Mitokondriális permeábilitás

tranzíció

Apoptózis és nekrózis
Sejtjeink környezeti ingerekre adható válaszai

Élj tovább!

Osztódj!

Differenciálódj!

Halj meg!
 Kétféle sejthalál
Nekrózis - „Gyilkos útvonal”
Passzív mechanizmus, energiát
nem igényel
(mechanikai sérülés, toxinok)

Apoptózis – „Öngyilkos útvonal”

Aktív vagy programozott
sejthalál, energiaigényes
folyamat
(valami rákényszeríti a sejtet)
 A nekrózis definíciója:
Patológiás sejt- és szövetpusztulás. Sejten kívüli károsító tényezők akut
hatására bekövetkező sejthalál, melyet a sejt nem képes szabályozni. A
mitokondriumok sejtlégzési működése sérül, emiatt az ATP termelés csökken,
ami a sejt és környezete közötti ozmotikus egyensúlyt fenntartó
iontranszportokat gátolja. Ezért a sejt az ozmotikus vízfelvétel miatt duzzadni
kezd, majd kipukkad.

Az apoptózis definíciója:
Belső vagy külső jelek hatására beindított programozott sejthalál, melynek
során a sejtek aktívan, szabályozott körülmények között felszámolják magukat.
Ennek érdekében – részben meglévő, részben viszont újonnan létrehozott
fehérjemolekulákból álló – halálgépezetet képesek létrehozni, mely
mechanizmus, ha ténylegesen beindul, vissza nem fordítható folyamatként
halad előre egészen a rendszer teljes redukciójáig.
 Apoptózis: „
“ÖNGYILKOS PROGRAM”
programmed cell death – PCD

„falevelek hullása”, minden sejt életében van egy

programozott időpont, amikor elpusztul
 Az apoptózis genetikája

• Caenorhabditis elegans –
apoptózisban szerepet
játszó gének vizsgálata

• 1090 szomatikus sejtből

131 apoptotizál

• 14 CED (cell death) gén,

melyek homológjai
emlősben is
megtalálhatók
 Az apoptózis szerepe

• Normális fejlődés, a celluláris homeosztázis

regulációja
• Sejtosztódás (Proliferáció)

• Apoptózis (Fiziológiás sejthalál)

• Patológiás folyamatok kezelése

 Apoptózis fiziológiai
folyamatokban I
-Embriogenezis

ujjösszenövés

-Idegrendszeri változások (születés után a

szinapszisok 50%-a elpusztul)
 Apoptózis fiziológiai
folyamatokban II
Hormon dependens fiziológiai visszafejlődés

-A megnagyobbodott méh szülést

követő visszafejlődése
-Az endometrium menstruáció
alatti lelökődése
- Az emlő mirigyállományának
visszafejlődése az ablaktációt
követően
Apoptózis fiziológiai folyamatokban III
 Apoptózis pathológiás állapotokban
I. Fokozott mértékű apoptózis: Túlzott mértékű apoptózishoz kapcsolódó
• Atrófiás folyamatok (vese, máj) betegségek
1. AIDS
• Virális fertőzések (HIV) 2. Neurodegeneratív betegségek:
• Immunrendszer-mediálta sejthalál - Alzheimer kór

(kilökődés, graft versus host) -Parkinson kór

• Celluláris károsodás (sugárzás, -Retinitis pigmentosa

3. Mielodiszpláziás szindrómák:
kemoterápia, mérgek) -Aplasztikus anémia
4. Iszkémiák:
II. Csökkent mértékű apoptózis:
-Szívinfarktus
•Daganatos betegségek kialakulása -Agyi iszkémia
5. Toxin indukált májbetegség:
•Fejlődési rendellenességek -Alkoholizmus
 Az apoptózis morfológiája
• Sejt zsugorodik, lekerekedik
• Sejtmembránról hólyagok
válnak le
• Sejtmag pyknotikussá válik
• Kromatin-kondenzáció,
DNS fragmentáció
• ER szerkezete fellazul
• Riboszóma aggregáció
• Citoplazmában vakuólumok
• Sejtmembrán ép marad
• Apoptotikus testek
• Nem kerülnek makromolekulák
az extracelluláris térbe
• Nincs gyulladásos reakció
 A nekrózis morfológiája
• Általában fizikai vagy
kémiai hatás következménye
• A sejtmag szerkezete nem
változik
• Sejtszervek szétesnek
• Sejt jelentősen megduzzad
• Sejtmembrán szétrobban
• Sejttartalom az extacelluláris
térbe jut!
• Gyakori gyulladásos válasz
A nekrózis és az apoptózis elkülönítése
agaróz gélelektroforézissel
Apoptózis esetén a programszerű biokémiai
folyamatok DNS „létrát” hoznak létre

Hogyan történik az apoptózis?

Sejtmag
Endonukleázok - a DNS hasítása a linker
régióknál -n x 180bp – DNS létra
 Caspázok
-Kaszpázok (17 féle, Asp-nél hasítják a fehérjéket, autokatalízis)

- Kaszkádsort alkotnak

A kaszpázok aktiválódása

Prokaszpáz
Nekrózis esetén a membránok szétesése miatt
a nukleázok és egyéb emésztőenzimek
random módon darabolják a DNS-t
 Proapoptotikus Antiapoptotikus
faktorok faktorok

•Tumor szupresszorok • Növekedési faktorok

– p53, bax, bak

• Vírus proteinek
•Stressz
– Ozmotikus, pH • Protoonkogének
– Stressz fehérjék (hősokk
proteinek) • (Bcl-2, Bcl-XL)
– ROS, RNS
BCL fehérjék, apoptózis regulátorok
 A BCL-2 fehérje

-A BCL-2 fehérje a család első ismert tagja

-25 kilodalton tömegű fehérjét kódol
-Membránstabilizáló fehérje!
-Megköti a BAX fehérjéket
-Gátolja a mitokondrium membrán depolarizációját
 A p53 szerepe az apoptózisban
Sérült DNS

p53 Proapoptotikus gének (bax, apaf-1)

Antiapoptotikus gének (bcl-2)

p21
Apoptózis
Sejtciklus megállása

DNS kijavítás Nincs javítás

Sejtciklus folytatása

APAF1: apoptotic peptidase activating factor 1

 Apoptotikus útvonalak
• Extrinsic - Receptor mediálta útvonal
(1. típusú apoptózis)
halál receptorok/halál domén

• Intrinsic – Nem receptor mediálta útvonal

(2. típusú apoptózis)
mitokondrium
Apoptotikus útvonalak

ROS-ok,
DNS sérülés
Receptor mediálta apoptózis
•DISC (death initiation signal
complex)

•TNF-alpha - TNF receptor -

TRADD (TNF Receptor-
associated death domain)

•FAS Ligand - FAS Receptor -

FADD (Fas-associated death
domain)

•FADD-DED (death effector

domain) - caspase 8-DED

•Efflux of mitochondrial proteins

(cit-c)

•Activation of effector caspases

•DN-ase
 FAS és TNF receptoron
keresztül történő aktiváció
DISC: Death initiation signal complex
 Nem receptor mediált apoptózis I

XIAP: X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein

APAF1: apoptotic peptidase activating factor 1
Nem receptor mediált apoptózis II

Smac/DIABLO Apoptózis Indukáló Faktor

Citokróm c

OMI Endonukleáz G

Kaszpáz függő útvonal Kaszpáz független útvonal

 Kaszpázok
-Iniciátor kaszpázok (pl.2,8,9,10) szubsztrátjai: effektor
kaszpázok

-Effektor kaszpázok (pl.3,6,7) szubsztrátjai:

Inaktiválódnak/hasítódnak: laminin

Citoszkeleton reguláló fehérjék

DNS repair enzimek (PARP)

Aktiválódnak: endonukleázok (CAD)

PARP szerepe a DNS Repair-ben
(a)

Repair
enyzme
PARP

(b)
Inhibitors
Poly
(ADP-ribose)

(c)

(d)
 Mitokondriális Permeábilitás
Tranzíció (MPT) és Apoptózis
•MPT = mitokondriális membránok megnövekedett
áteresztőképessége az 1500 Da alatti molekulákra
•MPTP = mitochondrial permeability transition pore
Proteinekből álló pórus a 2 mitokondriális membrán között,
mely bizonyos fiziológiás és patológiás folyamatok során
kinyílhat.
MPTP nyílása:
Mitokondriumok duzzadása
külső mitokondriális membrán felszakadása
proapoptotikus fehérjék kiáramlása
apoptózis
 MPT indukáló faktorok

•Megnövekedett Ca2+ szint

•Zsírsavak
•Anorganikus foszfát
•Reaktív oxigén gyökök (ROS)
•Nitrogén-monoxid
 MPT szerepe patológiás
folyamatokban
•Traumás agysérülés
•Infarktus
•Stroke
•Ischemia

Ischemia alatt az MPTP zárva marad, viszont

reperfúzió alatt kinyílik és ezzel hozzájárul a
reperfúziós károsodáshoz.
Mitokondriális Permeábilitás Tranzíció
 Az MPTP szerkezete
1. Külső és belső
mitokondriális
membrán
2. VDAC (Feszültség üggő
anion csatorna)??
3. ANT (Adenin nukleotid
transzlokáz)
4. Cyclophillin-D

BD-receptor
(Benzodiazepin receptor)
Hexokináz
Inhibítorok: Cyclosporin-A ( Cycliphillin-D-t gátolja!), Bongkrekate,
Sangliferin-A
Aktivátor: Atractyloside
 PT detekció Fluoriméterrel

100
1
Scattering 540nm

3
7
50 6

5
4
2
0
5 min.
1. Kontrol 6. 2.5uM Amiodarone
2. 150nM Ca2+ 7. 20uM Amiodarone+ 2.5 uM CsA
3. 2.5 uMCsA + 150 uM Ca 2+
4. 20uM Amiodarone
5. 10uM Amiodarone
Az apoptózis megfigyelésére használt „gold
standard” technikák

•Mikroszkópia

•DNS integritás vizsgálatok (TUNEL, Létra)

•Kaszpáz aktivitás mérése
•Annexin V teszt
•Mitokondriális fehérjekiáramlás
 Apoptózis detektálása
mikroszkópikus eljárásokkal
 Annexin Vjelölés
• Az apoptózis korai szakaszában
alkalmazható
• Változások zajlanak a sejt felszínén és a
plazma membránban
• A foszfatidil – szerin oldalláncok
transzlokálódnak a membrán külső
rétegbe
• az annexin V specifikusan a kifelé álló
foszfatidil-szerin oldalláncokhoz kötődik
• az annexin V- foszfatidil-szerin kapcsolat
létrejötte az annexinV-höz kötött
fluoreszcens festék (FITC-zöld vagy
fikoeritrin-piros) segítségével
detektálható
Annexin V jelölés

Fiziológiás Apoptózis

Apoptózis indukálás után

 A DNS-létra kimutatása agaróz
gélelektroforézissel
• az apoptózis biokémiai jellemzője a
genomikus DNS fragmentációja
• a plazmamaembrán permeábilitásának
megváltozása előtt detektálható (korai
esemény)
• apoptóziskor a nukleáris endonukleázok
aktiválódnak
• ezen enzimek szelektíven a nukleoszómák
között hasítják a DNS-t
• mono- és oligonukleoszómális DNS
fragmentek keletkeznek
 Kaszpáz aktiváció mérése
• Western-blot analízis

Doxazosin (25mM) Tamsulosin (25mM)

Time (h) 0 3 6 9 12 24 0 3 6 9 12 24
32KDa

Caspase-3 17KDa

a-Actin 42KDa

• Fluoreszcens festékkel jelölt szubsztrát

Sejt permeábilis szubsztrátok esetében: mikroszkópos detektálás
 Mitokondriális fehérjék
kiáramlása

• Citokróm C
• AIF (apoptózis indukáló faktor)
• EndoG (endonukleáz G)
• Smac/DIABLO
• Omi
Mitokondriális fehérjekiáramlás
vizsgálata Western blottal
- + - +
Ca2+
- - + +
CsA

AIF P
S
AIF

EndoG P

S
EndoG
P
cyt-c

cyt-c S
 Mitokondriális fehérjekiáramlás
vizsgálata fluoreszcens festékekkel
 A membránpotenciál változás
detektálása fluoriméterrel
100 Rhodamine1,2,3
Mitochondria
F l uorescent int ensit y

6
50
5

4
3
2
0 1
1 min.
1. Kontrol 5. 100uM Ca2+
2. 10uM Ca2+ 6. 150uM Ca2+
3. 20uM Ca2+
4. 50uM Ca2+
 Minimumtematika
Az apoptózis és a nekrózis definíciója,
morfológiai jellemzésük
fiziológiai és patofiziológiai jelentőségük
A nekrózis és az apoptózis mechanizmusának
összehasonlítása.
Az apoptózis kialakulásának két fő útvonala.
A TNF-receptor szupercsalád fehérjéinek szerepe.
A kaszpáz enzimek csoportosítása az apoptózis
folyamatában.
A mitokondrium és fehérjéinek szerepe az apoptózisban.
A mitokondriális “permeability pore” (csatorna) szerkezete,
aktivátorai, inhibítorai;
A BCL fehérjecsalád: pro-apoptotikus és anti-apoptotikus
fehérjék;
Az apoptózis detektálásának módszerei
 Nekrózis
súlyos következménnyekkel jár

06.02.2014 48
 Példák nekrózisra az orvosi
gyakorlatból:

 Stroke/agyi infarktus
 Myocardial infarction
 Máj károsodások
 vese károsodások
Keringési elégtelenség

06.02.2014 49
 Nekrózis gyakorlati kimutatása:
“Myocardial enzymes”
„szív enzimek”
(CPK, troponin)

“Liver enzymes”
„máj enzimek”
(GOT, GPT etc.)

“Cell death”
„halál enzimek”
(LDH, etc.)
06.02.2014 50
 Nekrózis kialakulásának okai:

• Hypoxia
• Physical Agents
• Chemicals and Drugs
• Microbiologic Agents
• Immunologic Reactions
• Genetic Defects
• Nutritional Imbalances

06.02.2014 51
 Nekrózis kialakulása

• Ischémia
• Cytotoxikus anyagok (e.g. acetaminophen)
• Aktivált szabadgyökök (O2.-, H2O2, OH. )
– Sugárzás
– Gyulladás
– Oxigéntoxiciás
– Reperfúziós károsodás

06.02.2014 52
 Nekrózis

06.02.2014 53
 Poly(ADP-ribosyl)ation reaction

Ad

Nic-R-P-P-R Ad Ad
(NAD+)
R-P-P-R-R-P-P-R

Ad Ad Ad
N
PARP Glu -R-P-P-R-R-P-P-R-R-P-P-R-R-P-P-R +
CONH 2

06.02.2014
Nic 54
 PARP szerepe a DNA Repair során
(a)
Repair
enyzme
PARP

(b)
Inhibitors
Poly
(ADP-ribose)

(c)

06.02.2014 55
(d)
 Poly(ADP-ribosyl)ation
reaction Nic

poly(ADP-ribose)

Histones, nuclear proteins

NAD+ PARP

06.02.2014 56
Poly-ADP-ribosylation reaction
Nic

poly(ADP-ribose)

Histones, nuclear proteins

NAD+ PARP

06.02.2014 57
 Poly(ADP-ribosyl)ation
reaction Nic
ADP-ribose PARG

poly(ADP-ribose)

Histones, nuclear proteins

NAD+ PARP

06.02.2014 58
 ONOO-

S-mustard NAD+

PARP DNA
UV (active) repair 
•

ADPR
NA ADPR
H2O2 ADPR
ADPR

ADPR
• PARP ADPR
(inactive)
Alkylating agents
NAD+, ATP 
Ionizing radiation
06.02.2014
Necrosis  59
PARP reguliert Route von Zell Tod
 PARP szerepe akut
megbetegedésekben

Myocardial infarction (TPA / PTCI)

Cardiopulmonary bypass
Heart transplantation
Prostatic nerve injury (ED)
Cancer (adjunct to chemotherapy)
 PARP szerepe krónikus
megbetegedésekben
Neurodegeneration
Diabetic complications
Atherosclerosis
Cardiovascular aging
Arthritis, Colitis, Uveitis