Univerzitet u Novom Sadu

Prirodno-matematički fakultet
Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu
životne sredine

Lizozim - struktura i funkcija

-Seminarski rad-

Predmetni nastavnik: Kandidat:

dr Daniela Šojić Merkulov, red. prof. Milica Đokić 164/18
dr Nina Finčur

Novi Sad, decembar 2021.

Sadržaj
1. Uvod..................................................................................................................................................1
2. Lizozim iz bjelanca jajeta..................................................................................................................2
2.1. Sekvenca i struktura.....................................................................................................................2
2.2. Veza između aktivnosti i strukture..............................................................................................2
2.3. Antibakterijska i antifungalna aktivnost lizozima.......................................................................3
2.4. Mehanizam antibakterijskog djelovanja......................................................................................4
3. Humani lizozim.................................................................................................................................5
4. Primjene u prehrambenoj industriji...................................................................................................5
5. Izolacija lizozima iz bjelanca jajeta..................................................................................................6
5.1. Prečišćavanje lizozima...............................................................................................................6
5.2. Eksperimentalni postupak izolacije lizozima..............................................................................7
 1. Uvod
Aleksandar Fleming je 1922. godine otkrio supstancu u nazalnoj sluzi kod prehlađenog pacijenta
koja je mogla da ubije određene bakterije, poput Micrococcus lysodeikticus. On je ovu supstancu
nazvao "lizozim". Lizozim, takođe poznat kao muramidaza ili N-acetilmuramid glikanhidrolaza,
antimikrobni je enzim i čini dio urođenog imunog sistema. Utvrđeno je da se ova supstanca javlja i u
drugim tjelesnim tečnostima poput suza, pljuvačke i krvnog seruma. [1]
Lizozimi su definisani kao 1,4-β-H-acetilmuramidaze, koje cijepaju glikozidnu vezu između H-
N-acetilmuraminske kiseline i ostataka N-acetil-D-glukozamina u peptidoglikanu i ostataka N-acetil- D-
glukozamina u hitodekstrinima. Većina gram-negativnih bakterija je izgrađeno od peptidoglikana pa su
zbog toga ove vrste bakterija podložne dejstvu lizozima. U stafilokokama, međutim dolazi do vezivanja
lizozima u njihovom ćelijskom zidu što sprečava njegovu difuziju. Gram negativne bakterije su često
otporne na lizozim, jer lipopolisaharaid koji izgrađuje njihovu spoljnu membranu sprečava difuziju
lizozima, međutim ova zaštita može biti poremećena djelovanjem pH, temperature ili uklanjanjem Ca2+ i
Mg2+ pomoću EDTA. Dakle, koristi se u mnogim drugim područjima, kao što su sprečavanje infekcija,
jer djeluje kao prirodni antibiotik, kao i stimulans imunološkog sistema. Njegova bakteriostatska i
baktericidna svojstva omogućavaju njegovu primjenu u prehrambenoj industriji, farmaciji, kao i u
humanoj i veterinarskoj medicini. [2]
Bogat i lako dostupan izvor lizozima je bjelance ptičijeg jajeta. Lizozim koji je izolovan iz
bjelanceta jajeta (HEWL) je među najpopularnijim proteinima koje koriste hemičari širom svijeta danas.
On predstavlja polipeptidni lanac koji sadrži 129 aminokiselinskih ostataka sa četiri intramolekularna
disulfidna mosta i izoelektričnom tačkom blizu 11.3. U laboratorijskoj praksi se koriste brojne metode
za izolovanje lizozima iz bjelanceta, ali samo neki od njih se koriste u industriji. Najčešće se koristi
hromatografske tehnike, a ponekad i ultrafiltracija. Istorijski gledano, ovaj protein je jedan od najviše
istraženih proteina u biohemiji. Kompletna primarna struktura je razjašnjena 1963. godine (Canfield,
1963; Jolles, 1963), a odmah kasnije 1965. uspostavljena je i trodimenzionalna struktura. Zahvaljujući
jednostavnom dobijanju i maloj veličini, lizozim je bio jedan od prvih enzima koji su sekvencionirani i
čija je struktura određena rendgenskim zrakama, a trenutno se koristi kao model sistema u hemiji
proteina, enzimologiji, kristalografiji i molekularnoj biologiji. [6]
Istraženo je da diamini (1,3-diaminopropan, 1,4-diaminobutan i 1,5-diaminopentan) suzbijaju
termičku agregaciju i inaktivaciju lizozima (Okanojo et al.,2005). Takođe je utvrđeno da hemijska i
termička modifikacija lizozima povećava njegova antimikrobna svojstva. Takav modifikovani lizozim
pokazuje novu, ali nepotpuno definisanu antimikrobnu aktivnost. Nedavna istraživanja su pokazala da
se ovo antimikrobno djelovanje lizozima pripisuje vezivanju za membranu i naknadni poremećaj
njegovih funkcija (Ibrahim et al.,1996). [6]
Osim bakterioloških aktivnosti, lizozim pokazuje i antivirusna i antiinlamatorna svojstva.
Sprovedene studije ukazuju da indukuje aktivnost fagocitoze ćelija, utiče na imunološke procese
stimulisanjem sinteze imunoglobulina i što je najvažnije modulira TNF (tumor faktor nekroze) (Kiczka,
1994). [5]
Lizozimi su širom rasprostranjeni kod životinja, biljaka i virusa i svrstani su u nekoliko klasa:
tipa C, tipa V, tipa G, tipa I i drugi (Bachali et al., 2002). Lizozimi tipa C se sastoje od 119-130
aminokiselinskih ostataka i tu spadaju lizozim izolovan iz kokošijeg jajeta, kao i ljudski lizozim.
Ljudski lizozim ima slična svojstva i 3D strukturu kao kokošiji lizozim. Lizozimi tipa V sastoje se od
oko 140-350 aminokiselinskih ostataka i uglavnom se nalaze u bakteriofagama. Lizozimi tipa G su
široko rasprostranjeni kod ptica, a kod nekih mogu da se nalaze i tip C i tip G. [6]

1
 2. Lizozim iz bjelanca jajeta
2.1. Sekvenca i struktura
Lizozim je jednolančani polipeptid čija primarna struktura (Jolles group and Cofield 1963)
sadrži 129 aminokiselinskih ostataka. Sekundarna struktura se sastoji od dva domena povezana α-
heliksom. Jedan domen, koji sadrži 40-85 aminokiselinskih ostataka, uglavnom se sastoji od β-
segmenata, a drugi domen sadrži 89-99 aminokiselinskih ostataka i to su uglavnom α-spiralni
segmenti (slika 1., A-B). Ova dva domena su odvojena dubokim rascjepom ili pukotinom što
predstavlja aktivno mjesto lizozima u kome su zastupljene vodonične veze (slika 1.,C). [1]

Sl
ika 1. Sekundarna struktura lizozima, prikaz disulfidnih mostova (A), rotirana struktura A (B), prikaz aktivnog
mjesta lizozima (C) [2]

Trodimenzionalna struktura (Blake et al., 1965; Philips, 1966) je utvrđena rendgenskom

analizom i stabilizovana je pomoću četiri disulfidna mosta, koji doprinose izuzetnoj termostabilnosti
proteina. Lizozim je prvi enzim čija je 3D struktura potpuno razjašnjena rendgenskom
kristalografijom. Pomoću ovih rezultata, struktura ovog enzima je razjašnjena, a i predstavljen je
mehanizam reakcije. [2
Nuklearna magnetna rezonanca (NMR) je dobra metoda za proučavanje proteinske strukture,
stabilnosti i funkcije proteina. Trodimenzionalna struktura lizozima je riješena nezavisno od NMR-a.
NMR se takođe koristi za proučavanje dinamike molekula proteina. Prilikom proučavanja analogno
složenog supstrata lizozima, utvrđeno je da je molekul na nekim mjestima postao krut pri formiranju
kompleksa, a da su neki krajevi oslabljeni. Ovaj fenomen nam pokazuje da je to povezano sa
ispoljavanjem aktivnosti (Mine et al., 1999). [5]

2.2. Veza između aktivnosti i strukture

NH2- i COOH- termalne sekvence su podijeljene između aminopeptidaza i karboksipeptidaza.
Manji enzimi, lizilvalin-lizozim 1241 i arginilleucin-lizozim 1251 su uvijek aktivni. Pri malim
jonskim silama arginilleucin-lizozim je čak aktivniji od nativnog molekula, dok pri velikoj jonskoj
sili pokaže se znatno slabiji. [3]
Lizozim sadrži šest ostataka triptofana u jednom molekulu. Nedavne studije su pokazale značaj
nekih od ovih ostataka za biološku aktivnost. Prema nedavnim istragama (Kronman et al.) N-
bromosukcinimid ne pokazuje nikakve specifičnosti u reakcijama sa triptofanskim grupama lizozima.
Zbog toga moramo biti oprezni pri određivanju stepena "izloženosti" bočnih lanaca nativnih proteina.
Brojna istraživanja su pokazala da molekuli lizozima sadrže samo jedan ostatak histidina i ova
aminokiselina nije uključena u aktivno mjesto. Potpuno aktivni lizozimi su oni koji ne sadrže
2
 histidin. [3]
Lizozim sadrži četiri disulfidna mosta i njihovo prisustvo se pokazalo veoma važno za toplotnu
stabilnost ezima (Jolles et al. 1963). Lizozimi sa četiri cisteinske veze su relativno stavilniji u kiselim
ili neutralnim rastvorima. Takođe je utvrđeno da lizozim sa najmanjim sadržajem cisteina ima
najvišu specifičnu aktivnost. [3]
Potpuno je redukovan u p-merkaptoetanolu, a u urei se može reaktivirati enzimskim i
neenzimskim reaktivacijama. Dolazi do enzimske reaktivacije, bez perioda indukcije, razmjenom
disulfida, a neenzimska reaktivacija se nastavlja oksidacijom redukovanog proteina u puferskim
rastvorima koji sadrže male količine p-merkaptoetanola. Ovaj reoksidovani lizozim ima istu
tercijarnu strukturu kao i nativni enzim. [3]
Umrežavanje lizozima je izvršeno reakcijom sa fenol-2,4-disulfonilhloridom. Taj umreženi
protein zadržava svoju aktivnost, ima približno istu molekulsku masu kao i nativni lizozim i prema
optičkoj rotacionoj disperziji ima, u suštini, istu konformaciju. [3]
Kristalizovani lizozim je ozračen X-zracima izmedju 1 i 100 milijardi i sa γ-zracima. Doze od
nekoliko milijardi nemaju mjerljiv efekat na aktivnost lizozima ili na aminokiselinu koja ulazi u
njegov sastav. Međutim, povećane doze mogu pretvoriti nativni protein u veliki broj modifikovanih
proteina koji pokazuju smanjeno ili povećano dejstvo lizozima. Samo rendgenski zraci magnitude
100 milijardi uzrokuju promjene u aminokiselinama koje ulaze u sastav lizozima. Ove promjene
uključuju one aminokiseline koje u sastavu imaju sumpor, kao i alifatične i aromatične
aminokiseline. [3]

2.3. Antibakterijska i antifungalna aktivnost lizozima

Biološka aktivnost lizozima dovodi do poremećaja rasta bakterija, posebno gram(+).
Generalno, aktivnost lizozima se određuje pomoću Micrococcus sp. sojeva koji služe kao substrat za
vizuelizaciju aktivnosti trubidimetrijskim metodama. Trenutno se ova analiza uzima kao standard za
mjerenje aktivnosti lizozima (Fiolka et al.,2005; Kim et al.,2012). Prema ovim lizozimima, igraju
dvije uloge: probavni način - razbijanje progutane bakterije u crijevima i odbrambeni odgovor protiv
patogena koji ulaze u organizam. Prilikom izlaganja lizozimu, u strukturi bakterije dolazi do odvajanja
ćelijske membrane i ćelijskog zida, kao i curenje iz citoplazme. [4]
Što se tiče aktivnosti protiv fitopatogenih gljivica, Acremonium obclavatum je pokazuje
veću enzimsku osjetljivost, i praćena je Leptosphaeria maculans i Alternaria alternata (Manikandan
et al., 2015). Sve ove studije ukazuju na to da lizozimi biljaka i insekata inhibišu bakterije i gljivice,
međutim, u nekim slučajevima antibakterijska aktivnost lizozima kokošijeg jajeta je veća od ostalih
vrsta lizozima. Iako je mehanizam djelovanja koji
lizozim vrši anibakterijsku aktivnost, do danas je jako
malo informacija o tačnom mehanizmu djelovanja na
gljivične ćelije (Hernandez-Telles et al.,2018; Wu et
al.,2017). Uticaj lizozima na gljivice poput
Paracoccidioides brasiliensis, kao i efekat na Cancica
albicans takođe su zabilježeni. Kada je gljivica
Paracoccidioides brasiliensis (slika 2) bila izložena
lizozimu, njena sposobnost je bila oštećena. Takođe,
prilikom izlaganja lizozimu, primjećene su različite
ultrastrukturne promjene, kao što su fuzija lipidnih
vakuola, subcelularna degradacija i prekid fibrilnih
Slika 2. Dejstvo lizozima na Paracoccidioides brasiliensis slojeva. Dakle, primijećeno je da djeluje dvojako kada su
(A); nakon 96h djelovanja (B) u pitanju antifungalni odbrambeni mehanizmi (Lopera et
al., 2008). [4]

3
 Takođe, sugerisano je da lizozim hidrolizuje β-1,4-glikozidne veze između monomera N-
acetilglukozamina koji integrišu hitin, utičući na funkciju ćelijskog zida (Sowa-Jesilek et al.,2016;
Hernandez-Telles et al.,2018). Oni su naznačili da je lizozim uticao na rast Candida albicans tako
što je uzrokovao gubitak membranskog potencijala u mitohondrijama, međutim o mehanizmu se nije
razgovaralo. Primjećeni su i drugi efekti na ćelijsko jezgro, kao što su kondenzacija hromatina i
fragmentacija DNK. [4]
Do sada, podaci o mehanizmu djelovanja lizozima na razvoj gljivica još uvijek potpuno
razjašnjeni nisu razjašnjeni. [4]

2.4. Mehanizam antibakterijskog djelovanja

Lizozim oštećuje mikrobe kroz najmanje tri različita mehanizma (slika 3.). Djelovanje na
peptidoglikane dovoljan je da ubije neke bakterije direktno.
Organizmi koji su podložni niskim koncentracijama lizozima uključuju određene nepatogene
gram(+) bakterije. Ostale gram (+)
bakterije se različito brane od
LIZOZIM efekata lizozima zbog kovalentnih
modifikacija (O-acetilacija NAM i
N-acetilacija NAG). [6]
Uopšteno, gram (-) bakterije
su otpornije zbog svojih spoljašnjih
Amtipatični
Kao enzim, probavlja bakterijskeprotein
Kao
kojimali
remeti
peptidoglikane protein,
bakterijske
oslobađa autokatalitičke enzime iz bakterija membrana koje ometaju pristup
membrane
lizozima u peptidoglikanima. Protiv
gram (-) bakterija se u velikoj mjeri
koriste kofaktori koji potpomažu
djelovanju lizozima. Ovi kofaktori
(laktoferin, vodonik-peroksid-askorbinska kiselina) ometaju spoljnu membranu gram (-) bakterija i
omogućavaju lizozimu pristup osjetljivom
peptidoglikanskom sloju. [6]
Antimikrobna aktivnost čovjeka ogleda se u velikoj mjeri u aktivnosti lizozima u nazalnoj
tečnosti, koji djeluje zajedno sa drugim
antimikrobnim komponentama nosnog sekret.
ijskog
Kada govorimo o antimikrobnom djelovanju dolazi do mutageneze usmjerene na aktivno
mjesto lizozima. U ovoj neenzimskoj ulozi, lizozim može djelovati tako što narušava integritet
membrane ili omogućava oslobađanje autokatalitičkih enzima iz
bakterija, što dovodi do preoblikovanja ćelijskog zida
tokom rasta bakterije. [6]
Lizozimi se koriste kao probavni enzimi kod preživara i insekata. Kod preživara, bakterije i
gljivice rastu u komori crijeva pretvarajući se u celulazu i na materijale koje preživar može da koristi.
Lizozim igra važnu ulogu u varenju u njihovom organizmu. Utvrđeno je da lizozimi želuca pokazuju
veću aktivnost pri pH=5 nego pri neutralnom pH. Ovo se djelimično može objasniti razlikama u
elektrostatičkim interakcijama između lizozima i supstrata. [4]

4
 Aktivnost lizozima je bila otkrivena i u crijevima mnogih insekata, gdje je njegova uloga da
vari unesene mikroorganizme. Zanimljivo je da neki lizozimi tipa I imaju izopeptidazne aktivnosti
koje imaju moć rastvaranja krvnog ugruška. Strukturne
adaptacije lizozima na kiselu pH razjašnjene su kod
kućne muve (Cancado et al.,2007). [4]

3. Humani lizozim
Lizozim je protein čija su struktura i stabilnost dobro
proučavani dugi niz godina kako bi se utvrdili principi
u osnovi ovih složenih pojava. Ljudski lizozim je
glikozidaza koja funkcioniše kao antibakterijsko
sredstvo. Sadrži 130 aminokiselinskih ostataka koji
pripadaju djelovanja
Slika 4. Reakcija mehanizma klasi C-tipa i široko je rasprostranjena u
lizozima
raznim tkivima i tjelesnim tečnostima, uključujući i
jetru, zglobnu hrskavicu, krvnu plazmu, pljuvačka, suze
i mlijeko (Reitamo et al., 1978). Kodiran je genomom
smještenim u hromozomu 12 i organizovanim u 4
eksona i 3 introna (Peters et al., 1989). Ovaj enzim
prisiljava šećer muramičke kiseline u napregnutu
konformaciju i kombinovanim djelovanjem dva ključna ostatka, glutaminske kiseline u položaju 35 i
asparaginske kiseline u položaju 52, vrši hidrolizu glikozidne veze. [1]

ima[1] Veoma je izražen u hematopoetskim ćelijama gdje se nalazi u granulocitima, monocitima i

makrofagima, kao i u njihovim prethodnicima koštane srži (Reitamo et al., 1978). Uobičajena
koncentracija lizozima u krvnoj plazmi je između 4 do 13 mg/l i u urinu zdravih se mogu vidjeti samo
u tragovima. U slučaju zdravih ispitanika, najmanje 500mg lizozima se proizvodi dnevno, ali životni
vijek ovog enzima u plazmi je vrlo kratak; 75% se eluira u roku od 1 sata uglavnom kroz bubrege
(Hansen et al.,1972). [1]
Visoko povećana koncentracija lizozima u plazmi i urinu su, međutim povezani sa nizom
patoloških uslova, već duži niz godina smatra se pokazateljem monocitne leukemije (Osserman i
Lavlor, 1966). [1] Tokom posljednjih 30 godina, ljudski lizozim i kokošiji lizozim se iscrpno koriste
kao referentni sistem za proučavanje mnogih aspekata strukture i funkcije proteina, uključujući i
stabilnost proteina i mehanizam presavijanja ( Blake et al., 1977; Redfield i Dobson, 1990...). Do sada
je zabilježeno šest prirodnih mutacija u ljudskom lizozimu (Pepis et al., 1993; Booth et al., 2000;
Valleix et al., 2002; Yazaki et al.,2003; Rocken et al., 2006),i sve pretstavljaju supstitucije
aminokiselina pozicioniranih u β-domenskom regionu nativne strukture lizozima (Dumoulin et al.,
2006). Te mutacije obuhvataju više varijanti proteina, i te varijante su povezane sa bolešću koja se
naziva amiloidoza koja zahvata bubreg, jetru i slezinu (Pepis et al., 1993). Dakle, u lizozimu su
povezane neke varijante kliničke patologije. Ova funkcija pruža izvrsnu priliku da se detaljno istraži
kako mutacije mogu da izazovu amiloidnu bolest. [1]
4. Primjene u prehrambenoj industriji

5
 Lizozim ima niz svojstava pogodnih za primjenu u hrani. To je toplotno stabilni protein,
aktivan u širokom opsegu temperatura (1-100˚C ili 33,8-212˚F), sposoban je da se odupre ključanju 1-
2 minuta i stabilan je tokom smrzavanja i termičko sušenje. Nije inaktivan sa rastvaračima i ne gubi
svoju aktivnost kada se ponovo rastvori u vodi. Čak iako je optimalna aktivnost pri pH od 5,3-6,4 za
hranu koje u svom sastavu imaju slabe kiseline (Abdiz et al.,2013) lizozim se pokazao aktivnim u
širokom opsegu pH od 4-10 (Chung i Hancock, 2000). [2]
Proizvodnja sira. Jedna od najpoznatijih primjena lizozima u prehrambenoj industriji je u
proizvodnji sira, gdje lizozim kontroliše rast mikroorganizama (Bevilacqua et al. 2010; Dooch i
Sawsan, 2014). Upotreba lizozima u proizvodnji tvrdih i polutvrdih sireva je proučavana početkom
1980-tih, a Francuska je bila prva zemlja koja je dozvolila industrijsku primjenu lizozima u
proizvodnji sira. Evropska zajednica je 1995. Odobrila njegovu upotrebu kao konzervans za sir, bez
granice doziranja. Prepoznat je kao najefikasniji proizvod protiv Clostridium tyrobutyricum (slika 6).

Slika 6. Pukotine, užegli ukus i neprijatni miris sira (A); Djelovanje Clostridium tyrobutyricum na sir (B);
Djelovanje lizozima na Clostridium tyrobutyricum[2]
Proizvodnja vina. Ovo je druga glavna primjena lizozima u prehrambenoj industriji. 1999.
godine nakon prvog odobrenja Međunarodne organizacije za vino i 1997. nakon drugog odobrenja,
lizozim je zvanično dozvoljen kao prirodna zamjena ili dopuna sumpor-dioksidu, jedinjenju toksičnom
za ljude u visokim koncentracijama. Sumpor-dioksid nije uvijek u potpunosti zamijenjen lizozimom,
jer sam po sebi možda neće u potpunosti spriječiti kvarenje. Lizozim se koristi i tokom pravljenja vina
za sprečavanje gram (+) bakterijama. Koristi se tokom alkoholne fregmentacije da bi se smanjila
proliferacija neželjenih bakterija mliječne kiseline, ili za kontrolu malolaktičke fermentacije.
Malolaktička fermentacije je sekundarna fermentacija koja se javlja na kraju alkoholne u kojoj se
bakterije mliječne kiselije dekarboksiluju. [2]
Proizvodnja piva. Odobrena je primjena lizozima u pasterizovanom ili sterilnom filtritranom
pivu. Lizozim efikasno kontroliše rast bakterija koje kvare pivo, posebno bakterije mliječne kiseline.
Ograničeni broj bakterija mliječne kiseline prolazi kroz adaptaciju na hmelj i sposoban je da na taj
način pokvari pivo. To može uzrokovati različite vrste neželjenih ukusa i mirisa, kao i zamućenosti
krajnjeg proizvoda. Ovaj enzim se može koristiti u različitim fazama procesa varenja kako bi se
izbjegla kontaminacija ili produžio rok trajanja. Lizozim koji se dodaje pivu u koncentraciji od
100ppm, vrši snažno inhibitorno dejstvo na sve bakterije koje mogu biti prisutne i stabilan je tokom
cijelog procesa djelovanja. Nema uticaj na druga sredstva za kvarenje, ističući tako potrebu za
kombinacijom sa drugim sredstvima. [2]
Druge primjene. Lizozim se koristi kao efikasno antimikrobno sredstvo za produženje roka
namirnica, uključujući i svježe voće i povrće, riba, prerađeni riblji proizvodi, meso i mesni proizvodi,
morski plodovi i sl. [2]

5. Izolacija lizozima iz bjelanca jajeta

6
5.1. Prečišćavanje lizozima
Pokušano je da se lizozim prečisti frakcionisanjem bjelanca sa amonijum sulfatom, ali sa
različitim uspijesima. Lizozim ima sposobnot adsopcije soli na neaktivne proteinske komponente, pa
stoga ovaj način prečišćavanja nije bio pogodan. Ispitivan je uticaj pH vrijednosti na adsorpciju
amonijum sulfata, ali nisu uspjeli da se otkriju uslovi koji bi spriječili adsorpciju. Takođe, ispitivano je
dejstvo pufera različite jačine i koncentracije vodonikovih jona na euglobulin koji se nalazi u
adsorbovanom lizozimu, ali bez uspijeha.
Fleming je dokazao da se lizozim lako adsorbuje na ugljenik, celulozu i porcelan, a kasnije
studije su pokazale da se lizozim čvrsto adsorbuje na mnoge supstance. Volf je otkrio da norit, kaolin,
silicijumska kiselina i filter papir adsorbuju aktivni materijal.
Istraživano je nekoliko adsorbujućih materijala koji mogu da vezuju lizozim. Među njima su
bili bentonit (jedna vrsta gline), supersorb (sintetički zeolit) i duolit. Od svih ovih supstanci, bentonit
se pokazao kao supstanca sa najvećim efektom adsorpcije za lizozim iz jajeta. U tabeli 1. su dati
podaci iz jednog istraživanja uticaja bentonita na lizozim.

Zapremina Bentonit po litru

Adsorbovano lizozima
bjelanca jajeta Lizozim bjelanca jajeta
(jedinica) (procenat)
(ml) (mg)
500 500 10 480 96
2000 1850 10 1600 87
1200 1200 10 1190 99
2000 2000 15 1980 99
2000 2000 12,5 1700 85
3000 3000 15 2900 97
2000 1900 15 1850 97
2000 2000 15 1950 97
Tabela 1. Adsorpcija lizozima na bentonit

5.2. Eksperimentalni postupak izolacije lizozima

Na osnovu karakteristika lizozima, osmišljena je metoda za odvajanje lizozima od drugih
proteina bjelanca. Na 1l bjelanca dodati 150 ml 10%-tne suspenzije bentonita u 1% KCl i smješu
snažno miješati 3-5 min, ali da se ne stvori pjena. Potom centrifugirati da bi se odvojila glina od
suspenzije i isprati sa 0,5 M fosfatnim puferom (pH=7,5). Suspenziju zatim isprati tri puta sa 300ml
5%-tnim vodenim rastvorom pirimidina da bi se uklonili neaktivni adsorbovani proteini. Eluiranje
lizozima postiže rastvorom pirimidina na pH=5.0 (podešeno dodatkom sumporne kiseline). Odvajanje
eluata od gline se postiže centrifugiranjem u šaržnoj centrifugi. Da bismo postigli najbolje rezultate
potrebno je da se eluiranje izvrši nakon adsorpcije u roku od 24h.