Институт за хемија

Природно-математички факултет
Универзитет „Св. Кирил и Методиј“ Скопје

Тамара Николовска

ВАЛИДАЦИЈА НА МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛУВАЊЕ СЕЛЕН ВО

ХРАНА СО ПРИМЕНА НА ETAAS

– дипломска работа –

Скопје, 2021
Ментор: проф. д-р Наташа Ристовска

Членови на комисијата: проф. д-р Наташа Ристовска

проф. д-р Јане Богданов

Датум на одбраната: _______________________________

Датум на промоција:
 Изразувам голема благодарност до мојот ментор, проф. д-р Наташа
Ристовска за успешната соработка и поддршката во текот на изработката
на овој труд.
Можноста да работам под нејзино менторство ми претставуваше
особена чест и задоволство.
Оваа прилика ја користам да ја искажам мојата благодарност и до асс. м-р
Пеце Шеровски, за несебичната помош, добрите совети и одличната
комуникација
во текот на изработката на оваа дипломска работа.
Содржина
Апстракт.........................................................................................................................................................................1
1. ВОВЕД....................................................................................................................................................................3
2. ТЕОРЕТСКИ ДЕЛ..................................................................................................................................................4
2.1 Селен............................................................................................................................................................... 4
2.2 Атомска апсорпциона спектроскопија..........................................................................................................9
2.3 Валидација на аналитички методи..................................................................................................................12
3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ДЕЛ...............................................................................................................................19
3.1 Подготовка на примерок..............................................................................................................................19
3.2 Стандардни раствори...................................................................................................................................21
3.3 Пресметки.....................................................................................................................................................22
4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА.............................................................................................................................23
4.1 Подготовка на примерок..............................................................................................................................23
4.2 Валидација на метод за определување на селен.............................................................................................24
5. ЗАКЛУЧОК...........................................................................................................................................................28
6. ЛИТЕРАТУРА......................................................................................................................................................29
 Тамара Николовска

Апстракт

Селенот е еден од есенцијалните микроелементи, кој во природата се наоѓа во

трагови, а во човечкиот организам се внесува преку храната. Целта на овој труд е
валидација на метод за определување на селен во прехрамбени продукти со користење на
електротермичка атомска апсорпциона спектроскопија (ЕТААS). Најнапред е направена
подготовка на примероците до форма погодна за користената техника и користејќи
атомски апсорпционен спектрофотометар со специјална ламба за селен и атомизација со
графитна печка се добиени квантитативни вредности за апсорбанцата на секој од
примероците. Валидацијата на методот покажува добра линеарност и повторливост на
подготовката на примероците. Аналитичкиот принос е во прифатливата граница за
точност на аналитичките методи.

Клучни зборови: селен, ETAAS, валидација, линеарност, аналитички принос

Abstract

Selenium is one of the essential microelements, which is found in trace elements in

nature and is absorbed into the human body through food. The aim of this paper is to validate a
method for the determination of selenium in food products using electrothermal atomic
absorption spectroscopy (ETAAS). The aim of this thesis is a validation of a method for the
determination of selenium in food products using electrothermal atomic absorption spectroscopy
(ETAAS). First, the samples were prepared to a form suitable for the technique used and using
an atomic absorption spectrophotometer with a special selenium lamp and graphite furnace
atomization, quantitative values for the absorbance of each of the samples were obtained.
Validation of the method shows good linearity and repeatability of sample preparation. The
analytical yield is in the range of accuracy of the analytical methods.

Keywords: selenium, ETAAS, validation, linearity, analytical yield.

1
Список на кратенки

ETAAS Електротермичка атомска апсорпциона спектроскопија

(Electrothermal atomic absorption spectroscopy)
GC Гасена хроматографија
(Gas chromatography)
AAS Атомска апсорпциона спектроскопија
(Atomic absorption spectroscopy)
ICP-AES Индуктивно спрегната плазма- масена спектроскопија
(Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy-
mass spectrometry)
LOD Граница на детекција
(Limit of detection)
Se Селен
(Selenium)
S Сулфур
(Sulfur)
Cys Цистеин
(Cysteine)
Sec Селеноцистеин
(Selenocysteine)
GSH-PX Глутатион пероксидаза
(Glutathione peroxidase)
LOQ Граница на квантификација
(Limit of quantitation)
DNA Дезоксирибонуклеинска киселина
(Deoxyribonucleic acid)
 1. ВОВЕД

Во последната деценија, определувањето на селен привлекува значајно внимание,

пред се поради неговото биолошко значење. Селенот се внесува во организмот преку
храна и припаѓа во микроелементи, кои се неопходни за нормално функционирање на
човечкиот организам. Количеството на селен, кој се внесува во организмот зависи од
видот на храната, но и од типот на земјиште, на кое се одгледува таа храна.

Поради големото биолошко значење на селенот, развиени се многу методи за

неговото определување во прехрамбените производи. Некои од тие техники вклучуваат:
гасна хроматографија (GC), атомска апсорпциона спектроскопија (AAS), индуктивно
спрегната плазма- атомска емисиона спектроскопија (ICP- AES). Споменатите техники се
засноваат на различни принципи, и секоја од нив има предноси, во однос на друга
техника, но и недостатоци.

Најзначаните предности на AAS во графитна цевка во однос на други техники, е

тоа што е потребно мало количество на примерок за анализа, ниска граница на детекција
(LOD), робусност и мали спектрални интерференции. Овие интерференции може да бидат
предизвикани од преклопување на апсорпциони линии на аналитот со линии на
апсорпција на други елементи, присутни во растворот за примерок.

Цел на овој труд е валидација на метод за определување на селен во храна со

примена на ETAAS. Дополнително трудот ќе вклучи и теоретска позадина за улогата на
селенот, што ја има како микронуелемент, хемијата на селенот, неговата дистрибуција,
биорасположливост и токсичнот. Исто така ќе бидат дадени и теоретските основи на
техниките за квантитативно определување на селен со посилен осврт на ETAAS. Во
експерименталниот дел детално ќе биде опишана подготовката на примероците од храна.
На крај, ќе бидат презентирани резултатите добиени цо процесот на валидација на
методата, како и резултатите од определувањето на селен во храната, користејќи ETAAS.
 2. ТЕОРЕТСКИ ДЕЛ

2.1 Селен

Селенот (Se) е неметал и неопходен хемиски елемент за сите живи организми. Во

природата се наоѓа во составот на многу органски и неоргански соединенија. Растенијата
го користат како катализатор во процесот на фотосинтезата. Во органско - хемиската
индустрија, соединенијата на селен се употребуваат во производството на вештачки
ѓубрива, добиточната храна, боите, лаковите, полимерните материјали. Во фармацевската
и електронската индустрија и во производството на стакло, селенот се користи како
катализатор на одредени реакции. [1]

Во почвата селенот се наоѓа во различни форми, како што се елементарен селен (Se 0),
селенид (Se2-), селенит (Se4+), селенат (Se6+) и во форма на различни органски селенови
соединенија. Соединенијата на селен се растворливи во вода, како што се селенатите и
селенидите и може да се транспортираат со површинските и подземните води низ почвата
и да се депонираат во одредени региони. Саморастечките или култивираните растенија се
главни депоа на селен во природата, бидејќи може да акумулираат поголемо количество
селен. Селенот од почвата се апсорбира во форма на селенити, кои во растенијата се
трансформираат во органски селенови соединенија, како што е диметилселенид и
аминокиселините L- селеноцистеин и L-селенометионин. [2]

Сл.1. L-селеноцистеин и L-селенометионин

 Протеините, кои во својот состав ја содржат аминокиселината селеноцистеин се
наречени селенопротеини. Со супституција на Se (селен), на местото на S (сулфур) во
аминокиселината цистеин (Cys), доаѓа до формирање на селеноцистеин (Sec).
Новодобиената Sec е поактивна од Cys, поради пониската рН вредност и поголемата
молекулска маса. [3]

Сл.2. Цистеин - Селеноцистеин

Суштинската биолошка важност на селенот е поврзана со неговата појава во

протеините и ензимите. Идентификувани се неколку ензими, зависни од селен во кои,
активниот центар содржи селен во форма на селеноцистеин. Познати селеноензими, кои
обично се јавуваат кај цицачите се глутатион-пероксидаза и тироксин-5-дејодиназа. Други
ензимски протеини, кои се вклучени во важните функции на организмот се формат
дехидрогеназа, хидроксилаза на никотинска киселина, глицин редуктаза, тиолаза и
ксантин дехидрогеназа [8].

Глутатион- пероксидаза (GSH-PX) е првиот идентификуван селеноензим, кој се

состои од 4 под-единици, секоја содржи атом на селен во форма на селеноцистеин. Овој
ензим има антиоксиоксидативна активност, кој припаѓа на т.н. чистачи на слободните
радикали. Овој ензим ја катализира биосинтезата на глутатион, трипептид кој игра важна
улога во заштитата на организмите од оксидативно дејство на водороден пероксид (H 2O2)
и органски пероксиди. Во присуство на глутатион, пероксидите се сведуваат на
хидроксилни соединенија, односно алкохол или вода. Преку елиминација на водород
пероксид од телото, овој ензим ги штити масните киселини, црвените крвни зрнца и
хемоглобинот од оксидација и ги штити клеточните компоненти како што се клеточните
мембрани и DNA од деструктивните ефекти на оксидацијата [8].
 Антиоксидативните својства на ензимот и селенот и нивното заштитно дејство
против DNA се користат и во антиканцерогените терапии. Селенот, со неутрализирање на
негативниот ефект на афлатоксините, го намалува нивниот канцероген и тератоген ефект
и го инхибира растот на клетките на ракот. Потенцијално, антиканцерогените механизми
на селенска интеракција се однесуваат на воведување на промени во метаболизмот на
канцерогените, менување на механизмот на интеракција помеѓу канцерогените и DNA,
зголемување на количината на глутатион, интензивирање на процесите на детоксикација,
селективно забавување на енергетскиот метаболизам во клетките на туморот,
модификација на пропустливоста на клеточните мембрани и стимулирање на
имунолошкиот систем на организмот [8].

Од сите органи во човечкото тело, голема концентрација на селен може да се најде

во тироидната жлезда. Селенот овозможува правилна синтеза, активирање и метаболизам
на тироидните хормони. Тоа го врши преку тироксин 5-дејодиназа. Овој ензим е
одговорен за катализацијата на дејодацијата на тироксин (Т 4) до неговата активна форма
позната како 3,3,5-тријодотиронин (Т3) или до неактивна форма - изомер на rТ 3.
Дејодацијата се јавува во периферните ткива, особено во бубрезите, црниот дроб и
скелетните мускули. Овој процес може да биде нарушен со недостаток на селен во
организмот. Ова укажува на важната улога на селенот во правилниот метаболизам на
тироидните хормони. При дијагностицирање на болести на тироидната жлезда, треба да се
земат предвид нивоата на овој елемент [8].

Во храната селенот е присутен во органски форми, најчесто како селенометионин и

селеноцистеин. Во додатоците на исхраната може да се сретне во неорганските форми на
селен (селенит и селен). Органските соединенија полесно се апсорбираат од човечките
организми во споредба со неорганските соединенија [16]. Главните извори на селен во
исхраната се храна на пример: житарици, месо, млечни производи, риби, морски плодови,
млеко, ореви [5]. Богат извор на селен се наоѓа во морската сол, јајцата, квасец, леб,
печурки, лук [18]. Овошјето и зеленчукот се карактеризираат со релативно мала содржина
на селен [16]. Прехрамбените производи од животинско потекло се карактеризираат со
разновидна количина на селен, во зависност од географската област во која живееле
животните и снабдувањето со селен во исхраната.
 Селенот се смета за основен елемент во траги од фундаментално значење за
здравјето на луѓето. Екстремните недостатоци на селен се широко распространети меѓу
луѓето низ целиот свет. Термичката обработка на прехрамбени производи може да доведе
до губење на селен во храната поради формирање на испарливи соединенија на селен [19].
Овие загуби се значителни и можат да достигнат десетици проценти [8].
Биорасположливоста на селен во храната зависи од формата на нејзино појавување и
содржината на такви соединенија како протеини, маснотии и тешки метали.
Биорасположливоста на селен е намалена во присуство на тешки метали и сулфур, но се
зголемува во присуство на витамини A, C, E и протеини со мала молекуларна тежина, кои
содржат метионин [8].

Дневно препорачано количество на селен кое треба да се внесе во организмот е од

55 до 70 g за возрасни лица, односно од 15 до 40 g за деца [17]. Кај бремените жени
дневно препорачан внес на селен излесува од 60 до 70 g [20].

Табела 1. Дневно препорачан внес на Se во зависност од возраст и пол [20]

Возраст Машко (g) Женско(g)
До 6 месеци 15 15
7-12 месеци 20 20
1-3 години 20 20
4-8 години 30 30
9-13 години 40 40
14-18 години 55 55
19-50 години 55 55
Над 51 години 55 55

Храна богата со селен

Храната која содржи селен може да се најде во сите делови на светот.

Концентрацијата на селен во храната од растително потекло зависи од квалитетот на
земјиштето на кое расте. Во нашиот регион почвата вообичаено е сиромашна со селен.
Сите видови на семиња исто така содржат селен – а особено се богати со селен
бразилските ореви и бадеми. Морската храна и месо се најбогати извори на селен [5].
Други извори на селен се мешунки, житарки, млечни и месни производи. Суплементите
кои содржат селен може слободно да се земаат секојдневно, ако тие содржат помалку од
600 микрограми на селен. [1]

Но, при обработка на храната, селенот се губи, конзервираната храна и

концентратите содржат половина од количината на селен во свежата храна. Исто така
селенот може да се уништи и при термичка обработка на храната, односно при готвење,
кога е изложен на високи температури [8].

Табела 2. Референтни вредности за маса на Se во хранливи продукти [20]

Храна g (Se)
Бразилско оревче (6-8) 544
Туна (84 g) 92
Сардина (84 g) 45
Шунка (84 g) 42
Ракчиња (84 g) 40
Тестенини зготвени (128 g) 37
Бифтек (84 g) 33
Мисирка (84 g) 31
Џигер (84 g) 28
Пилешко (84 g) 22
Урда (128 g) 20
Ориз (128 g) 19
Јајце варено 15
Леб интегрален (1 кришка) 13
Грав (128 g) 13
Овесна каша (128 g) 13
Млеко, 1% масленост (128 g) 8
 Jогурт, 1% масленост (128 g) 8

Здравствен ризик

Селенот е есенцијален елемент во составот на некои ензими, со антиоксидативно

дејство, кои ја штитат клеточната мембрана од дејството на слободни радикали.
Недостаток на селен во организмот предизвикува намалување на антиоксидантната
заштита на клетката и ефикасноста на имунолошкиот систем, оштетување на црниот дроб 1
на срцето, дегенерација на зглобовите и болки во мускулите, стерилитет и неколку форми
на рак на белите дробови, кожата и простата [2].

Препорачан дневен внес на селенот преку храната е 0,05-0,1 mg. долготрајна

изложеност на организмот со селен во дози поголемо од 0,1 mg/ден, може да предизвика
општа слабост, гастроинтестинални нарушувања, гадење, опаѓање на коса и нокти,
оштетување на црниот дроб и др. Предозирањето со селенот со концентрации поголемо од
1,0 mg/ден, предизвикува труење кое е познато како селеноза [2].

Труењето се манифестира со гастроинтестинални нарушувања, слабо изразени

невролошки проблеми, цироза на црниот дроб и белодробен еден со летален исход во
потешки случаи [2].

2.2 Атомска апсорпциона спектроскопија

Атомската апсорпција, заедно со атомската емисија, за прв пат биле употребени од

Киркоф (Guystav Kirchoff) и Бунзен (Robert Bunsen) во 1859 година, за квалитативна
идентификација на атомите [6].

Атомските апсорпциони спектрометри се дизајнирани, така што се користат или

оптика со едноснопно зрачење, или оптика со двоен сноп зраци [6].

1
Состојба во организмот предизвикана со нарушување или застој во циркулацијата на крвта,
поради што ткивата (органите) не примаат доволно кислодот од крвта
 Инструментот за атомска апсорпциона спектрометрија воглавно се состои од три дела
и тоа извор на зрачење, систем за создавање на слободни атоми (атомизер) и систем за
мерење на апсорбираното зрачење [6].

Сл.3. Шематски приказ на атомски апсорпционен спектрометар

Растворот од аналитот се внесува во атомизерот, каде се добива атомска пареа на

аналитот. Електромагнетното зрачење од изворот минува низ атомизерот, при што
атомите на елементот апсорбираат дел од зрачењето. Монохроматорот врши издвојување
само на резонантното зрачење и го упатува кон детекторот, од каде добиениот сигнал
преку засилувач оди до системот за отчитување [6].

Основен предуслов за настанување на атомска апсорпција е елементот кој се

определува да се доведе во состојба на атомска пареа, односно да се атомизира во
системот за создавањен на слободни атоми. Постојат неколку начини на атомизација во
атомската апсорпциона спекрометрија. Најчесто се користи пламен (пламена атомската
апсорпциона спекрометрија), и графитна печка (електротермичка атомската апсорпциона
спекрометрија). За да се изврши оптимална конверзија во атомска пареа потребна е
внимателна контрола на температурата. Превисоките температури може да доведат до
јонизација на дел од атомите, а јоните не апсорбираат на иста бранова должина како и
неутралните атоми, додека прениските температури пак од друга страна нема да доведат
до целосна атомизација [6].
 Пламени атомизери се состојат од распрскувач и пламеник. Распрскувачот има
функција да го претвора течниот раствор во аеросол. Примерокот се пушта (под притисок)
да поминува низ тесна дупка во една комора наполнета со оксиданс и некој носач на гас
(или горивен гас). Оксидантот и носачот на гас го носат примерокот во пламенот.
Пламеникот обично е долг 5-10 цм, доволно долг за низ него да помине зрачењето од
изворот на радијацијата. Карактеристиките на пламенот може да се променат со промена
на односот на оксидантот и на горивото што се користи за добивање на пламенот. Воздух-
acetylene и азотен оксид-acetylene се најчесто употребуваните смеси од оксиданс и горивен
гас. Со промена на односот на овие параметри може да добиеме пламени кои ќе имаат
различни температури. Тоа е многу битно за да добиеме температури кои ќе предизвикаат
атомизација, но не и јонизација на атомите [6].

Електротермички атомизери: Во почетокот на 70-тите години се воведени

електротермички атомизери. Овој тип на атомизери овозможуваат зголемена осетливост,
поради целосното атомизирање на аналитот за кратко време, а времето на задржување во
делот на зракот е изразено во секунди. Електротермичките атомизери можат да бидат
изработени како шуплива цевка, шипка, лаѓа или корито, изработени од графит, тантал
или друг спроводник [6].

Сл.4. Шема на електротермички атомизер

Графитната цевка се става во склоп, која ги затвора нејзините краеви со оптички

пропустливи окна. Склопот, исто така, овозможува континуиран проток на инертен гас,
којашто ја штити графитната цевка од оксидација и ги отстранува гасните продукти што
се создаваат во текот на атомизацијата. Од изворот на електрично напојување се
пропушта струја низ графитната цевка која притоа, поради електричниот отпор се загрева
[6].

Примерокот се инјектира во графитната цевка преку мал отвор на нејзиниот горен

дел. Атомизацијата се одвива во три фази: првата фаза е сушење. Примерокот се суши со
примена на електрична струја, која ја загрева цевката до приближно 110 ºС. Втората фаза е
жарење, температурата се покачува до 350- 1200 ºС. При овие температури, целиот
органски материјал од примерокот се разлага до CO 2 и H2O, а испарливите неоргански
компоненти испаруваат. Во третата фаза примерокот се атомизира со нагло зголемување
на температурата до 2000-3000 ºС. За протекување на трите фази потребни се 45-90 ѕ, при
што најголемиот дел од тоа време е резервирано за сушење и за жарење на примерокот [6].

Електричната атомизација овозможува значително подобрување на осетливоста,

преку задржувањето на пареите на аналитот во малиот волумен на графитната цевка. Но,
подобрувањето на осетливоста, како и на границата на детекција може да бидат на сметка
на намалување на прецизноста. Ефикасноста на атомизацијата, во голема мера зависи од
физичкиот контакт на примерокот со графитната цевка, така што е тешко контролирањето
на репродуцибилноста [6].

2.3 Валидација на аналитички методи

Валидација е проценка дали прецизноста и точноста, добиени со примена на

постапката, се соодветни со проблемот [6]. Покрај тоа, со валидацијата се обезбедува
запишана постапка со доволно детали, што овозможува различни аналитичари или
лаборатории кои ја применуваат истата постапка, да добиваат споредливи резултати.
Идеално, валидацијата употребува стандарден примерок, чијшто состав е близок на
примерокот за кој е развиена постапка [7]. Споредбата на паралелни анализи може да се
употреби за проценување на прецизноста и точноста на постапката. Во отсуство на
соодветни стандарди, точноста може да се процени споредувајќи ги резултатите добиени
со новата метода, со оние добиени употребувајќи со позната точност [12].
 Валидација на аналитички методи е прв чекор после развивањето на одредена
метода. Со обзир на важноста на аналитичката хемија со испитувањето и контролата на
квалитетот на производите, кои се потребни за животот и здравјето на луѓето, важно е
валидацијата да биде исправно изведена и прикажана [11]. Валидацијата или вреднување
на методите е процес на утврдување дека методата е погодна за користење за одредени
цели [12].

Валидацијата може да пристапи на два начина: лабораториски и

меѓулабораториски ( две лаборатории испитуваат ист примерок) [6]. Алатките кои се
користат за поединечни параметри на метод се: слепа проба, стандарди ( референтни или
потврдени референтни материјали), рутински тестови на примероци, статистичка анализа
[14].

Параметри за валидација на аналитички метод се:

 Линеарност
 Точност
 Прецизност
 Селективност
 LOD (limit of detection )
 LOQ (Limit od quantification)
 Робусност

Пристап на

валидација

Постојат два пристапи на валидација: лабораториски и меѓулабораториски. Пред

валидацијата потребно е внимателно да се дизајнираат експерименти, кои покажуваат
увид на параметрите на методот [13].
Доколку е развиена метода за широка примена, потребен е меѓулабораториски
пристап на валидација. Во тој случај, две или повеќе лаборатории испитуваат
идентичен аналитички примерок. Предност на меѓулабораторискиот пристап на
валидација е тоа што објавените податоци (прецизност и точност) значително го
намалуваат опсегот на работа за идните лаборатории, кои ќе користат одредени методи
на валидација [13].
Лабораторискиот пристап се користи кога одредена метода е потребна за некоја
цел, но претходно не е објавена како стандард. Исто така, се користи кога е потребна
само една лабораторија, во која при различни услови и во различни временски
интервали, се применуваат методи за анализирање на исти или различни примероци
[13].

Стандарди и постапки при валидација

При валидација на метод се користат слепи проби (blanks), за да се утврди кој дел
од мерениот сигнал навистина се должи на присуството на аналит и кој е предизвикан
од други супстанци присутни во примерокот. Притоа, може да се користат и слепи
проби од реагенси, кои се користат за време на анализата, вклучувајќи ги
растворувачите. Понекогаш е тешко да се приготват примероци на слепи проби, во кои
би биле застапени сите интерференции [13].
Во процесот на валидација се користат и стандарди, кои може да бидат
референтни или сертифицирани референтни материјали. Разликата е во тоа, што
сертифицираните референтни материјали подлежат на построги контроли и нивната
карактеризација се врши со различни процедури. Овие материјали се користат за
различни начини, на пример тие можат да се користат за калибрации или потврда на
методата на мерење [13].
За објективни проценки, неопходно е да се тестира значењето на податоците со
статистичка анализа. Таа обезбедува податоци за мерките на варијабилност (варијанца,
стандардна девијација, опсег) и значајноста на хипотезите (со помош на статистички
тестови), кои зборуваат за исправноста на самиот метод и укажуваат на погрешни
мерења [13].
 Проценка на параметрите на методот

Секој метод, како планиран начин на изведување на анализа на некој примерок има
параметри, со кои треба да се одреди валидација.во зависност од целта на методите,
дали методата е квалитативна или квантитативна, се проценуваат одредени параметри
на методите [12].

Линеарност
Линеарноста (linearity) произлегува од претпоставката дека меѓу две променливи
постои зависност, што може да се претстави со равенка на насоката, во која, како се
зголемува вредноста на едната променлива, така се менува и вредноста на другата
променлива [17]. Гледајќи ја оваа дефиниција од аналитички аспект, тоа значи дека
аналитичкиот сигнал е линеарна функција од количеството или концентрацијата на
аналитот во примерокот.
y=ax+b

За да се одреди линеарноста треба да се извршат минимум пет мерења и тие треба

да се извршат низ целиот опсег на методот. Евалуацијата на добиените резултати може
да се изврши визуелно, односно со линеарна регресиона анализа (метод на најмали
квадрати). Доколку постои линеарна зависност, потребно е да се наведат коефициентот
на корелација, пресекот на оската y (во равенката b) и наклонот (во равенката a) [17].

Точност

Точност е мерка за тоа колку блиску резултатот од експериментот се сложува со

очекуваната вредност [6]. Разликата помеѓу добиениот резултат и очекуваниот резултат се
дели со очекуваниот резултат и се запишува како процент на релативна грешка:

добиен резултат − очекуван резултат

% грешка = х
очекуван резултат
100
 За определување на точноста, се анализира соодветниот аналит во CRM
(сертифициран референтен материјал) со најмалку 6 повторувања [17]. Во пракса – со
користење на метод на стандарден додаток – Аналитички принос (Recovery).

Аналитичкиот принос се изразува преку процентот на приносот на аналитот после

изведувањето на аналитичката постапка [6].

100 ∗ измерена количина

% (𝑅) = додадена количина

Прифатливите граници за точност на аналитичките методи го опфаќаат опсето од 95 до

105%.

Прецизност

Прецизност е показател на репродуцибилноста на мерењето или резултатот. Исто

како точноста, и прецизноста зависи од оние фактори кои влијаат на врските меѓу
сигналот и аналитот. Од особена важност се неопределеностите при мерење на сигналот и
повторливоста во ракувањето со примероците.

Селективност

Селективност (selectivity) е својство на методата да разликува аналит, кој се

одредува во смеса или матрица од други супстанци. Терминот селективност е прекорачан
од IUPAC, но исто така се користи и терминот специфичност, особено во фармацевската
индустрија [11]. Иако често се идентификува во пракса, но овие се различни својства на
методот. Специфичен метод е оној кој може да определи само еден специфичен аналит, а
селективен метод е оној кој може истовремено да определи неколку компоненти кои не се
мешаат едни со други во определувањето [15]. Селективноста покажува колку саканиот
аналит може да се одреди со даден метод со интерференција на други супстанци со
слични карактеристики. Интерференциите може да ги засилат или намалат сигналите што
му се припишуваат на аналитот. При одредување на селективност/специфичност се
користат тестови за идентификација [17].
 Граница на детекција и граница на квалификација

Граница на детекција (limit of detection) е најмало количество на аналит во

примерок, која методот може да ја детектира, но не и квантитативно да ја оопредели.
Граница на квантификација (limit of quantification) е најмало количество на аналит во
примерок, која може квантитативно да се определи со задоволителна прецизност и
точност [17].

Постојат неколку различни пристапи за определување на граница на детекција:

а) визуелна метода – анализа на примерок со позната концентрација на аналитот, се

одредува најмало количество аналит, кое може да се детектира.

b) методa темелена на мерење сигнал и шум – се споредуваат измерени сигнали на

примероксо позната концентрација на аналитот со измерени сигнали на слепата проба и ја
одредува минималната концентрација на аналитот што може со сигурност да се открие.

c) метода темелена на стандардна девијација на одговорот и наклонот на калибрационата

крива.

Границата на детекција (LOD) се пресметува со множење на стандардна девијација

со фактор 3,3 и делење со наклонот на кривата на калибрација [20].
10 𝑅
𝑅𝑅𝑅 =
𝑅

Стандардната девијација се пресметува на различни начини:

а) анализа на слепа проба ( од 6 до 10 мерења) и пресметка на стандардната девијација

b) од кривата на калибрација добиена со анализа на примероци, кои содржат аналит во

опсегот на LOD, користејќи ја стандардната девијација на правецот или опсегот на оската
y [12].

Границата на квантификација (LOQ) претставува најмала количина на аналитот во

примерокот, која може квантитативно да се определи со соодветна прецизност и точност.
LOQ може да се пресмета со равенката:
 10 σ
𝑅𝑅𝑅 =
𝑅

каде наклонот се пресметува од калибрационата крива, а стандардната девијација е

базирана на мерење на аналитичкиот одговор на 10 бленка [20].

Робусност

Робусност (ruggedness/robustness) претставува мерка за капацитетот на

аналитичката процедура да остане неизменета во перформансите по мала, но намерна
варијација во параметрите на методот (стабилноста на реагенсите, време на екстракција,
состав на мобилната фаза, различни колони, рН, температурата) и обезбедува индикации
за сигурноста на методот во текот на нормалното користење.

Квантитативно може да се определи преку тестови на значајност – споредба на

квадратите на стандардните девијации на соодветниот метод на мерените алати пред и
после промената на параметрите [17].
 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ДЕЛ

При валидација на методот следени се следните параметри: линеарност, прецизност,

точност, граници на детекција и квантификација.

Линеарност

Направени се раствори со следните масени концентрации: 1, 2, 5,10, 20, 30, 40 ppb Se.
Апсорбанцата на секој раствор беше отчитана 2 пати и беше пресметана средна вредност.
Добиените податоци се користени за конструирање на калибрациона крива (Сл. 5).

Прецизност

Повторливоста на подготовката на растворот е одредена така што се припремаат

раствори од ист примерок и секој е измерен по 5 пати. Средната вредност и стандардната
девијација се пресметани за повторливост на подготовката на растворот.

Точност

Точноста на методот се изразува како аналитички принос (%) на начин на кој се

припремени три раствори на примерок и на секој им е измерена апсорбанца. Потоа беа
подготвени уште два раствори на примерок, на кој им беа додадени стандардни раствори
со концентрации 10 µg Se и 20 µg Se и секој раствор беше измерен два пати.

3.1 Подготовка на примерок

Потребни реагенси:

o 3 ml HNO3
o 1 ml H2O2
o Приготвен стандарден раствор од селен
o

Подготовка на стандарден раствор од селен

За подготовка на стандардниот раствор, користен е стандарден раствор на селен

1000 mg/L и 2 ml HNO3. Стандардниот раствор се подготвува во тиквичка од 100 ml, при
што потоа тиквичката се надополнува со редестилирана вода.
Примерок 1. Домашно кравјо млеко

Примерок од 3 ml се пипетира во ерленмаер. Се додаваат 3 ml HNO3 и 1 ml H2O2.

Во втор ерленмаер се пипетира 3 ml примерок од кравјото млеко, при што се пипетираат 3

ml HNO3 и 1 ml H2O2 и се додава стандарден раствор при што концентрацијата на
растворот на тиквичката за се зголемува 10 µg/ L (0,5 ml).

Во трет ерленмаер се ставаат исто така 3 ml млеко и се испепитирани 3 ml HNO3 и 1 ml

H2O2, така што во овој случај се додава стандарден раствор при што концентрацијата на
растворот на тиквичката за се зголемува за 20 µg/L (1 ml).

Се загреваат во микробранова печка со моќност од 150 W до потполна дигестија, при што

се ослободуваат азотни оксиди. Загревањето во микробрановата печка се врши 10 минути
со привремени паузи, за да не дојде до целосно испарување, односно да не се изгуби
многу од волуменот. Се остава да отстои преку ноќ. Следен чекор од подготовката на
примерокот е префрлување на примерокот во тиквички од 10 ml и се дополнуваат со
редестилирана вода до марката.

Примерок 2. Ореви

Примерок од ореви 2 g се вагаат во ерленмаер, во кој се додава 3 ml HNO3 и 1 ml H2O2.

Во втор ерленмаер се извагани 2 g примерок од ореви, при што се пипетираат 3 ml HNO3 и

1 ml H2O2 и се додава стандарден раствор при што концентрацијата на растворот на
тиквичката за се зголемува за 10 µg/L (0,5 ml).

Во трет ерленмаер се ставаат исто така 2 g ореви и се испепитирани 3 ml HNO3 и 1 ml

H2O2, така што во овој случај се додава стандарден раствор при што концентрацијата на
растворот на тиквичката за се зголемува за 20 µg/L (1 ml).

Се загреваат во микробранова печка со моќност од 150 W до потполна дигестија, при што

се ослободуваат азотни оксиди. Загревањето во микробрановата печка се врши 10 минути
со привремени паузи, за да не дојде до целосно испарување, односно да не се изгуби
многу од волуменот. Се остава да отстои преку ноќ. Следен чекор од подготовката на
примерокот е префрлување на примерокот во тиквички од 10 ml и се дополнуваат со
редестилирана вода до марката.

Примерок 3. Пилешки стек

Најпрво примерокот од стек се хомогенизира.

Примерок од стек 2 g се вагаат во ерленмаер, во кој се додава 3 ml HNO3 и 1 ml H2O2.

Во втор ерленмаер се извагани 1 g примерок од стек, при што се пипетираат 3 ml HNO 3 и 1

ml H2O2 и се додава стандарден раствор при што концентрацијата на растворот на
тиквичката за се зголемува за 10 µg/L (0,5 ml).

Во трет ерленмаер се ставаат исто така 1 g стек и се испепитирани 3 ml HNO 3 и 1 ml H2O2,

така што во овој случај се додава стандарден раствор при што концентрацијата на
растворот на тиквичката за се зголемува за 20 µg/L (1 ml).

Се загреваат во микробранова печка со моќност од 150 W до потполна дигестија, при што

се ослободуваат азотни оксиди. Загревањето во микробрановата печка се врши 10 минути
со привремени паузи, за да не дојде до целосно испарување, односно да не се изгуби
многу од волуменот. Се остава да отстои преку ноќ. Следен чекор од подготовката на
примерокот е префрлување на примерокот во тиквички од 10 ml и се дополнуваат со
редестилирана вода до марката.

3.2 Стандардни раствори

За квантитативно определување на селен во примероците потребно е да се

подготви и серија од стандардни раствори со точно познати концентрации на селен. Пред
да се започне со разредување на стандардот, потребно е да се стават по 2 ml азотна
киселина во секоја тиквичка за да се задржи стабилноста на селенот. Од истата причина
потребно е растворите да се подготват непосредно пред изведување на мерењата. Од
почетниот стандард со концентрација 1 g/L, односно 1000 ppm, се подготвува првото
разредување со додавање на 1 ml од стандардот во тиквичка од 100 ml, при што се добива
раствор со концентрација од 10 ppm, односно 10 000 ppb. Второто разредување се прави
од првото разредување со ставање на 10 ml во тиквичка од 100 ml со што се добива
концентрација од 1000 ppb. Од оваа концентрација се подготвува серија раствори со
концентрации 1,2, 5, 10, 20, 30 и 40 ppb со додавање на соодветни волумени во тиквички
од по 100 ml, дадено во Табела 3.

Табела 3. Концентрации и волумени за подготовка на стандардни раствори

c = 40 ppb V1 = 4 mL

c = 30 ppb V1 = 3 mL

c = 20 ppb V1 = 2 mL

c = 10 ppb V1 = 1 mL

c = 5 ppb V1 = 0,5 mL

c = 2 ppb V1 = 0,2 mL

c = 1 ppb V1 = 0,1 mL

Сите стандарди се приготвуваат во тиквички од 100 mL, при што во секоја од нив се
додава 2 mL азотна киселина и се дополнува со редестилирана вода до марката. Се мери
апсорбанцата на секое разредување.

3.3 Пресметки

Пресметките се вршат така што вредноста на апсорбанцата за слепа проба се одзема од

вредноста на апсорбанцата за соодветниот примерок.

А = Апримерок – Аслепа проба

Добиената апсорбанца за секој примерок се пренесува на калибрациона крива, од која

потоа се чита концентрацијата на селен во анализираниот примерок.
 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА

4.1 Подготовка на примерок

Примерокот за анализа со ETAAS треба да е во течна форма или во форма на

раствор. Беше направен обид за растворање во погоден растворувач на цврстите
примероци кои беа предмет на истражување во оваа дипломска работа. Според
литературните податоци, во случај кога примероците не се раствораат, може да се
разложат со загревање со HNO3, H2SO4 или HClO4, во водена бања или во микробранова
печка.

При изработката на оваа дипломска работа успешна дигестијана примероците

беше постигната со нивно третирање со смеса од HNO3 и H2O2 со волуменски однос (V:V
= 3:1) и нивно разложување со помош на микробранова печка или едноставно со стоење
преку ноќ на собна температура.

. Микробранова печка користи микробранови кои се дел од електромагнетниот

спектар. Како сите електромагнетни бранови така и микробрановите имаат осцилирачки
електрични и магнетни полиња. Дел од примерокот што е ставен за дигестија во
микробранова содржи вода во себе. Водата е поларна молекула, водородните атоми
градат агол од 104° и имаат делумно позитивен полнеж, а кислородот има делумно
негативен полнеж што значи дека водата се однесува како дипол. Кога се аплицира
електомагнетно поле кое осцилира во одредена насока, истата осцилација ја има и
молекулата. Бидејќи електромагнетното поле осцилира многу пати во текот на една
секунда истото го прави и водата, поради што доаѓа до загревање на
примерокот и негова дигестија.
Загревањето со микробранови се врши со паузи, за да не дојде до целосно
испарување на примерокот. Серија загревања од 20 с, со паузи од по 10 ѕ се покажа како
најдобар експериментален услов за изведување на дигестијата. Откако е избран
најпогодниот метод, следува подготовка на сите примероци по истата постапка. Според
податоци од литература, се определува колкава маса од секој примерок треба да биде
извагана.
 4.2 Валидација на метод за определување на селен

Валидацијата беше извршена според избраните параметри како што беше наведено
во експерименталниот дел.

Врз основа на измерените апсорбанци на серијата стандардни раствори, чија

подготовка е опишана во експерименталниот дел од оваа анализа, добиени се следните
резултати и направена е калибрација, односно конструирана е калибрациона права.

γ (ppb) Asr
1 0,011
2 0,017
5 0,028
10 0,044
20 0,087
30 0,124
40 0,156

Зависноста меѓу апсорбанцата (А) и масената концентрација (γ/ppb) е линеарна во

испитуваното концентрациско подрачје, со висок степен на корелација. За да се искористи
равенката на права за процена на концентрации на испитуваните примероци од млеко,
ореви и стек, потребно е да се определи стандардната девијација, односно прецизноста на
пресметаните константи на наклонот и пресекот (a и b).

0,1
8
0,1
6
0,1
4
0,1
2
0,1
0,0
8
0,0

0 1 2 3 4 5
Сл.5. Калибрациона права добиена според методот на најмали квадрати
 Табела 4. Линеарност на метод за определување на Se
Линеарност
Равенка на регресиона права y = 0,0037x + 0,0092
Коефициент на корелација R2 = 0,9981

Табела 5. Статистички параметри на калибрациона права при определување на Se

Средна вредност 11.390
STD/ppb 0,33
LOD/ ppb 0,99
LOQ/ ppb 3,30
RSD/ % 2,89
Концентрациско подрачје/ ppb 1-40
Најниската концентрација на Se што може да се детектира во примероците од
ореви, стек и млеко со овој метод изнесува 0,99 µg, што укажува на негова висока
осетливост. Концентрацијата на Se во секој од примероците е пресметана врз основа на
добиените резултати за апсорбанцата на анализираните примероци и калибрацијата на
стандарните раствори на селен со позната концентрација. Сите добиени вредности се над
границата на детекција (LOD) и над границата на квантификација (LOQ). Овие вредности
се пресметани со множење на стандардната девијација од масената концентрација на пет
повторени мерења на пробата со 3 за LOD, односно 10 за LOQ. Сите податоци се
прикажани во Табела 5.

Табела 6. Аналитички принос – Recovery (%)

Примерок Концентрација Додаток Аналитички принос
γ(ppb) (µg ) (%)
Млеко 4,65 0
14,42 10 97,74%
24.01 20 96,80%
Ореви 6,95 0
16,77 10 98,27%
26.71 20 98,80%
Пилешки стек 13,14 0
 22.75 10 96,13%
32.98 20 99,60%

Добиените резултати укажуваат дека применетиот метод е во границите на

прифатливост и може да се користи за определување на селен во храната. Прифатливата
граница за точност на аналитичките методи се движи од 95 до 105%. Аналитичкиот
принос, прикажан во Табела 6. се движи од 96,13% за примерок на стек со додавање на
стандарден додаток од 10 ml до 99,60% за истиот примерок, но со додаден додаток од 20
ppb.

Табела 7. Добиени вредности за анализираните примероци

Примерок γ(ppb Asr m на проба m(Se) во 10 mL/µg m(Se) во проба/

)
(µg/kg)

Млеко 4,65 0,0266 3 mL 0,05 15,50

Ореви 6,95 0,0352 2g 0,07 34,73

Стек 13,14 0,0584 1g 0,13 131,42

Концентрацијата на селен во секој од примероците е пресметана врз основа на добиените

резултати за апсорбанцата на анализираните примероци и калибрацијата на стандардните
раствори на селен со позната концентрација. Врз основа на добиените вредности за тие
концентрации изразени во ppb, пресметана е масата на селен во 10 ml примерок,а потоа
добиена е маса на селен во 1 kg примерок, изразена во 1µg.
 Табела 8. Референтни и експериментално добиени вредности за маса на Se во 100g примерок
Референтни вредности Експериментално добиени
вредности

Примероци m(Se) во µg m(Se) во µg

Домашно кравјо млеко 8,0 1,55

Ореви 3,8 3,473

Пилешки стек 21,3 13,142

Од претходно направени анализи и од Табела 8, може да се забележи дека масата на селен

во домашното кравјо млеко е значително помала за разлика од млекото произведено во
млекара. Причина е тоа што се користат разни адитиви, кои се хемиски супстанци, кои се
додаваат во храната, со цел да се зачуваат или изменат нејзините карактеристики на
подолг период. Додека пак, кај оревите масата на селен во нив е слична со очекуваните
референтни вредности. Нивото на селен кај пилешкиот стек е значително помала од
референтните вредности.
 5. ЗАКЛУЧОК

Селенот е еден од основните елементи во трагови, кој е неопходен за правилно

функционирање на сите организми. Количеството на овој селен, присутно во природата и
во човечкиот организам е многу разновидно, во зависност од географскиот регион и од
исхраната. Оптимална дневна доза на селен е утврдена на 55 µg кај здрава возрасна
индивидуа. Селенот е кофактор на многу ензими, на пример, глутатион пероксидаза или
тиоредоксин редуктаза. Селенот го има во храна, која е богата со протеини, како што се
бразилските ореви, морските млодови, месото, јајцата, јаткастите плодови.

За определување на селен во храната применета е електротермичка атомска

апсорпциона спектроскопија, при што како атомизер се користи графитна цевка. Потребен
е многу мал волумен од примерокот за испитување.

Од направените мерења и добиените пресметки за линеарност, гранична детекција,

гранична квантификација, точност и прецизност се покажува дека методата е валидна за
определување на селен во прехрамбени производи. Методата се покажува како брза и
практична со оглед на бројот на примероци и времетрањето за анализа на еден примерок.

Содржината на селен во различни примероци на домашно млеко, ореви и пилешки

стек беше утврдена со методот на крива на калибрација и се движеше од 15,50 до 131,42
µg/kg.

Добиените резултати не се совпаѓаат во целост со референтните вредности за

масата на селен во млекото, оревите и пилешкиот стек. Од претходно направените анализи
може да се заклучи дека во домашното кравјо млеко има помало количество на селен, за
разлика од преработеното млеко, што значи дека се додавани разни адитиви и суплементи.
 6. ЛИТЕРАТУРА

[1] Зоран Кавраковски, Весна Рафајловска; Токсикологија на храна, ТМФ (2019)

[2] Трајче Стафилов; Интерна скрипта, Токсиколошка хемија, Институт за хемија, (2005)

[3] Селен/ Wikipedia

[4] Davis CD. Selenium supplementation and cancer prevention. Curr Nutr Rep 2012; 1:16-23
[5] https://zdravjeihrana.mk/antioksidansi/

[6] Харви; Поглавје 10. Спектроскопски методи на анализа, Модерна аналитичка хемија

[7] М. Стефова; Предавање 7а, Инструментални аналитички методи (Б), Институт

за хемија, (2013)

[8] https://www.fakulteti.mk/news/25092021/selen---mikroelement-so-makrouloga

[9] Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes: Vitamin
C, Vitamin E, Selenium, and Carotenoids. National Academy Press, Washington, DC,
2000.

[10] https://www.slideshare.net/antontsusic/zn-seaasseminar
[11] Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), International
Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration ofPharmaceuticals for
Human Use, 2005

[12] Guidelines for the Validation of Chemical Methods in Food, Feed, Cosmetics, and
Veterinary Products 3rd Edition, U.S. Food and Drug Administration, Foods Program, 2019.

[13] The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics 2nd Edition, Eurachem, 2014.

[14] Pravilnik o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata, Narodne novine broj 2/05

[15] Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis, Vol
74, International Union of Pure and Applied Chemistry, 2002., 835-855.
[16] Sunde RA. Selenium. In: Ross AC, Caballero B, Cousins RJ, Tucker KL, Ziegler TR, eds.
Modern Nutrition in Health and Disease. 11th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams &
Wilkins; 2012:225-37

[17] Lazarić K: Validacija analitčkih metoda – osnovna načela. Svijet po mjeri. ISSN 1848-7114.
- 1; str. 61-64, 2012

[18] https://vitamini.hr/dodaci-prehrani_1/selen-1672/

[19] https://fingernal.ru/mk/nail-disease/selen-sposob-primeneniya-selen-se-antioksidant-
zashchitnik-sposobnyi/

[20] https://www.nijz.si/sl/priporoceni-dnevni-vnosi-vitaminov-in-mineralov

[21] Горан Стојковиќ; Презентација; Управување со квалитет во хемиска

лабораторија, Институт за хемија