1.

ТЕМА
Основни характеристики на аналитичните техники, използвани
в клиничната практика
Параметри на анализа
Всяка аналитична техника се характеризира с т.нар. аналитични
характеристики, служещи за сравнение и оценка:
точност (Accuracy) или прецизност – представлява близостта между
получените резултати от няколко независими анализа. Количествено тази
аналитична характеристика се изразява чрез повторяемост и възпроизводимост:
повторяемост (Repeatability) – представлява степента на съвпадение на
получени резултати от няколко последователни измервания на един и същ
параметър, проведени в кратък интервал от време, при еднакви други условия
(метод, апаратура, условия на околната среда), от един и същи оператор;
възпроизводимост (Reproducibility) – представлява степента на съвпадение на
получени резултати от няколко последователни измервания на един и същи
параметър, които са проведени при различни други условия (напр. отдалеченост
във времето, различни оператори и др.). Тази характеристика на практика
демонстрира сходството на получените резултати при повторно изследване на
един и същ материал. Тя се използва за междулабораторни сравнения. За да се
изведе са необходими резултатите от поне 3 ÷ 6 измервания.
линеен обхват (Linear range) – представлява областта от стойности на
изследваната величина, в която получения от детектора сигнал е линейно
зависим от количеството (концентрация или маса) на изследвания аналит.
Анализът може да се извършва САМО в този интервал от стандартна крива
(права):
работен обхват (Work range) – представлява обхвата от нива
(концентрационни или тегловни) за определяемия аналит, за които методът е
приложим и целесъобразен. Броят работни нива се определя съгласно
нормативните документи за съответната група аналити, като най-ниското трябва
да е границата на детекция
специфичност (Specificity) или селективност (Selectivity) – отчита
способността на даден метод да се използва за анализа на определен аналит. Тук
значение има принципа, на който се основава метода за детекция на аналитите
(напр. не може с УВ детекция да се детектират съединения, които НЕ
притежават хромофори или с флуоресцентен детектор такива които НЕ
флуоресцират). Тук трябва да се вземе предвид и влиянието на компонентите на
матрицата върху детекцията и анализа.
чувствителност (Sensitivity, LOQ – limit of quantification) S – дава представа
за възможността на избрания метод да улавя (определя) най-малките разлики в
концентрацията на аналита. Този параметър ни дава най-ниската концентрация,
която може да бъде количествено определена с добра достоверност.
Чувствителността се определя от наклона на калибровъчната графика (slope).
Изразява се математически чрез отношението на нарастването на измерваната
величина (у) за единица от изследваното вещество (х). Напр. ако изследваната
величина е рефрактивен индекс (n), а измерваната величина е концентрация (с),
то чувствителността S = n/c. Оптималния наклон на калибровъчната права за
лабораторна диагностика е 45о.
Когато се използва техническа средство, с определен калибрационен обхват,
границата на количествено определяне съвпада с първата (най-ниската) точка от
този обхват. Освен това LOQ = 10S0
където, S0 - стандартното отклонение, получено след изпитване на празни проби
с дименсия еднаква с тази на измерваната величина.
граница на откриване (LOD – limit of detection) – показва най-малкото
количество от аналита, което може да бъде открито с аналитичния метод. Това е
най-малкото количество от даден аналит, което дава сигнал, различен от шума
на аналитичната система. Необходимо е сигнала (измерваната величина) от
количеството вещество достоверно да се различава от този на празна проба, в
която то липсва. При инструменталните методи за анализ LOD обикновено е
сигналът, който превишава 3 пъти шума на аналитичната система или LOD =
3S0.
Изготвяне на калибрационна права
За да се определи неизвестна концентрация на един аналит е необходимо да се
построи т.нар. стандартна права. Тя представлява част от т.нар. процес на
калибриране на апаратурата (инструмента). Това е процес на определяне на
математическа зависимост между измервания от детектора сигнал (напр.
абсорбция, големина на електричен сигнал и др.) и търсената величина (напр.
концентрация, активност, маса и др.). Тя се построява като се използват
предварително приготвени стандартни разтвори от изследваното вещество с
позната концентрация. За да се направи калибрирането най-често се използва
т.нар. метод на вътрешния стандарт. Това е вещество, което има сходни
отнасяния като определяния аналит и то се внася във всеки от стандартните
разтвори в едно и също количество, което най-често отговаря на най-ниското
или най-високото количество от определяемия аналит. Получените проби се
подлагат на реалната пробоподготовка през, която ще преминат пробите с
неизвестна концентрация на аналита. По този начин се осигурява определен вид
самоконтрол на възможните грешки в процеса на пробоподготовка. След това
приготвените стандартни разтвори на аналит и вътрешен стандарт се
инжектират в апарата като се построява графична зависимост на площта на пика
А от концентрацията на аналита С (А = f (C)):

Калибрационна права
0.7
0.6
f(x) = 0.102142857142857 x + 0.00214285714285722
R² = 0.995375778816199
Атърс./Авътр.ст.

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
концентрация С

На абсцисната ос се нанася концентрацията на търсения аналит, а на

ординатната отношението от площите на търсения аналит (А търс.) и вътрешния
стандарт (Авътр.ст.): (Атърс.)/(Авътр.ст.). След построяването на стандартната права за
даден аналит, към пробата с неизвестна концентрация се прибавя същото
количетсво вътрешен стандарт и тя се инжектира в апарата. От получените
площи на пиковете се изчислява концентрацията на търсеното вещество, като се
използва уравнение на права У = aХ + b. Коефициентите а и b се вземат от
графиката за стандартната права (a е наклона на правата, а b е отреза), y
представлява отношението (Атърс.)/(Авътр.ст.), а х е концентрацията на търсеното
вещество.
Важен показател за линейността е полученият коефициент на линейност
(корелация) R2. Той показва колко близо до идеалната права се намира
получената калибрационна права или казано по друг начин, до колко
получените от измерването точки се намират върху правата линия. Той може да
заедма стойности от 0 до 1. Колкото стойността е по-близо до 1, толкова по-
висока е линейността на правата.
След това е необходимо да се направи проверка за точността на
калибрационната права. Това става чрез изследване на 20 стандартни проби с
концентрация, равна на тази в трета калибрационна точка. Изчислява се
средноаритметичната стойност:

където N е броят измервания и се сравнява с тези, получени при построяването

на стандартната права в същата точка. Изчислява се стадартното отклонение
(SD-standard deviation) и CV% (коефициент на вариация – variation coefficient)
на двадесетте резултата, като се използват формулите:

SD е мярка за разсейването на резултатите около средната стойност. То зависи

от размера на случайните грешки, неопределени по размер и знак. CV е
относително стандартно отклонение. След като се изчислят техните стойности
се построява теоретична стандартна права между нулева и трета точка. При тази
проверка се установяват грешки в аналитичния процес, свързани с пипетиране,
проблеми с реагенти и апаратура. SD между реалната и теоретичната права не
трябва да надминава 1,2.SD.