Rekombinantna DNK

tehnologija
 METODE REKOMBINANTNE (KIMERNE) DNA

1.CIJEPANJE RE

2. KLONIRANJE DNA
in vitro (PCR)
in vivo (plazmidi)
3. HIBRIDIZACIJA
4. SEKVENCIONIRANJE

Primjena: otkrivanje gena

Identifikacija
Dg genetičkih bolesti i tumora (presimptomatska)
Proizvodnja lijekova
Genska terapija
 1. Restrikcijske endonukleaze

- Otkrivene 60tih godina prošlog stoljeća

- Dio su obrambenog sustava bakterija protiv

strane DNK (bakteriofagne DNK)

- Uz pojedinu restrikcijsku endonukleazu nalazimo i

odgovarajuću metilazu

- Specifično prepoznaju sekvencu i cijepaju

dvolančanu DNK
Mjesta prepoznavanja
(a) EcoRI, 6-bp mjesto prepoznavanja: ljepljivi ss-krajevi
(b) Bakterije imaju metilaze – metiliraju mjesta prepoznavanja RE
(npr. E. coli ima EcoRI RE i EcoRI metilazu - metilira 2 A)
=zaštita vlastite DNA
 Vrste restrikcijskih endonukleaza
1. Restrikcijske endonukleaze tipa I
- Bifunkcionalni enzim (endonukleaza + metilaza)
recipročno aktivnih funkcija
- Mjesto prepoznavanja asimetrično
- Mjesto cijepanja >1000 bp od mjesta prepoznavanja
- Potreban ATP i S-adenozil-metionin

2. Restrikcijske endonukleaze tipa II

- Endonukleaza i metilaza odvojene
- Mjesto prepoznavanja palindromska sekvenca od 4-8 bp
- Cijepaju na mjestu prepoznavanja
- Više od 100 komercijalno dostupnih enzima
- Nazivlje – po bakteriji iz koje su izolirane

3. Restrikcijske endonukleaze tipa III

- Bifunkcionalni enzim (endonukleaza + metilaza)
simultano aktivnih funkcija
- Mjesto prepoznavanja 5 – 7 bp asimetrične sekvence
- Mjesto cijepanja 24 – 26 bp od mjesta prepoznavanja
- Potreban ATP
Konzervirana struktura RE tipa II
4 konzervirana elementa (aktivno mjesto: plavo)
Dimeri su (ovdje prikaz monomera)
Ispod: AK u proteinu koje tvore ove elemente
 Vrste cijepanja restrikcijskim endonukleazama
(tipa II)

1. “Tupi krajevi” (Blunt ends)

GTT AAC HpaI

CAA TTG

2. “Ljepljivi krajevi” (Cohesive ends)

a) 5’ ostatak b) 3’ ostatak

G AATTC EcoRI CTGCA G PstI

CTTAA G G ACGTC
Table 7-1. Selected Restriction Endonucleases and Their Restriction-Site Sequences
Source Microorganism Enzyme* Recognition Site (↓)† Ends Produced

Arthrobacter luteus AluI AG↓CT Blunt

Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G↓GATCC Sticky
Escherichia coli EcoRI G↓AATTC Sticky
Haemophilus gallinarum HgaI GACGC+5↓ ‡

Haemophilus influenzae HindIII A↓AGCTT Sticky

Haemophilus parahaemolyticus HphI GGTGA+8↓ ‡

Nocardia otitiscaviaruns NotI GC↓GGCCGC Sticky

Staphylococcus aureus 3A Sau3AI ↓GATC Sticky
Serratia marcesens SmaI CCC↓GGG Blunt
Thermus aquaticus TaqI T↓CGA Sticky
* Enzymes are named with abbreviations of the bacterial strains from which they are isolated; the roman numeral indicates
the enzyme's priority of discovery in that strain (for example, AluI was the first restriction enzyme to be isolated from
Arthrobacter luteus).
† Recognition sequences are written 5′→3′ (only one strand is given), with the cleavage site indicated by an arrow. Enzymes

producing blunt ends cut both strands at the indicated site; those producing stick ends make staggered cuts, with cleavage
occurring between the same nucleotides in each strand as shown in Figure 7-5a.
‡ The cleavage sites for HphI and HgaI occur several nucleotides away from the recognition sequence. HgaI cuts five

nucleotides 3′ to the GACGC sequence on the top strand and ten nucleotides 5′ to the complementary GTGCG sequence on
the bottom strand. HphI cuts eight nucleotides 3′ to the GGTGA sequence on the top strand and seven nucleotides 5′ to the
complementary CCACT sequence on the bottom strand.
SOURCE: R. J. Roberts, 1988, Nucl. Acids Res. 16(suppl):271.
Digestija i gel elektroforeza
 2.

1.
3.
Restrikcijska mapa
 DNK kloniranje

- Metoda izolacije i umnažanja segmenta DNK

- Potrebni odgovarajući vektori (plazmidi, kozmidi,

bakteriofag, BAC, YAC)

- Potreban odgovarajući soj bakterija

- Potrebne restrikcijske endonukleaze

- Potrebna DNK ligaza

- Potrebni modificirajući enzimi (Alkalna fosfataza,

Polinukleotid kinaza, DNK polimeraza, Klenow enzim,
itd.)
PLAZMIDI

= cirkularne dvolančane DNA, nađene u bakterijama

ekstrakromosomski!
Nose gene za: rezistenciju na abtibiotike, RE,
toksine...

Prirodni (ColE1)/sintetski(pBR322)

Uzgoj u bakteriji: inkompatibilnost

<20= niskog broja kopija

>20=visokog broja kopija
Sintetski plazmid:
•marker (rezistencija)
•ori (origin of replication)
•Polilinker
1.2-3kb dugački

Primjena: kloniranje gena

KLONIRANJE
= umnažanje fragmenata DNA in vitro ili in vivo

Razni vektori: izbor ovisi o cilju kloniranja

 Kloniranje DNA u plazmidnom vektoru:
1. Unos fragmenta koji se klonira u plazmid (RE)
2. Unos plazmida u E. coli – transformacija (heat
shock, elektroporacija)
3. Selekcija na ampicilinskim pločama
4. Autonomna replikacija
5. Prijenos u stanice kćeri
6. Izolacija plazmida iz bakterije
1. Unos fragmenata
DNA koji se klonira u
plazmid
(a) Polillinker s 10 RE
(b) Unos genomskih RE
fragmenata u pUC19
plazmidni vektor
Stvarajne rekombinantne DNA:
1.RE – kohezivni krajevi
2.DNA ligaza
2. Unos plazmida u E. coli –
transformacija

- heat shock
- elektroporacija
3. Selekcija na ampicilinskim
pločama
Inkubacija transformiranih E.
coli na 37 °C preko noći
rezultira rastom kolonija (106
stanica)
4. Replikacija plazmidne DNA
Počinje u ORI i ide u oba pravca
 Primjena:
produkcija
velike količine
proteina (npr.
inzulin)

=ekspresijski
vektori

Važno: snažan
promotor!
Primjena:
spajanje raznih DNA
fragmenata (nastanak
novih proteina)
“MINI PREP”
=Izolacija plazmida iz bakterije

a) Alkalna liza
b) Li
c) Kuhanje

a) SDS denaturira proteine

NaOH denaturira DNA
K-acetat neutralizira (SDS s K
tvori komplekse)