TÍNH KHẢ THI VÀ SINH LÍ CỦA MÔ HÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO

GIẢM OXY

Tóm lược

Thiếu oxy là việc các mô cơ quan và tế bào không được nạp đủ oxy trong quá trình
làm việc và tình trạng này rất phổ biến trong sinh lý và bệnh tật ở người. Do đó người
ta mới nghiên cứu và thử nghiệm các liệu pháp để chống lại tình trạng này.

Các mô hình thí nghiệm in vivo ( giải thích in vivo là gì ) không rút ra được các đặc
điểm chính trong sinh lý ở người. Dẫn đến việc sai lệch khi nuôi cấy tế bào người, cụ
thể là nồng độ oxy trong tế bào không liên quan đến động lực oxy trong cơ thể. Nhiều
tài liệu về chủ đề này cho thấy đây là vấn đề chung về tình trạng thiếu oxy trong ống
nghiệm. Do đó bài báo này sẽ đưa ra bằng chứng cho việc kiểm soát chặt chẽ nồng độ
oxy trong các mô hình nuôi cấy tế bào trong tình trạng thiếu oxy.

Đầu tiên là thảo luận về các quy luật vật lý cơ bản cần thiết để hiểu động học oxy
trong ống nghiệm, đáng chú ý là môi trường lỏng cản trở sự khuếch tán của oxy trong
môi trường nuôi cấy ( cell culture) thông thường.

Bài báo này còn tóm tắt và nâng sự hiểu biết về các kỹ thuật tiêu chuẩn hóa các môi
trường nuôi cấy để có thể tái tạo lại môi trường đó bằng cách tăng cường cung cấp
Oxi cho tế bào và đo mức độ oxy ngoại bào ( ngoại bào là gì ).

Ngoài ra bài báo cũng thảo luận cách các kĩ thuật này được áp dụng để mô hình hóa
khảo sát tình trạng thiếu oxi liên tục và không liên tục liên quan đến sinh lý tế bào. Và
đánh giá các giá trị như áp suất riêng phần đã biết của mô và tình trạng thiếu Oxy
trong cơ thể để đem đi so với các mẫu cấy tế bào thông thường được ủ ở áp suất oxy
cố định.

Chú ý đến ảnh hưởng của lượng CO2 đối với các mô hình này.

Cuối cùng là ý nghĩa của những khái niệm này đối với quá trình nuôi cấy

Kết luận: việc duy trì nồng độ oxy chính xác là mấu chốt quyết định độ thành công
trong nuôi cấy tế bào.
Giới thiệu

Oxy ban đầu tích tụ đáng kể trên bề mặt trái đất và quang hợp được ra đời ở tổ tiên
của vi khuẩn lam , chúng lấy Hydro từ nước và Co2 trong khí quyển để tạo thành các
phân tử Hydrocacbon đầu tiên.

Sau đó “ thảm họa Oxi “ đã diễn ra do vi khuẩn lam đã thực hiện quang hợp và sản
sinh oxy tự do ( O2) , ban đầu các O2 tự do này khi vừa sinh ra đều tham gia vào quá
trình oxy hóa tạo các chất hữu cơ, dần già O2 tự do lại được sản sinh ra quá nhiều và
không còn gì để nó Oxy hóa nữa nên dẫn đến dư thừa. Và nó có hại đối với sinh vật kị
khí nên khi nồng độ của nó tăng cao đã diệt chủng hầu hết các sinh vật kỵ khí lúc bấy
giờ.

Cuối cùng, sinh vật hiếu khí bắt đầu phát triển, tiêu thụ oxy và dẫn đến trạng thái cân
bằng của oxy trong khí quyển. Từ lúc đó oxy tự do là một thành phần quan trọng của
khí quyển.

Nhu cầu oxy phổ biến ở các sinh vật sau tiến hóa là khác nhau nên đã tạo ra một hệ
thống phân phối oxy vào toàn bộ cơ thể và đáp ứng yêu cầu trao đổi chất của tất cả
các mô. Để vận chuyển Oxy đến ty thể thì nó phải khuếch tán trong phổi và các mô
ngoại vi để quá trình đó thuận lợi thì đã có sự hình thành của các Gradient nồng độ
khắp cơ thể người dẫn đến mức độ O2 cần thiết ở mỗi mô là khác nhau.

Từ đó có khái niệm áp suất Oxi riêng phần, áp suất Oxi riêng phần là khái niệm cho
biết trạng thái sinh lý của một cơ quan, là kết quả của sự cân bằng giữa phân phối oxy
và tiêu thụ nó. Po2 càng thấp ( thiếu Oxy ) chứng tỏ quá trình oxy hóa ở mô bị rối loạn
càng nghiêm trọng có thể dẫn đến các tình trạng bệnh lý như ung thư, tiểu đường,
bệnh tim mạch vành, đột quỵ, …

Các mô hình in vivo về tình trạng thiếu oxy phải đối mặt với những thiếu sót đáng
kể .Vì các lý do liên quan đến đạo đức và chi phí, việc sử dụng động vật để đánh giá
phương thức hoạt động, chuyển hóa hoặc độc tính ngày càng được xem xét kỹ lưỡng
trong nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp. Do đó, nuôi cấy tế bào là một lựa chọn
khả thi cho dòng nghiên cứu này. Tuy nhiên, tầm quan trọng của việc điều chế và định
nghĩa chính xác tình trạng thiếu oxy thường không được phản ánh trong việc thiết kế
các thí nghiệm in vitro, vì lý do lịch sử và hạn chế kỹ thuật ( hạn chế về sự khuếch tán
và cân bằng Oxy trong hệ thống in vitro ). Độ hòa tan thấp của oxy trong dung dịch
nước và sự khuếch tán hạn chế của oxy qua lớp khí ranh giới phía trên môi trường là
những rào cản chính đối với sự vận chuyển oxy nhanh chóng vào môi trường nuôi
cấy.

Bài tổng quan này nhằm mục đích tóm tắt các phương pháp tiếp cận hiện tại trong
nghiên cứu tình trạng thiếu oxy thực nghiệm, đặc biệt chú trọng vào các mô hình nuôi
cấy tế bào.

Mô hình in vivo về sự thiếu hụt Oxy

Ở người và động vật đều xuất hiện tình trạng thiếu Oxy ở máu ( HH) và thiếu Oxy
máu ác tính ( NH). Để nghiên cứu nhiều loại bệnh như tăng áp động mạch phổi, thiếu
máu não, bệnh võng mạc tiểu đường, …

Khi thiếu Oxy ở máu ( HH), ngta so sánh nó như môi trường bên ngoài ở một độ cao
nhất định, môi trường này được tạo ra bằng cách giảm áp suất xuống dưới 1atm trong
một buồng kín. Còn tình trạng thiếu Oxi cấp tính ( NH ) sẽ dựa trên sự giảm áp suất
riêng phần của Oxy ( Po2 ) ở điều kiện áp suất khí quyển bình thường , ví dụ như khi
đeo khẩu trang chứa nito hoặc ngồi trong lều giảm Oxy.

Vẫn còn tranh cãi về việc liệu hai trạng thái thiếu oxy có thể hoán đổi cho nhau trong
môi trường thử nghiệm hay không ???? Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt của
chúng chẳng hạn như mức độ lưu thông của không khí trong một phút, độ bão hòa của
O2 ngoại vi, áp suất Co2 động mạch và NO thở ra dường như thấp hơn và rõ ràng hơn
ở HH . Các triệu chứng này chỉ khác biệt ở lúc ban đầu của 2 trường hợp khi lực căng
của N2 xung quanh và ảnh hưởng lâu dài của chúng là giống nhau. Còn các thông số
khác như phân áp O2 và CO2 trong động mạch được phát hiện là tương tự hoặc thay
đổi tùy thuộc vào nghiên cứu.

Các dấu hiệu sinh hóa của tình trạng thiếu oxy đã được đo và thấy là tương đương
nhau khi tập thể dục ở NH và HH, với cả hai điều kiện này khác với tập thể dục trong
môi trường không độc hại.
Cell cultures ( Nuôi cấy tế bào )

Các vấn đề đạo đức được hình thành bởi quy tắc “3R”, các vấn đề liên quan đến chi
phí và khả năng tái sản xuất hạn chế ở người vẫn là rào cản rõ ràng nhất của các ứng
dụng mô hình động vật

Nuôi cấy tế bào người là giải pháp thay thế hấp dẫn trong lĩnh vực nghiên cứu sinh
học quan trọng như khám phá thuốc, mô hình bệnh, …

Những tiến bộ trong kĩ thuật mô gần đây đã cho phép các nhà khoa học nghiên cứu thí
nghiệm in vitro không chỉ khám phá tế bào ở mức phân tử mà còn khám được sự
tương tác giữa các tế bào và giữa các cơ quan bằng mô hình ba chiều ( 3D) và các
organoit phức tạp ( giải thích organoit  : một phiên bản thu nhỏ và đơn giản hóa của
một cơ quan được sản xuất trong ống nghiệm theo ba chiều cho thấy giải phẫu vi
mô thực tế ).

Tuy nhiên, sự khác nhau về cách thức và thủ tục ở mỗi phòng thí nghiệm đã làm hạn
chế việc giải thích kết quả của các thí nghiệm, mặc dù có nhiều yếu tố được báo cáo
lại trong các phương pháp thực hiện như là : thành phần môi trường, tần suất trao đổi
của môi trường,… nhưng yếu tố cơ bản quyết định đối với sự sống của tế bào thường
bị bỏ qua đó là mức Oxy tế bào . Nhiều tài liệu đã chỉ rõ nồng độ oxy trong các thí
nghiệm nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn không chỉ sai lệch đáng kể so với phạm vi sinh lý,
mà còn cho thấy rằng nồng độ oxy trong tế bào thay đổi đáng kể trong các môi trường
thí nghiệm khác nhau, loại tế bào được khảo sát khác nhau , sự hợp lưu của tế bào (
hợp lưu là sự giao thoa của nhiều dòng , nhiều pha với nhau ) , thể tích và thời gian
làm mới môi trường.

Các yếu tố quyết định nên nồng độ Oxy trong môi trường nuôi cấy và các kiểm soát
Oxy được tóm tắt trong văn bản bên dưới.

Mô hình nuôi cấy tế bào giảm Oxy

Mức Oxy trong nuôi cấy tế bào

Trong một thí nghiệm nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn, tế bào sẽ được giữ trong tủ ẩm để
duy trì các điều kiện ổn định như: nhiệt độ ở 37oC, không khí duy trì 21% O2 và 5%
Co2, độ ẩm đầy đủ,…

Có 2 hạn chê cần giải quyết lúc này là:

 Nồng độ Oxy trong tế bào khác biệt với nồng độ Oxy trong môi trường lồng ấp
 Phạm vi sinh lý của nồng độ Oxy được quan sát trong các mô tế bào ở TN in
vivo ( mô nomoxia hoặc tế bào chất ) rất khác nhau.

Mối quan tâm về khả năng giới hạn áp suất riêng phần Po2 đã được đề cập hơn 1 thập
kỉ trước trong báo cáo về tình trạng thiếu Oxy ngoài màng tim trong thí nghiệm nuôi
cấy tế bào thông thường. Metzen và cộng sự đã chỉ ra rằng trong các điều kiện không
độc hại thông thường như trên thì các tế bào kết dính có thể bị thiếu oxy màng ngoài
tim hoặc thậm chí là thiếu oxy anoxia ( thiếu Oxy trong nước ) . Khi đo nồng độ O2
trong tế bào trong 24 giờ sau khi trao đổi môi trường, người ta thấy rằng các dòng tế
bào có nhu cầu oxy cao cuối cùng đã đạt đến trạng thái thiếu oxy. Các tác giả này đã
phát triển mô hình toán học dựa trên định luật Fick tính toán mức O2 ngoại bào mong
đợi, sau đó đã được xác minh bằng các phép đo trong đời thực.

Kể từ đó, người ta đã thừa nhận rằng trong các dụng cụ nuôi cấy thông thường, cách
duy nhất để oxy đến được các tế bào kết dính là khuếch tán qua lớp phủ môi trường
nước. Hơn nữa, nếu tốc độ tiêu thụ oxy của các tế bào biểu hiện hoạt động trao đổi
chất cao hơn tốc độ phân phối oxy (được xác định bởi hệ số hòa tan oxy, hằng số
khuếch tán, chiều cao lớp phủ trung bình, diện tích bề mặt và áp suất riêng phần của
oxy trên môi trường) thì áp suất oxy ngoại bào cuối cùng sẽ cân bằng ở một giá trị
thiếu oxy hoặc thiếu oxy anoxia ( trong nước ) sau 2 giờ sau khi trao đổi môi trường

Diện tích bề mặt tế bào và mức PO2 được đặc trưng bởi kích thước của đĩa nuôi cấy
và môi trường trong tủ ấm CO2 5%. Do đó chiều cao của lớp phủ trung bình là yếu tố
chính quyết định khả năng khuếch tán Oxy. Chiều cao trung bình và tốc độ tiêu thụ
oxy của tế bào đều xác định nồng độ oxy trong tế bào nên nó ảnh hướng đáng kể đến
nghiên cứu nuôi cấy tế bào hiện đại do thiếu các báo cáo về lượng môi trường cung
cấp để tế bào sử dụng và sự khác biệt về nhu cầu Oxy của các tế bào khác nhau trong
các thí nghiệm khác nhau.

Để thống nhất về việc dùng các thuật ngữ và đơn vị khi nói đến phép đo mức độ O2
có trong tế bào, các nhà nghiên cứu đã mô tả lượng Oxy có sẵn trong tế bào dưới dạng
nồng độ phần trăm. Tuy nhiên, điều này không chính xác từ quan điểm vật lý vì những
nghiên cứu này thực sự đề cập đến phần thể tích của oxy trong không khí xung quanh
tương ứng với nồng độ mol thực tế của oxy trong dung dịch nước - môi trường. Dựa
trên định luật của Henry và Amagat, nồng độ mol được xác định bởi phần thể tích của
oxy trong không khí và áp suất khí quyển, nên cuối cùng chọn áp suất riêng phần pO2
để chỉ mức độ Oxy.

Do đó, nếu áp suất khí quyển giảm khi độ cao tăng lên, lượng oxy thực tế trong môi
trường nuôi cấy tế bào cũng sẽ thay đổi theo. Sự chênh lệch như vậy không chỉ ảnh
hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn khi không chú ý đến pO2 màng ngoài
tim, mà còn gây khó khăn cho việc thống nhất các kết quả của tài liệu đã công bố về
phép đo tình trạng thiếu oxy trong ống nghiệm. Chúng ta có thể đưa ra giả thuyết rằng
các tác giả sử dụng thuật ngữ nồng độ oxy để chỉ áp suất khí quyển ở mực nước biển;
tuy nhiên, vì họ thường không trình bày đầy đủ về cách họ lấy giá trị nồng độ từ phép
đo pO2 ngoại bào, nên chúng tôi không thể chắc chắn về điều này. Do đó, chúng tôi
không thể tính toán chính xác nồng độ pO2 và / hoặc nồng độ mol của các thí nghiệm
này và so sánh trực tiếp chúng với các đơn vị được sử dụng trong các nghiên cứu
khác.

Do đó, chúng tôi đề xuất rằng thuật ngữ này không nên được sử dụng trong tương lai
để tránh nhầm lẫn thêm. Thay vào đó, các giá trị nồng độ mol của oxy hoặc áp suất
riêng phần của oxy, có thể dễ dàng chuyển đổi sang nhau trong điều kiện nhiệt độ
không đổi tuân theo phương trình khí lý tưởng hoặc định luật Henry để thúc đẩy độ tái
lập và độ rõ ràng của kết quả. Trên thực tế, áp suất riêng phần của O2 cũng là một
thuật ngữ không hợp lý để sử dụng khi mô tả nồng độ của một chất khí trong chất
lỏng, chỉ tương ứng với áp suất riêng phần của pha khí. Tuy nhiên, nó đã trở thành nên
phổ biến nhất để mô tả đặc tính oxy trong cả sinh lý y tế và thực hành lâm sàng vì
phần lớn oxy trong máu không bị hòa tan, mà được vận chuyển khi liên kết với
hemoglobin.

PHÉP ĐO OXY NGOẠI TẾ BÀO

Trước khi tiến hành thí nghiệm giảm lượng Oxy trong tế bào thì người ta phải xác
định đặc điểm Oxy của tế bào đó một cách chính xác, và để làm điều này ta sẽ sử
dụng một điện cực Clark ( điện cực này nhạy cảm với Oxy phân cực ).

Dựa trên nguyên lý điện phân để khử Oxy, điện cực này cho phép đo nồng độ Oxy tại
một vị trí chính xác trong khu vực ngoại bào. Tuy nhiên thao tác với điện cực cũng có
thể làm gián đoạn tế bào cụ thể là do cấu tạo của nó, nó không cho phép phát hiện
đồng thời các mức O2 ở tất cả các chiều, điều này ngăn nó đo độ dốc nồng độ trong
môi trường nuôi cấy 3D hoặc sự không đồng nhất trong vi môi trường của tế bào.

Hơn nữa, bản thân điện cực có mức tiêu thụ O2 không đáng kể, điều này phải được
xem xét trong quá trình thí nghiệm kéo dài, vì nó đòi hỏi phải hiệu chuẩn lại hoặc
khuấy môi trường ( Hình A ) .

Để khắc phục những hạn chế này, các phương pháp thay thế và bổ sung đã được phát
triển để theo dõi mức O2 trong tế bào. Cụ thể là phương pháp nhuộm tế bào , phương
pháp này mang lại giá trị chính xác của PO2 dựa trên sự biến mất của tín hiệu huỳnh
quang qua trung gian Oxy tỉ lệ nghịch với PO2, cường độ tín hiệu này có thể định
lượng được bằng kính hiển vi hoặc các thiết bị bán sẵn trên thị trường. Nguyên tắc này
cũng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các đĩa có cảm biến oxy đã được hiệu
chuẩn trước được đặt ở đáy của mỗi giếng (Hình 1B). Các điện cực đo ampe được chế
tạo riêng, sử dụng định lượng dòng ion để đánh giá nồng độ chất phân tích, cũng có
thể được tích hợp vào hệ thống nuôi cấy tế bào theo cách tương tự.
Giãn đồ đo PO2 ngoại bào

Hình A: Điện cực Clark được ngâm trong môi trường, cho phép đo pO2 ở bất kỳ độ
sâu nào bao gồm cả vùng ngoại bào của môi trường nuôi cấy kết dính.

Hình B: Cảm biến PO2 quang học dựa trên nguyên lí làm mất tín hiệu huỳnh quang
bằng Oxy được bố trí ở bề mặt đáy dụng cụ nuôi cấy. Để thực hiện phép đo, một
nguồn kích thích huỳnh quang được đặt bên dưới dụng cụ nuôi cấy. Tín hiệu phát xạ
mạnh được ghi nhận từ các khu vực có pO2 thấp và ngược lại.

Tình trạng thiếu Oxy kéo dài và khả năng khuếch tán trong trường hợp này
( ngắn )

Tình trạng thiếu Oxy ngắt quãng và khả năng tự cân bằng Oxy ( dài )

Thiếu Oxy Mimetics ( ngắn )

Vai trò của mô Normoxia trong mô hình giảm Oxy ( ngắn )

Ảnh hưởng của việc kiểm soát Po2 tế bào lên tín hiệu thiếu oxy trong ống nghiệm
( ngắn )

Tình trạng thiếu oxy kéo dài ( ngắn )

Tình trạng thiếu oxy ngắt quãng ( ngắn )

Nhược điểm của các hệ thống thông thường ( ngắn )

Nuôi cấy tế bào 3D ( dài )

Kết luận ( ngắn )