksiyonu:

p- Hidroksifenol kökü içeren bileşikler civa varlığında HNO3 ile
kaynatılırsa kırmızı renkli bileşikler oluştururlar. Reaktif ağırlıkça eşit miktarda Hg
ve Der. HNO3 karışımının hafifçe ısıtılarak çözelti haline getirilmesi ve iki katı su
ilavesi ile hazırlanır.
 Ayrı tüplerdeki 3’er ml glisin, tirozin ve kazeinin % 0,1’lik çözeltilerine bir
kaç damla Millon reaktifi eklenerek kaynar su banyosunda ısıtılır. Kırmızı bir
rengin oluşup oluşmadığı gözlenir.

Deney 5. Ksantoprotein Reaksiyonu:

Aromatik amino asitler, tirozin, triptofan, fenilalanin ve histidin, Der.HNO3
ile muamele edildiklerinde sarı renkli nitro türevlerine dönerler. Cilde HNO 3
değdiğinde meydana gelen sararma da bu nedenledir.
Belirtilen amino asitlerin ve kazeinin % 0,1’lik çözeltilerinin 2’şer ml sine
birkaç damla Der.HNO3 konur. Reaksiyona zor giren fenilalanin tüpüne 1-2 damla
Der.H2SO4 eklenir. Isıtılan tüplerin rengi sararır. Soğutulup % 10’luk NaOH ile
kalevi hale getirilince renk portakal rengine döner.

Deney 6. Hopkins- Cole Reaksiyonu:

İndol halkası içeren sistemler, asidik ortamda aldehidler ile trimetilmetan
tipinden mor renkli kondenzasyon ürünleri oluştururlar. Aldehid olarak kullanılan
glioksilik asit okzalik asitten hazırlanır. Bu amaçla 2,5 gr Mg tozu az su ile bulamaç
haline getirilip soğutulur ve üzerine yavaşça soğuk, doymuş okzalik asit çözeltisi
eklenir, kuvvetle çalkalanır, oluşan glioksilik asit buzdolabında saklanır.
Üç ayrı tüpe 3ml % 1’lik triptofan, tirozin ve kazein çözeltisi konur ve
üzerilerine bir kaç damla glioksilik asit çözeltisi eklenir. Bir tabaka oluşturacak
şekilde Der.H2SO4 ilave edildiğinde değme noktasında mor bir halka oluşur.

Deney 7. Amino Asitlerin bazı türevlerinin hazırlanması:

a) N- Benzoil Türevleri: 10 mMol amino asit 10 ml % 10’luk NaOH’te
dağıtılır ve 1,0 ml benzoilklorür, çalkalama ve soğutma ile, azar azar ilave edilir.
Soğutulur ve karıştırarak azar azar Der.HCl ilavesi ile Kongo kırmızısı kağıdına
karşı asidik oluncaya kadar (kağıt mavi olur) asitlendirilir. Çökelek nuçeden süzülür
ve soğuk su ile yıkanır, kurutulur ve toz edilir (Lösin ile peltemsi bir katı oluşabilir).
Kirlilik olarak bulunan benzoik asit soğuk eterle yıkanarak veya CCl4 ekstraksiyonu
ile çıkarılır. Yaklaşık 10 ml kaynar sudan veya sulu alkolden tekrar kristallendirilir.
b) N- Asetil Türevleri: 10 mMol amino asit 20 ml % 5 lik NaOH çözeltisin-
de dağıtılır ve 1,5 ml asetik anhidrit hızlıca ilave edilip 10 dakika hızla çalkalanır.
Soğutulur ve Der.HCl ilavesi ile asitlendirilir. Çökelek nuçeden süzülür, soğuk su
ile yıkanır ve sudan tekrar kristallendirilir.
c) N, p- Toluensulfonil Türevleri: 10 mMol aminoasit içeren alkali çözel-
tilerin 0,2 gr p-toluen sülfonik asidin eterdeki çözeltisi ile 3-4 saat karıştırma ile
kolayca hazırlanır. Sulu faz kongo kırmızısı indikatörü varlığında sey. HCl ile
asitlendirilir ve gerekirse soğutulur. Oluşan ham sülfonamid süzülür ve sulu
alkolden tekrar kristallendirilir.
d) N- 2,4- Dinitrofenil Türevleri: Bu türevler sarı kristal maddelerdir.
Aminoasitlerin bu türevlerinin karışımı slikajel ile T.L.C’de ayrılabilir. Bu yöntem
peptid ve proteinlerde N- uç amino asit analizlerinde kullanılır.
0,5 gr Amino asit 1 gr NaHCO3 içeren 10 ml suda çözülür veya dağıtılır.
Üzerine 0,8 gr 2,4- Dinitroflorobenzenin 6 ml etanoldeki çözeltisi katılır ve 1 saat
karıştırılır. 6 ml doygun NaCl çözeltisi katılır ve küçük hacimlerde eter ile birkaç
defa ekstraksiyonla reaksiyona girmemiş reaktif uzaklaştırılır. Sulu faz, 24 ml %
5’lik soğuk HCl çözeltisine karıştırarak ilave edilir. Karışımın kongo kırmızısına
karşı asit olması lazımdır. Süzülür ve % 50’lik etanolden tekrar kristallendirilir.
Bu türevler ışığa hassastırlar, reaksiyonun aliminyum ile kaplı kaplarda
yapılması ve ürünün karanlıkta saklanması gerekir.

PEPTİD YAPISININ AYDINLATILMASINDA KULLANILAN BAZI

SPESİFİK RENK REAKSİYONLARI

Bazı aminoasitler için spesifik renk reaksiyonları kağıt kromotografisi ile

belirlemelerde etkin olan yöntemlerdir. Bunlar hakkında detaylı bilgi literatürlerde
bulunmaktadır. Serbest aminoasitler için bu reaksiyonlar iyi bilinmektedir,
peptidler için ise daha az bilgi mevcuttur. Bazı durumlarda aminoasitler için iyi
çalışan reaksiyon değişiklikleri, aynı aminoasitleri içeren peptidler için iyi
çalışmayabilir.
Peptid dizisinin aydınlatılması tekniği, bağıl proteinlerin karşılaştırılması
açısından önemlidir. Reaktif aminoasitleri spesifik olarak içeren peptidler peptid
haritaları üzerinde referans noktalarıdırlar. Bir başka deyişle spesifik reaksiyonlar
girişim yapan pozisyonlardaki peptid lekesinin farklandırılmasında
(belirlenmesinde) yararlıdır. Birbirinin eşi peptid haritaları üzerindeki lekelerin
pozisyonlarında sık sık bazı değişiklikler gözlenebilir. Bu durumda aynı kağıt
üzerine uygulanan peptid dizisine farklı reaksiyonları uygulamak yararlı olacaktır.
Bu sırada peptid içeriğinin tanımlanmasında kullanılabilecek bazı spesifik
reaksiyonların uygulaması amaçtır. Bazı reaksiyon dizileri birbirinin karşıtıdır.

Bunlar;
Sakaguchi ve Ehrlich
Pauly ve Ehrlich
Klorinasyon ve Ninhidrin
Sakaguchi üzerinden ninhidrin
Iyodoplatinat üzerinden ninhidrin

NİNHİDRİN

Daha iyi lekeler oluşturmak amacıyla daldırma tekniği tercih edilir.

Tamponlanmış ninhidrin; 1 ml piridin ve 1ml glasiyel asetik asitin, 98 ml % 0,3 lük
ninhidrin/ aseton’a eklenmesiyle hazırlanır.
Asidik veya bazik ninhidrin 1 ml glasiyel asetik asit veya 1 ml piridinin
sırasıyla aseton içindeki 99 ml % 0,3 ninhidrin ilavesiyle gerçekleştirilir. Daha önce
işlem görmemiş (üzerinde boyama yapılmamış) kağıt tamponlanmış ninhidrin
çözeltisine daldırılır. Kurutulan kağıt daha sonra bir etüve konularak
sıcaklığın 70- 80 o C’ye kadar çıkması sağlanır. Bu kademeli ısıtma işlemiyle
minumum düzeyde yüzey renklenmesi sağlarken, noktalar daha belirgin olarak renk
verirler.

Bazı peptidlerin lekeleri ninhidrinle gri veya yeşil renk verirler, bunlara
örnek olarak; serin, glisin ve asparagin’in amino ucunu oluşturduğu peptidler
verilebilir. Daha sonra kağıdın arka tarafına Pauly veya Sakaguchi reaktifleri
püskürtülerek iyice kurutulur ve daha sonra asidik ninhidrin çözeltisine
daldırılabilir. Kağıt yukarıda anlatıldığı gibi dikkatlice ısıtılır. Eğer kağıdın ön
yüzeyinde mor lekeler belirirse bu durumda ısıtma durdurulur ve kağıt oda
sıcaklığında karanlıkta renk oluşumunun devamı için bırakılır. Ninhidrinin bu
reaksiyonu platinik iyot renklendirmesinin takibinde kullanılabilir. Isıtma işlemi
yukarıda anlatıldığı gibi çok dikkatli olarak yapılmalıdır. Burada oluşan lekeler
genellikle bir veya iki gün sonra soluk bir renk almaktadır. Tüm bu ninhidrin
modifikasyonları ısıtma yapılmadan da gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak ise
kağıdın 24 saat boyunca karanlıkta renk oluşumunu tamamlamasıdır. Ancak bazı
lekeler oda sıcaklığında zamanla hiçbir şekilde gözlenmeyebilirler.

PAULY REAKTİFİ

Solusyon A: 4,5 g sulfanilik asit ve 5 ml derişik HCl suyla 500 ml’ye

tamamlanır. Çözünürlüğün sağlanması için hafifçe ısıtılır.
Solusyon B: % 5 lik NaNO2 (aq) taze hazırlanır.
Solusyon C: % 10 Na2CO3 (aq)
A,B ve C solusyonları bir buz banyosunda soğutulur. Daha sonra bir kısım
B, iki kısım A üzerine ilave edilir ve kağıda bu karışım püskürtülür. Daha sonra
soğuk C solüsyonu lekeler iyi bir şekilde belirinceye değin püskürtülür. Histidin
lekeleri pembe veya kavuniçi- pembe; tirozin lekeleri kahverengimsi, soluk bir mor
veya oranj- kahverengi olarak belirir. Eğer ninhidrin işaretlemesi; Pauly’den sonra
yapılacaksa bu durumda kağıdı solusyona daldırmamak gerekir. Eğer Pauly
reaksiyonu ninhidrin reaksiyonundan sonra yapılacaksa bu durumda ninhidrin rengi
önce % 1’lik HCl: Aseton çözeltisinden kağıdı geçirerek lekeler silik hale getirilir
ve kurutulur. Bu ilave asitle birlikte Pauly uygulandığında, pozitif lekeler karbonat
püskürtmesinden sonra lekeler sarıya dönerler.

SAKAGUCHİ REAKTİFİ

Solusyon A: 8- Hidroksi kinolin’in mutlak etanoldeki % 2’lik çözeltisi, 0,2

ml 8 M üre 100 ml’lik solusyon A’ya eklenebilir. Bu lekelerin daha belirgin
olmasını ve uzun süre gözlenebilmesini sağlar.
Solusyon B: Kullanılmadan hemen önce hazırlanır. 0,02 ml bromürün 20
ml % 5’lik KOH(aq) çözeltisine ilavesi ile hazırlanır.
Kağıda solusyon A püskürtülür (gerekirse birçok kez). Kağıt kurutulur ve
hipobromit (B) çözeltisi püskürtülür. Arginin- pozitif lekeleri açık pembe veya
kavuniçi- pembe renginde uygulanan örneğin konsantrasyonuna bağımlı olarak
değişir. Sakaguchi lekeleri geçicidir ve bu durumda gözlendikleri anda
işaretlenmelidir.

TİROZİN REAKTİFİ

Solusyon A: - nitroso- - naftolün asetondaki çözeltisidir (% 0,1).

 Solusyon B: 10 ml derişik nitrik asit ve 90 ml asetonun birleştirilmesi ile
hazırlanır. Denemeden hemen önce hazırlanmalıdır.
Ninhidrin lekeleri kalemle işaretlendikten sonra kağıt solusyon- A’ya
daldırılır, kurutulur, daha sonra solusyon- B’den geçirilir. Kağıt 5- 10 dak. kurutulur
ve dikkatlice sıcak plaka üzerinde hareket ettirerek hafifçe ısıtılır (çok fazla ısı
tirozin rengini tahrip eder). Kağıttan dumanlar yükselmeye başladığı zaman zemin
koyu sarıdan açık sarıya dönüşür, aynı zamanda tirozin lekeleri gül rengine
dönüşür. Renklenmenin kaybolması birkaç dakika ile birkaç saat aralığında
değişebilir. Bu nedenle kağıtta gerekli işlemler (işaretleme) hemen yapılmalıdır.

EHRLİCH REAKTİFİ

Solusyon A: p-dimetil amino benzaldehid’in asetondaki % 2’lik çözeltisidir.

Solusyon B: 10 ml d- HCl ve 90 ml asetonun birleştirilmesi ile hazırlanır.
A ve B solusyonları kullanılmadan hemen önce hazırlanmalıdır. Ninhidrin lekeleri
kalemle işaretlenir. Daha sonra kağıt solusyon A’ya daldırılır ve kurutulur,
solusyon B’ye daldırılır. Ninhidrin lekeleri önce kırmızıya döner sonra ise
renksizleşir. Triptofan lekeleri mor bir renge dönüşür. Kükürt lekeleri ise kavuniçi
olarak gözlenir.

KLORİNASYON

Solusyon A: t- butilhipokloritin siklohegzan içindeki % 1 (v/ v) lik çözeltisi:

Solusyon B: Su içerisinde KI ve çözünür nişastanın % 1’lik çözeltisi (nişasta
üzerine kaynar su ilave edilir ve birkaç damla soğuk su içerisinde suspense ederek
KI ilave edilir.)
Peptid lekelerinin şiddeti, peptidin büyüklüğü ile orantılıdır. Kağıt solusyon
A’ya daldırılır, daha sonra 1 saat soğuk buhara bırakılır, kağıda taze hazırlanmış
nişasta- iyodür (B) püskürtülür. Püskürtme işlemine lekeler belirgin bir mavi
oluşuncaya dek devam edilir. Bu durumda tek bir noktanın dışında tüm zemin
rengininde koyulaşması söz konusudur.

AMİNO ASİTLERİN KANTİTATİF TAYİNİ

1. NİNHİDRİN İLE TAYİN

Amino asitler ninhidrin hidrat (I) ile pH= 5 ve 100oC’de, standart bir süre
reaksiyona tabi tutulursa diketohidrindiliden- diketohidrindamin (II)’nin mavi mor
renkli amonyum tuzu elde edilir. Ninhidrin, amonyak ve primer aminler ile de
benzer mavi- mor renkli bir ürün meydana getirir.

Mavi- mor renkli ürünün absorbansı 570 nm’de ölçülebilir.

 Prolin ve hidroksiprolin, ninhidrinle sarı bir ürün (III) meydana getirir. Bu
da, su kaybederek kısmen enolbetain (IV)’e dönüşür. Prolinin, asetik asitteki
ninhidrin çözeltisi ile birlikte 100oC’de uzun süre ısıtılması sonucu mavi- mor
renkli bir ürün (V) elde edilir. Ayrıca enolbetain (IV), diğer bir ninhidrin hidrat (I)
molekülü ile kondanse olduğunda da yine (V) nolu ürün elde edilebilmektedir.

Çözelti içinde reaksiyona girmiş farklı amino asitlerin verdiği mavi- mor
ürünün rengi (max. dalga boyunda) belirgin bir farklılık göstermez. Ninhidrin
reaktifinin ancak kromatogramı veya ince tabaka üzerindeki amino asitlere spray
şeklinde uygulanması ile farklı renkler elde edilmektedir. Bu nedenle, kantitatif
olarak tayin edilebilen farklı amino asitlerin oluşturdukları ürünün rengi aynı
değildir.

AMİNO ASİTLERİN NİNHİDRİN İLE KANTİTATİF TAYİNİ

1.0 ml. aminoasit çözeltisine 0,2 ml. ninhidrin reaktifi (2 mg/ ml ninhidrin,
20 mM asetik asit- sodyum asetat tamponunda çözülerek hazırlanır, pH= 5) ilave
edilir.
Çözelti 10 dakika 100oC’de ısıtılır ve soğutulur. Prolin dışındaki tüm amino
asitler için 570 nm’de absorbans ölçülür. Prolin için ölçüm 440 nm’de yapılır.
Farklı aminoasitler için standard bir eğri hazırlanmıştır. Hassasiyet sınırı 0,1
mol’dür.

2. FORMOL TİTRASYONU İLE GLİSİN KONSANTRASYONUNUN

TAYİNİ

Formaldehit, amino asitlerin serbest amino gruplarını bloke ederek onları

hidroksimetil türevlerine dönüştürür. Örneğin aşağıdaki reaksiyonda görüldüğü
gibi, glisine formaldehit katılması sonucu hidroksimetil- glisin oluşur. Bunun
sonucunda amino asit amfoterik karakterini yitirir ve NH 2- grubunun
dissosiyasyonundaki kayma (pH= 10’dan 7’ye) alkalimetrik olarak titre edilebilir.
Grafikte bu durum, kesikli çizgili eğri ile gösterilmiştir.

Şekil 1 Glisinin formol titrasyonu (Sörensen’e göre).

Formaldehitli ortamda fenolftaleinin renk dönüşümünü izlemek daha

kolaydır. Renk değişimi, hidroksimetil- glisinin tamamen nötralizasyonundan sonra
açığa çıkar.

Çizelge 1 Amino asit ve proteinlerin dissosiye olabilen gruplarının pK- değerleri.

Grup pK- Değeri Örnek

- Karboksil 1,8- 2,5 tüm proteinojen amino
asitler
 - veya - karboksil 3,0- 4,7 Asp, Glu
imidazol 5,6- 7,0 His
- NH2 7,8- 9,2 - Amino asitler
- NH2 9,4- 10,6 Lys
Sulfhidril- 9,4- 10,8 Cys
Hidroksifenil- 9,8- 10,4 Tyr
- 11,6- 12,6 Arg

Deneysel İşlemler :
Kullanılacak Madde ve Malzemeler:
% 1’lik glisin Erlen (50 ml’lik)
% 38’lik nötralize Pipet (10 ml’lik)
formaldehit (pH= 7 e ayarlanır)
%1’lik fenolftalein Büret (50 ml’lik)
(% 96’lık alkolde)
0,1 N NaOH

10 ml. glisin çözeltisinin bulunduğu erlene, 10 ml. nötralize formaldehit

çözeltisi ile indikatör olarak birkaç damla fenolftalein ilave edilir. Kör deneme için,
glisin yerine 10 ml. saf su alınıp, diğer reaktifler aynen ilave edilerek ikinci bir
örnek hazırlanır. 15 dakika sonra her iki örnek pembe renk gözleninceye kadar 0,1
N NaOH ile titre edilir. Harcanan sodyum hidroksit miktarı yardımıyla ortamdaki
glisin konsantrasyonu hesaplanır.

Sorular
1. Formol reaksiyonu hangi prensibe dayanır ve nasıl yürür?
2. Formol titrasyonu ile hangi rutin analizler yapılabilir?

AMİNO ASİTLERİN TİTRASYONU

Hem asit, hem de baz olarak davranan bileşiklere örnek olarak amino asitler
gösterilebilir (Amfoterik özellik). Amino asitlerde ortak olan genel formül
RCH (NH2) COOH şeklindedir. Amino asitlerin içerdiği karboksil grubunun pKa’sı
1,7- 2,4, amino grubunun pKa’sı ise 9.0- 10,5 arasında değişir.
Amino asitlerin sulu çözeltideki iyonizasyon şekilleri, Henderson-
Hasselbalch eşitliği ile verilen ifadeye uymaktadır.
OAc- 
pH= pKa + log Henderson- Hasselbalch eşitliği
HOAc

Bir amino asidin iyonizasyon şekillerini yazacak olursak;

 net pozitif yük net sıfır yük net negatif yük
(katyon) (zwitter iyon) (anyon)

pH artar.

Bu bir amino asidin düşük pH değerlerinde bir katyon, yüksek pH

değerlerinde bir anyon olarak bulunduğunu gösterir. Amino asidin hiç yük
taşımadığı ara bir şekli ise zwitter iyon olarak isimlendirilir. Sulu çözeltide baskın
olan şekil zwitter iyondur ve bu pH’a izoelektrik nokta (pI) ismi verilir.

pKa1 + pKa2
pH= pI =
2

glisin söz konusu olduğunda pKa1 = 2,3, pKa2 = 9,6, izoelektrik nokta ise 6.0’dır.
Düşük pH değerlerinde, katyon ve zwitter iyon, Henderson- Hasselbalch eşitliğinde
tarif edilen oranlarda bir arada mevcuttur. Bundan yüksek pH değerlerinde ise
zwitter iyon baskın durumda olacaktır. Amino asidin izoelektrik formu bir asit ile
titre edilirse, baz olarak davranır. Baz ile titre edilirse asit olarak
davranır(Amfoterik bileşik).

Glisin için;

H3+N- CH2- COO- + HCl H3+N - CH2- COOH+ Cl- (1)

(baz) (asit) (asit)

H3+N- CH2- COO- + NaOH H2N- CH2- COO- + Na+ + H2O (2)
(asit) (baz) (baz)

Bu nedenle, amino asidin titrasyon eğrisi, standart NaOH veya HCl

kullanılarak her nokta için düzeltilmelidir.
Bu deneme, aminoasidin Henderson- Hasselbalch eşitliğindeki her iki
formunu da ( A- veya HA) titrasyona bağlı olarak göstermektedir.
Örnek olarak, 25 ml. 0,1 M amino asit çözeltisi (1) eşitliğine göre
(başlangıçta A- formu 2,5 mmol olarak mevcuttur). 10 ml. 0,1 M HCl (1.0 mmol)
ile titre edilirse, 1,0 mmol HA formunun oluşmasıyla, A- formu 2,5 - 1,0 = 1,5
mmol olacak şekilde azalacaktır. Titrasyon eğrisinin bu noktasında

A- 1,5
oranı olacaktır.
HA 1,0
 Titre edilen grupların bilinen pH veya pK değerleri ve Henderson-
Hasselbalch eşitliği ile düzeltme yapılmalıdır.
Glisin gibi bir diprotik asitin titrasyon eğrisi aşağıda gösterildiği gibi
çizilebilir.

→ ilave edilen meq asit veya baz

Şekil 1 -Amino asidin titrasyon eğrisi.

Tampon bölgelerin orta noktasındaki pH değeri, pK değerine eşittir. pK,

titrasyon eğrisinin bükülme noktasına tekabül eden pH değeridir. Titrasyon
eğrisinin son noktası, gözlenen titrasyon sonunu verir. Titrasyonun teorik olarak
sonu eşdeğerlik noktasıdır(Titre edilen fonksiyonel grubun her ekivalenti için, tam
olarak bir ekivalent asit veya baz ilave edilmiştir).
Aşağıda sırasıyla nötral, aromatik, asidik ve bazik aminoasitlerin titrasyon
eğrileri verilmiştir.
Önce, glisin ve fenilalainin titrasyon eğrisini aynı grafik üzerinde
inceleyelim.
Şekil 2- Glisin ve fenilalaninin titrasyon eğrisi.

Asidik aminoasitlerin titrasyon eğrisine örnek olarak Glutamik asidin

titrasyon eğrisini inceleyelim.

Şekil 3- Glutamik asidin titrasyon eğrisi.

Bazik aminoasitlere örnek olarak da Lisin’in titrasyon eğrisini inceleyelim.

 ‘e ilave edilen mol ekivalent OH

Şekil 4- Lisin’in titrasyon eğrisi.

Şekil 5- Lisin, glisin, fenilalanin ve glutamik asidin belirli bir pH aralığındaki net

yükleri.
Glisin tamponunun titrasyonu:
• 0,5 M Glisin çözeltisi hazırlanır. (m.w = 75,1, pKa1 = 2,36, pKa2 = 9,6)
• 25 ml. Glisin çözeltisi üzerine 25 ml. su ilave edilir (100 ml’lik bir behere).
Cam baget ile karıştırılır.
• Çözeltiye pH’ metrenin elektrodu daldırılır.
• 0,5 N HCl ile pH= 1,0 oluncaya kadar titre edilir. Her seferinde 0,5 ml. asit
ilave edilerek (tampon bölgelerde daha az ilave etmek gerekir) pH ölçülür.
• Tamponlamanın güçlü olduğu bölgelerde, daha fazla asit ilave edilerek,
yaklaşık 0,3 pH’lık değişimleri tespit edecek şekilde ilave yapılır. Her
ilaveden sonra karıştırılır.
 • Tekrar 25 ml. Glisin çözeltisi alınır ve 0,5 N KOH ile pH 12,5’a kadar titre
edilir.
• Düzeltme için 50 ml. su HCl ile, ayrıca KOH ile titre edilir(aynı koşullarda)
pH’da meydana gelecek çok büyük değişme nedeniyle, titrant damla damla
ilave edilir. Titrant 0,1 ml - 0,5 ml. kısımlar halinde ilave edilir ve pH ölçülür.
• Amino asit çözeltisi ve çözgen’e ilişkin titrasyon değerleriyle grafik çizilir.
Çözücünün titrasyon eğrisi, amino asit çözeltisinin titrasyon eğrisinden
çıkarıldıktan sonra, düzeltmiş titrasyon eğrisi elde edilir.
• Bu grafikten, glisinin iki iyonize grubunun her biri için pKa değerleri ve
izoelektrik noktası hesaplanır.

KROMATOĞRAFİ

Kromatografi, bir çözeltinin gözenekli bir ortamdan geçerken göç hızlarının

farklı olması nedeniyle bileşenlerine ayrılması tekniğidir. Bileşenler, affinitelerinin
farklı olması nedeniyle sabit fazda (katı, sıvı) veya hareketli fazda (gaz, sıvı)
ayrılabilir.
Kromatografi olayında adsorbsiyon, dağılma (partition) ve iyon değiştirme
(exchange) kuvvetleri rol oynar. Kromatografi türlerinin uygulanmasında bu
olayların iki veya daha fazlası etkinlik gösterir.

KAĞIT KROMATOĞRAFİSİ

Kağıt kromatografisi kimyasal maddeleri, süzgeç kağıdı tabakaları veya

şeritleri üzerinde hareket eden bir sıvı ile ayırıp tayin etmek esasına dayanır.
Maddenin iyonik yapılı olması veya olmamasının kromatografik özelliğine önemli
bir etkisi yoktur. Sadece kullanılan tamponun durumuna göre Rf değeri
değişmektedir.
Kağıt kromatografisinde maddelerin göç hızına etki eden faktörler;
Adsorbsiyon, çözünürlük ve ters akım dağılım kuvvetleridir.
Adsorbsiyon; Kromatografi kağıdına damlatılan bileşikler kağıdın esas
maddesi olan sellüloz tarafından birbirlerine göre daha az veya daha çok
adsorplanır. Daha fazla adsorplanan maddenin kağıt üzerindeki hareketi daha yavaş
olur. Çözgen ve adsorban arasındaki bağıl affinite; ayrılan bileşenlerin, çözgenin ve
adsorbanın özelliklerinin bir fonksiyonu olarak belirlenir.
Çözünürlük; Çözücü, kağıt boyunca hareket eder ve madde karışımını
içeren leke üzerinden geçer. Bu sırada lekedeki maddeleri çözer ve kağıt üzerinde
sürükler. Madde çözücüde tamamen çözünüyorsa, kağıt üzerinde çözücü ile aynı
hızda hareket edecektir, hiç çözünmüyorsa başlangıç noktasında hareketsiz
kalacaktır. Bu nedenle, kromatografide, örnekteki bileşenleri kısmen çözen
çözücüler kullanılır.
Ters akım dağılma kuvvetleri; Apolar bir çözgenin (örneğin n-butanol) polar
bir çözgen (örneğin su) ile doyurulmuş karışımı kağıt üzerinde göç ederken,
karışımın polar bileşeni, taşıyıcı ortam (selüloz) tarafından adsorblanır ve sabit
fazın binlerce küçük sıvı fazını oluşturur. Sabit faza bağlı polar çözgen tabakaları
daha az polar olan hareketli fazın (n- butanol) geçişi ile ardarda yıkanır. Böylece
mikro boyutta ters akımlı dağılma kromatografi sistemi yaratılır. Bu tekniklerle
yapılabilecek ayırmaları, bileşenlerin dağılma katsayılarından yararlanarak
önceden tahmin etmek mümkündür. Bununla beraber teorik olarak bulunan bu
değerler bazen deneysel değerlerden sapabilir. Bunun nedeni, bileşenlerin
taşıyıcıya adsorblanması ve maddenin adsorblanmış sıvı damlacıklarının birinden
diğerine aktarımı öncesinde çözgen dengelerinin kurulamamış olmasıdır.
Kağıt kromatografisinde ayırmak istediğiniz maddeleri içeren örnekten bir
damla filtre kağıdının bir ucundan 2-3 cm. uzaklığa damlatılır ve kurutulur. Sonra
uygun bir çözgen karışımı ile bileşenlerin belirli doğrultuda göçü sağlanır. Kağıt
aşağıya doğru tutularak bileşenlerin yer çekimi ve kapilarite ile göçü ya da yukarı
doğru tutularak kapilarite ile göçü mümkün kılınır.
Kağıt kromatografisinin süresi; hareketsiz faz olan kağıdın kalınlığına,
seçilen çözgene ve sıcaklığa bağımlı olarak 1- 24 saat arasında değişir.
Her bir bileşenin başlangıç çizgisinden uzaklığı çözgen sınırına bağımlı
olup Rf değeri ile tanımlanır.

bileşenin başlangıç çizgisinden uzaklığı

Rf =
Çözgenin başlangıç çizgisinden uzaklığı

Spesifik koşullarda ölçüm yapıldığında her bir bileşenin belirli bir Rf değeri
vardır.
Bu spesifik şartlar; çözgen sistemi, sıcaklık, yürütme şekli (aşağı veya
yukarı), kağıdın tipidir. Rf değerine etki eden birçok faktör olduğu için, Rf değeri
bileşenin kimliğini tam olarak açıklamaz. Bilinmeyen bir bileşen, bilinen bileşenle
birlikte aynı koşullarda kromatografiye tabi tutulur, elde edilen Rf değerlerinin
kıyaslanması ile bilinmeyenin kimliği saptanır. İki farklı bileşen, belirli bir çözgen
sisteminde aynı Rf değerlerine sahip olabilir. Bu nedenle bileşenlerin niteliğini
diğer yöntemlerden de yararlanarak doğrulamak gerekir.
Kağıt kromatografisinde ayrılan lekeler uygun renk reaktifi veya UV ışığı
ile belirlenir. Kağıt kromatografisi ile ayrılan bileşenlerin kantitatif analizi iki
yoldan yapılabilir. Bu analizler, lekenin renk geçirgenliği veya UV absorblamasının
doğrudan ölçülmesi veya bileşenin kağıttan alınarak uygun bir yöntemle
analizlenmesi yoluyla gerçekleştirilir.

Amino Asitlerin Kağıt Kromatoğrafisi ile Ayrılması:

Portakal, limon, domates gibi, herhangi bir mevsim meyve veya sebzesi
sıkılarak suyu çıkarılır. Santrifüj edilerek santrifüjat kromatografi için alınır.

Kullanılacak Madde ve Malzemeler:

Amino asitler; DL- Asp, DL-Glu, DL- Leu, DL- Lys ve bunların karışımı
(0,01 M olarak hazırlanır).
Yürütücü çözgen sistemi; Etanol- Su- Der. amonyak (80:10:10)= hacimce
veya izopropanol- amonyak (2:1).
Sprey çözeltisi; Asetonda % 0,2’lik ninhidrin çözeltisi (taze hazırlanmalıdır)

Deneysel İşlemler:
 Yürütme kabına 50 ml. yürütücü çözgen konur ve kapağı kapatılır.
25 x 25 cm. boyutlarında bir Whatman No. 1 kağıdı alınır. Bir kenarından
2,5- 3 cm. uzaklığında kurşun kalemle bir çizgi çizilir.
Çizgi üzerine aralıklı olarak birer damla amino asit, bir damla amino asit
karışımı, iki damla doğal meyve suyu örnekleri kapiler yardımıyla damlatılır. Leke
çaplarının 4 mm’yi geçmemesi, birden fazla damla tatbikinde her damladan sonra
leke yerinin kurutulması gerekir.
Aminoasitlerin kromatografisi yapılırken işlemden önce ellerin iyice
yıkanmış olması gerekir. Kağıt sadece uçlarından tutulmalıdır, aksi halde belirtme
reaktifi püskürtülünce parmak izleri koyu lekeler halinde görülür.
Kağıt silindir şekline sokulup klipslerle tutturulur ve kabın duvarlarına
değmeyecek şekilde yürütme kabı içindeki çözücüye daldırılır.
Çözücünün 2-4 saat yürümesi beklenir.
Bu süre sonunda, kağıt tanktan çıkarılır, çözgen seviyesi hemen
işaretlenir(henüz ıslak durumdayken).
Kromatogram önce havada kurutulur.
Ninhidrin sprey çözeltisi lekelerin üzerine püskürtülerek, 100- 105oC’deki
etüvde iki dakika bekletilir.
Oluşan renkli lekelerin çevresi kurşun kalemle işaretlenerek Rf değerleri
hesaplanır ve birbiriyle karşılaştırılır.
Kromatogramda bilinmeyen lekeler oluşabilir. Bunlardan kuvvetli sarı leke
prolin’e, yavaş hareket etmiş kahverengi leke Asparagin’e karşı gelir. Meyve
sularının amino asit içerikleri değişik olduğundan, ayrıca aynı mevya için mevsim
ve olgunluk derecesine göre de değişebileceğinden ideal bir kromatogram elde
etmek için uygulanacak damla sayısı değişebilir. Meyva suları bakteriyel
bozunmaya hassas olduklarından soğukta saklanmaları gerekir veya 9 hacim meyva
suyuna 1 hacim izopropanol ilave edilerek saklanabilirler. Lekelerin belirtilmesinde
püskürtme yöntemi tercih edilmelidir. Eğer daldırma yöntemi kullanılacaksa
işaretli olmayan uçtan daldırmaya başlanmalıdır.
Aynı işlem inen kromatografi tekniği ile de yapılabilir. Bu durumda 6-8
saatlik bir süre gerekir. Yine çift yönlü çıkan kromatografi işlemi de uygulanabilir.
Bu durumda örnekler kağıdın bir köşesine ve tek yönlü kromatografide kullanılanın
3 katı damla sayısında tatbik edilir. Bir yönde yürütme sonrasında kağıt kurutularak
diğer yönde yürümesi sağlanır. İkinci yönde yürütmede çözgen sistemi değişebilir.
Amino asit ayrılmalarında ikinci yönde yürütmelerde n-Butanol-Glasiyel asetik
asit-su(12:3:5 hacimce) sistemi kullanılabilir.
Kağıt kromatografisi ile belirtilebilen madde miktarını sprey reaktifinin
hassaslığı tayin eder. Ninhidrin gibi hassas reaktiflerle birkaç mikrogram’a kadar
belirtme yapılabilirken, daha az hassas reaktiflerle bu miktar 50 mikrogram’a kadar
yükselebilir.

KAĞIT ELEKTROFOREZİ

Karışımda bulunan maddelerin tümü veya bazıları iyonlaşabiliyorsa

karışımı bir elektrik alanına koymak suretiyle bir dereceye kadar ayırma yapılabilir.
Bu yönteme “Elektroforez” denir. Bir maddenin elektroforez ile ayrılması için
anyon veya katyon haline gelebilmesi gerekir. Asidik veya bazik özellik gösteren
maddelerin elektroforezle ayrılması çok çabuk ve kolaydır. Elektrolizin
tamamlanmamış bir şekli olan bu işlemde ayrılan ürünler elektrodlarda meydana
çıkmayıp, hareketleri elektrodlar arasındaki bazı ara noktalarda durmaktadır.
Uygun tampon seçildiğinde bazı nötral maddeler bile elektrofezle ayrılabilmektedir
(Örneğin şekerler). Bu durumda tampon ile madde arasında iyonik kompleksler
meydana gelmekte ve böylece maddenin göçü sağlanmaktadır. Elektroforezin iki
ana tekniği vardır;
1. Serbest elektroforez: Çözelti içinde bulunan maddelere uygulanan akım
kesilince maddeler bir süre serbest diffüzlenir. Bu bir dinamik sistemdir ve oldukça
karışıktır.
2. Bölge(zone) elektroforezi; Ayrılacak olan madde karışımı geniş bir tutucu
(sabit) ortam üzerine leke veya çizgi halinde uygulanır. Tutucu ortam genellikle
süzgeç kağıdı, sellüloz asetat zarı, nişasta jeli, agar jeli, akrilamid jeli gibi maddeler
olup, genellikle “Stabilize ortam” olarak isimlendirilir. İyonik bileşiklerin
iyonlaşması, elektroforezin temelini oluşturur. Değişik hızlarla zıt işaretteki
elektrodlara doğru hareket eden değişik işaret ve yükteki iyonlar, maddelerin
elektrik alandaki hareketlerini ve ayrılmasını sağlar, yüksüz moleküller hiçbir
zaman elektroforetik hareket göstermez.
Tam ayrılma için bütün maddelerin belirli bir nokta ya da ince bir banttan
harekete başlaması ve hepsinin uzun serbest bir hareket yoluna sahip olması
gerekir. Kağıt elektroforezinde ayrılacak maddeyi kapsayan lekeler için tutucu
olarak kağıt kullanılır ve aynı zamanda ayrılma yolunu da meydana getirir. Akım
kesilince iyonlar yollarından ayrılarak bütün yönlere doğru diffüzlenirler.
Diffüzyonu önlemek için kağıt, elektroforez kabından hemen çıkartılıp kurutulur.
Böylece ayrılan maddeler elektroforez esnasında bulundukları durumlarını
korumuş olurlar. Maddelerin, tutucu ortam üzerinde lekeler halinde ayrılmasından
hemen sonra elektroforetogramı kurutmak yada kimyasal olarak saptamak suretiyle
ayrılmayı istenilen durumda kesmek ve stabilize etmek olanağı vardır. Sonra
ayrılan maddeler kağıt kromatografisinde olduğu gibi boyanarak ya da kimyasal
reaksiyon ile tespit edilir.
Elektrik akımı verilmeden önce tamponla ıslatılan kağıt, bir ucu anot
bölmesine diğer ucu katot bölmesine batacak şekilde asılır sonra da ayrılacak olan
maddeler kağıdın ortasına çizilmiş olan çizgi üzerine damlatılır.
Bir iyonun elektroforetik hareketine iyonun büyüklüğü ile taşıdığı yükün
büyüklüğü etki eder. Bunların etkisi birbirine zıttır. Daha büyük iyon daha yavaş,
yükü daha büyük olan iyon ise daha hızlı hareket eder. Molekülün şekli yani küre
veya uzun oluşu ile kolloid (makromolekül) veya kristalloid (moleküler) oluşu da
hız üzerine dolayısıyla ayrılmaya etki eder. Kristalloidler küçük olduklarından kağıt
tarafından etkilenmezler, oysa kolloidler çoğu kez kağıt tarafından hemen
adsorblanırlar ve ayrılma yolu üzerinde lekenin arkasında bir kuyruk bırakabilirler.
Elektroforezin yapıldığı sistemin bazı özellikleri de ayrılmaya etki eder.
Bunlardan voltajın etkisini gidermek için voltajı veya akım şiddetini sabit bir
değerde tutmak gerekir.
Tampon konsantrasyonunun artması, iletkenliğin artmasına ve bunun
sonucu olarak da ısının büyümesine neden olduğundan olumsuz etki eder.
Tampon pH’sının özellikle amfolitlerin ayrılmasında önemli rolü vardır.
 Karboksil ve amino gruplarının her ikisini birden taşıyan bir amino asit veya
protein tampon pH’sına göre şu şekillerde bulunabilir;
R + R R
+ OH- OH-
H3N- CH- COOH H+
H3N- CH- COO- H+
H2N-CH-COO-
Asidik pH’da katyon İzoelektrik noktada Bazik pH’da anyon
nötral molekül

Tampon pH’sının uygun seçimi ile böyle bir madde anoda veya katoda
gidebilir ya da başlangıç noktasında kalabilir. Elektroosmotik etki ve diffüzyon da
elektroforeze etki eder.

Amino Asitlerin Kağıt Elektroforezi ile Ayrılması

Portakal, limon, domates gibi herhangi bir mevsim meyva veya sebzesi
sıkılarak suyu çıkarılır. Santrifüj edilerek santrifügat elektroforez için alınır.

Kullanılacak madde ve malzemeler;

Shandon kağıt elektroforez cihazı
250 volt’luk doğru akım kaynağı
Whatman No: 1 süzgeç kağıdı
Amino asit karışımı (DL- Asp, DL- Leu, DL- Lys karışımı)
Tampon çözelti; 10 ml. piridin + 0,8 ml. GAA, 250 ml’ye destile su ile
tamamlanır (pH= 6.1)
Ninhidrin sprey çözeltisi: (Asetonda % 0,2’lik).

Deneysel İşlemler:
- Whatman No: 1 Süzgeç kağıdının ortasına kurşun kalemle bir çizgi çizilir. Bu
çizgi üzerinde birbirinden eşit uzaklıkta noktalar işaretlenir.
- Elektroforez cihazının her iki bölmesine 50’şer ml. tampon çözeltiden konur.
- Kağıt ayrı bir yerde tampon çözeltiye daldırılarak ıslatılır, ortasından cam çubuk
üzerine asılır ve her iki ucu bölmelerdeki tampon çözeltiye değecek şekilde
yerleştirilir.
- Kapiler kullanılarak, kağıt üzerinde işaretlenmiş noktalara birer damla meyva
suları ve amino asit karışımı uygulanır.
- Elektroforez cihazı cam kabın içine konulup kapağı kapatılır ve doğru akım
kaynağına bağlanarak akım verilir.
- Bir- birbuçuk saat sonra akım kesilir, fişler çekilir, kağıt çıkarılarak çabuk
kurutulur.
- Kağıt üzerine ninhidrin sprey çözeltisi püskürtülerek, 100- 105oC’deki etüvde iki
dakika bekletilir.
- Amino asit karışımından ve meyva sularından elde edilen lekeler karşılaştırılarak
meyva sularında bulunan amino asitler tayin edilir.

ELEKTROFOREZ TİPLERİ VE
YÜKSEK VOLTAJ ELEKTROFOREZİ (HVE)
 Elektroforezin çok çeşitleri vardır. Belli başlıcaları;
a) Jel elektroforezi (Akrilamid jel, Nişasta jel .... v.s.)
b) İnce tabaka elektroforezi,
c) Kağıt elektroforezi,
d) Zone elektroforezi,
e) Disk elektroforezi,

Bu yöntemlerin hepsinde, uygulanan örneğin bulunduğu iletken tabakanın

iki ucu arasına bir gerilim tatbik edilir. Devre bunlar üzerinden tamamlanır. Böylece
elektrikli alanda göç edebilen iyonik yapılı maddelerin, iyoniklik derecesine ve
molekül ağırlığına bağımlı olarak hareketi sağlanır.
Jel elektroforezinde jel tabakası, ince tabaka elektroforezinde silika jel
(adsorban), kağıt elektroforezinde kağıt üzerinden devre tamamlanır. Tampon
çözeltiler yardımıyla bu maddeler üzerinden akım geçmektedir.
Elektroforezde iki kutup arasında gerilim farkı çok yüksek tutulacak olursa,
bu taktirde yüksek voltaj Elektroforezinden bahsedilir.

HVE (Yüksek Voltaj Elektroforezi)

Elektroforezde iki kutup arasındaki gerilim farkı arttıkça hareket edecek

iyonların hızları da ona göre artmaktadır. Ancak artış, kullanılan kağıdın ve
soğutma sisteminin dayanıklılığı ölçüsünde yapılabilir.
Yüksek voltaj çok büyük molekül ağırlığına sahip maddelere uygulanamaz.
Bunlar ancak düşük voltajda iyi bir şekilde ayrılabilmektedirler.
Örneğin; molekül ağırlığı 60.000 gr olan (A + B) protein karışımı 40 cm.
uzunluğunda bir kağıt üzerinde çok düşük bir voltaja tabi tutulursa, göç 10 saat
sonra tamamlanır.

• A  B

400 volt verilmesi halinde göç 5 saatte tamamlanır ama, protein karışımı
birbirinden tamamen ayrılamaz, geniş bir alana yayılır.

• A B

Buna karşılık molekül ağırlığı  200 gr olan amino asit karışımları (a+ b)
4000 Volt’ta 30 dakikada çok iyi bir şekilde ayrılabilirler.

• a b

Düşük molekül ağırlıklı maddeler düşük voltajda elektroforeze tabi

tutulduklarında memnun edici sonuç elde edilemez. Çünkü madde çok geniş alana
yayılmaktadır. Bu mahzuru gidermek için tek çare yüksek voltaj tatbik etmektir.
Böylece geniş alana dağılma önlenir ve ayırma çabuklaşır.
İyonize olabilen düşük molekül ağırlıklı bileşikler ile iyonize olabilen
kompleksler yapabilen bileşikler yüksek voltaj elektroforezi ile ayrılabilirler (Örn;
Karboksilli asitler, Amino asitler, peptidler, Fenol, İnorganik bileşikler,
Karbohidratlar, Alkaloidler, vitaminler).
Reaktifler veya numune kağıda etki ediyorsa, bu taktirde İnce Tabaka
Elektroforezi (TLE) kullanılır. TLE, özellikle iki yönlü ayırmalarda tercih edilir.
Az diffüzyona neden olan istenildiği gibi adsorbe eden maddeler seçilebilir.
Cam tabakalar yerine plastik tabakalara adsorban yayılması suretiyle ince
tabaka yüksek voltaj elektroforezi yapılabilir.

HVE’de deneysel İşlemler:

1. Numune Hazırlanması:
Genel olarak mümkün olduğu kadar derişik numune hazırlanır ve çözgen
olarak da tampon kullanılır. Yani, numune kullanılan tamponda çözülür. Eğer
numunenin tamponda çözülmesi mümkün değilse, tamponun pH’sını mümkün
olduğu kadar az değiştirecek bir çözgen kullanılır.

2. Tampon Seçimi:
a) Çoğu durumda tamponun niteliğinden ziyade pH’ı önemlidir.
b) Eğer tamponun numune ile kompleks iyon teşkil etmesi isteniyorsa bu
durumda niteliği çok önemlidir. Örneğin karbonhidratların ayrılmasında tampon
olarak Na4BO4 (sodyum tetra borat) kullanılır.
c) Tampon gereğinden fazla derişik olmamalıdır. Bu, özellikle pH’ı yüksek
tamponlarla çalışıldığında önem kazanır. Çünkü derişik tamponun iletkenliği fazla
olacağından yüksek voltajın kullanılabilme limiti azalır (iletkenlik fazla olunca
geçen akımın şiddeti artacaktır).
V= IR
d) Eğer ikinci kademe olarak kromatografik ayırma yapılacaksa bu takdirde
çabuk uçan bir tampon seçilmelidir.
e) Tampon hazırlanmasında kullanılan maddelerin saf olmasına dikkat
edilmelidir. Bütün alkali ve nötral tamponlar için platin elektrod kullanılır.
Paslanmaz çelikten imal edilmiş elektrodlar özellikle aside dayanıklıdır.

3. Elektroforez kağıdının seçimi:

Genellikle elektroforetik ayırmalarda MN 261, S + S 2040 B kullanılır.
Yüksek voltaj elektroforezi + Kromatografi kombinasyonu yapılacaksa MN 214,
S+ S 2043 B veya S + S 2043 A (veya Whatman 1,2,4) kullanılabilir.
Genellikle ince kağıtlar kullanılır. Kalın kağıtlar iletkenliği artıracağı için
yüksek voltaj limitini düşürür.

4. Numunenin uygulanması:
Elektroforezden sonra kromatografi de yapılacaksa numune nokta şeklinde
tatbik edilir.
Sadece elektroforez yapılacaksa bir çizgi şeklinde de uygulanabilir.
Az miktardaki numune, tamponla ıslatılmış kağıda tatbik edilir. Numunenin
fazla olması isteniyorsa, kuru kağıda uygulama yapılır. Bu durumda tampon
çözeltiye batırılmış bir süzgeç kağıdı numunenin olduğu kısma 2 cm. uzaktan
elektroforez kağıdı ile temas ettirilir.
Diğer bir metod da numunenin tatbik edildiği kısma 2 mm. mesafe kalacak
şekilde kağıdı tampona daldırmaktır.

5. Voltaj seçimi:
Gereğinden fazla yüksek voltaj uygulanmamalıdır. CAMAG HVE’nin
soğutma kapasitesi 5000 V. 160 mA veya 4000 V., 200 mA’e dayanıklıdır.
Yüksek voltaj elektroforezinde çalışmalar çok uzun süreli olmamalıdır.
Çünkü kağıt kuruyabilir ve iletkenlik sağlanamaz.
HVE’de soğutma sistemi olarak kriyostat kullanılması düşünülebilir ama,
sıcaklığın 1oC’ düşmesi, iletkenliği % 3 azaltmaktadır. Sıcaklık 10oC düştüğünde
iletkenlik, gerçek değerinin % 70’i 20oC düştüğünde ise % 40 ‘ı olacaktır.
Eğer numune sıcaklığın yükselmesi ile bozulacaksa, bu takdirde soğutma
sisteminden yararlanılır.
Genelde bütün ayırmalarda çeşme suyu ile soğutma yeterli olmaktadır.

6. Elektroforegramın değerlendirilmesi:
Eğer elektroforezde ayrılan maddeler renksiz ise, uygun bir reaktifle
boyanır, ayrıca U.V. lambası ile de kontrol edilir. Böylece normal ışıkta
görünmeyen fraksiyonlar varsa U.V. lamba vasıtası ile görülebilir.
Boyama sonucunda referans ile aynı Rf değerine sahip lekelerin kalitatif
tayini yapılır. Bu lekelerin bulunduğu fraksiyonlar kesilerek uygun bir çözücüde
çözüldükten sonra kantitatif tayini de yapılabilmektedir.

7. İki yönlü ayırma:

Genellikle kombinasyonda önce HVE sonra kromatografi uygulanır. Çünkü
elektroforez ile numune otomatikman tuzlardan temizlenmiştir (Dializ işlemine
gerek kalmaz).
Kromatografik ayırma için rulo haline getirilen kağıt kromatografi tankına
yerleştirilir.

8. TLE:
CAMAG HVE’nin soğutma kapasitesi ile 0,125 mm. kalınlığında poliester
tabakalar üzerine adsorban yayıldıktan sonra elektroforez uygulanır.
Ancak, fazla miktarda ısınma meydana gelmesi nedeniyle çok yüksek
voltajla çalışılamaz.

PROTEİNLERİN İZOELEKTRİK NOKTASININ TAYİNİ

Proteinlerin izoelektrik noktaları değişik yöntemlerle tayin edilebilir. Bu

deneyde minimum çözünürlük yöntemi uygulanacaktır. Değişik pH değerlerindeki
Asetik asit/ Asetat tamponlarından alınan belirli hacime eşit miktarda kazein katılır.
En fazla protein çökelen çözeltinin pH’sı kazeinin izoelektrik pH’sıdır.
Deneysel İşlemler:
Malzemeler ve Reaktifler:
• Spektrofotometre * Pipet 0,5 ml.
• Küvetler (2 adet), 10 mm. * Pipet 1 ml.
• Santrifüj cihazı * Pipet 4 ml.
• Tüplük * Ölçüm pipeti (2) 5 ml.
• Santrifüj tüpü * Ölçüm pipeti (2) 1 ml.
• Cam baget
• Kazein çözeltisi, 20 gr/ lt (0,4 M sodyum asetatta hazırlanacak)
• Asetik asit (1 M)
• Asetik asit (0,1M)
• NaOH (1 M)
• NaOH (0,2M)
• n- Amil alkol
• Biüre reaktifi (zehirli)
a) 200 ml. NaOH’de (0,2 M) çalkalayarak sırası ile 22,5 gr. Na- Tartarat. 4
H2O; 7,5 gr. CuSO4. 5H2O ve 2,5 gr. KI çözülür, 0,2 M NaOH ile hacmi 500 ml’ye
tamamlanır.
b) KI (30,1 mM) 2,5 gr. KI 0,2 M NaOH’te çözülür ve hacmi 500 ml’e
tamamlanır (karanlıkta saklayınız!). 100 ml. (a) çözeltisi, (b) çözeltisi ile 500 ml’ye
tamamlanır (Çözelti 14 gün dayanıklıdır).

Kazein Çözeltisinin Hazırlanması: 10 gr. kazein 200 ml. 1 M NaOH’te

birkaç damla n- amil alkol ilavesiyle kuvvetli çalkalanarak çözülür. Daha sonra 400
ml. 1 M Asetik asit ve hacim 500 ml. olacak şekilde destile su ilave edilip iyice
karıştırılır. Gerekirse süzülerek berrak çözelti elde edilir.

Deneysel İşlemler:
* Protein Çöktürmesi:
Numaralanmış 9 santrifüj tüpünü aşağıdaki tabloda belirtilen şekilde
doldurup iyice çalkalayınız.

Tüp No: 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0,1 M Asetik asit (ml) 0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 4,0 - - -
1 M Asetik asit (ml) - - - - - - 0,8 1,6 3,2
Destile su (ml) 4,4 4,2 4,0 3,5 2,5 0,5 3,7 2,9 1,3
Kazein çözeltisi (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Çökelme veya Bulanıklık
pH- değeri
 15 dakika sonra tüplerdeki bulanıklık veya çökelti düzeyi göz ile izlenir ve
tabloya şu şekilde işlenir:

( O ) : Çökelti ve bulanıklık yok

( + ) : Az bulanıklık var
+ : Belirgin bulanıklık var
++ : Şiddetli bulanıklık var
+++ : Çökelti var.

En şiddetli bulanıklığın veya çökeleğin olduğu tüp ile iki yanında yer alan
tüpler 10 dak. 5000 g’de santrifüjlenir. Üst fazlar dekante edilir. Dekantasyona
çökelek kısmı hareketlenmeyecek şekilde son verilir. Kalan çözelti süzgeç
kağıdından süzülür. Üst fazın pH değeri potansiyometrik olarak ölçülür.

Protein tayini:
Protein tayini Biüre veya Lowry yöntemi ile yapılabilir. Lowry yöntemi
proteinler kısmında verilmektedir. Bu deneyde protein tayini biüre yöntemi ile
yapılmaktadır.
Her tüpe 1 ml. 0,2 M NaOH ilave edilerek gerekirse cam baget yardımı ile
çözülür (Dikkat! Cam baget bir sonraki reaktif ilavesine kadar tüp içinde bırakılır!).
Protein tamamen çözüldükten sonra her tüpe 4 ml. Biüre reaktifi katılır.
Aynı zamanda 1 ml. 0,2 M NaOH + 4 ml Biüre reaktifi ile kör hazırlanır. 20 dakika
sonra 546 nm’de köre karşı absorbanslar okunur.
Aşağıdaki tabloya göre hazırlanan protein (BSA) çözeltilerinin ölçülen
absorbans değerleri ile standart grafiği çizilir. Bu grafik yardımıyla kazein
çözeltilerinin protein içerikleri bulunur.

Tüpler 1 2 3 4 5 6
154 mM NaCl (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
% 1 Sığır Serum Albumini (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Biüre reaktifi 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
mg. protein (hesaplanan)

Teorik olarak ilk deneyde her tüpe kaç mg. kazein katıldığı hesaplanır.
Spektrofotometrede okunan absorbans değerleri yardımıyla belirlenen protein
miktarı dikkate alınarak izoelektrik pH’da kaç mg. kazein çökeldiği bulunur.

Hesaplama:
Santrifüj tüplerindeki çözeltilerin pH değerleri çözünen kazein miktarının
etkisi dikkate alınmazsa, aşağıdaki tampon denklemi ile hesaplanabilir.

Cbaz
 pH= pKa + log  pK2 (Asetik asit) = 4,76 
Casit

Cbaz: Tüm tüplerde sabit ve 0,04 M’dir.

Casit: Değişkendir.

Örneğin 1. Tüpteki çözeltinin pH’sı şu şekilde hesaplanır:

1. Tüpteki sıvı hacmi (toplam) : 5 ml.
İlave edilen 0,1 M Asetik asit hacmi : 0,1 ml.
Seyrelme faktörü : 5/ 0,1 = 50
Tüpteki asetik asit konsantrasyonu : 0,1/ 50 = 0,002 M’dır.

Yukarıdaki denklemde bu değer yerine konulduğunda

0,04
pH= 4,76 + log = 4,76 + 1,3 = 6,06 bulunur.
0,002
Kazeinin en az çözündüğü ve protein miktarının en yüksek bulunduğu
tüpten alınan üst fazın pH değeri İzoelektrik pH değeridir. Bu tüp için yukarıdaki
hesaplama ile bulacağınız pH değerini ölçülen değer ile kıyaslayıp yorumlayınız.