Prepoznavanje antigena u

stečenom imunološkom
sustavu

Prof. dr. sc. Ivan Ćavar

Medicinski fakultet Sveučilišta u Mostaru
2020.
 Antigenski receptori limfocita
• Limfociti B i T izražavaju različite membr. receptore kojima prepoznaju antigene
• Antigenski receptor limfocita B (BCR) je monomerna molekula IgM
• Antigenski receptor limfocita T (TCR) je heterodimerna molekula α/β
• Klonska raspoređenost: svaki klon limfocita je specifičan za određeni antigen
• Klon čine svi limfociti koji imaju identičan antigenski receptor
• Repertoar limfocita = ukupan broj različitih klonova (antigenskih r.) limfocita
• Kako nastaje raznolikost antigenskih r. tijekom razvoja limfocita?-
rekombinacijom (preslagivanjem) gena za antigenski r.
 Antigenski receptori limfocita
• BCR mogu prepoznati puno različitih vrsta kemijskih struktura
- Konformacije makromolekula (proteini, ugljikohidrati, lipidi, nukleinske kiseline)
- Manje kemijske motive
• BCR mogu prepoznati raznolike mikrobe i toksine u nativnom obliku
• Većina TCR može prepoznati samo peptide vezane za molekule MHC na APC
• Antigenski r. sastoje se od regija (domena) koje sudjeluju u prepoznavanju
antigena (varijabilne, V) i domena potrebnih za strukturni integritet i izvršne
funkcije (konstantne, C)
• Hipervarijabilne regije (CDR): raznolikost sekvence koncentrirana na kratke
dijelove
 Antigenski receptori limfocita
• Lanci antigenskih receptora udruženi su s nepromjenjivim membranskim
proteinima (konzervirane molekule) koji isporučuju signal u unutrašnjost
stanice nakon prepoznavanja antigena
• Antigenski specifičan receptor + membranska signalna molekula =
receptorski kompleks (kompleks BCR i TCR)
• Protutijela (At) postoje u dva oblika: kao BCR ili kao izlučeni proteini
• TCR postoje samo kao membranski receptori na T-stanicama
 Obilježja BCR i TCR
Antibodies (also called immunoglobulins) may be expressed as
membrane receptors or secreted proteins; TCRs only function
as membrane receptors. When immunoglobulin (Ig) or TCR
molecules recognize antigens, signals are delivered to the
lymphocytes by proteins associated with the antigen receptors.
The antigen receptors and attached signaling proteins form the
B cell receptor (BCR) and TCR complexes. Note that single
antigen receptors are shown recognizing antigens, but signaling
typically requires the binding of two or more receptors to
adjacent antigen molecules. The important characteristics of
these antigen-recognizing molecules are summarized.
 Protutijela (At, imunoglobulini)
• Građena su od osnovne četverolančane jedinice (monomer, H2L2)

• Četiri lanca spojena tako da tvore oblik slova Y

• Svaki lanac ima varijabilnu (V) i konstantnu (C) domenu: laki lanac (1 VL + 1 CL), teški lanac (1 VH

+ 3 ili 4 CH)

• Svaka domena je smotana u karakterističan 3D oblik: sastoji se od dva sloja β-nabranih ploča
koje su spojene disulfidnim (SS) mostom

• Vezno mjesto za antigen sastoji se od V domena lakog i teškog lanca

• Osnovna jedinica At ima dva identična vezna mjesta za antigen

• Svaka VH i CH sadrži tri hipervarijabilne regije (CDR), najveću varijabilnost ima CDR3
Struktura protutijela
Schematic diagrams of A, a secreted
immunoglobulin G (IgG) molecule, and B, a
molecule of a membrane-bound form of IgM,
illustrating the domains of the heavy and light
chains and the regions of the proteins that
participate in antigen recognition and effector
functions. N and C refer to the amino-terminal and
carboxy-terminal ends of the polypeptide chains,
respectively. C, The crystal structure of a secreted
IgG molecule illustrates the domains and their
spatial orientation; the heavy chains are colored
blue and red, the light chains are green, and
carbohydrates are gray. D, The ribbon diagram of
the Ig V domain shows the basic β-pleated sheet
structure and the projecting loops that form the
three CDRs. CDR, Complementarity-determining
region.
Specifični biljezi
limfocita B

Imunoglobulin (Ig):
antigenski receptor
limfocita B (BCR)

Signalna molekula:
heterodimer Ig-α/Ig-β

Koreceptorski kompleks:
CD19, CD21 i CD81

CD21 omogućuje drugi

aktivacijski signal (CR2)
 Model
osnovne četverolančane jedinice
(monomera)

osnovna molekula =
(H2L2)n
Fab ulomak
(Fragment antigen
binding) jest dio
koji veže antigen,
čini ga cijeli laki i
gornja polovica
teškog lanca
Fc (Fragment crystallizable)
određuje biološka svojstva
protutijela (poluvijek života,
prolazak kroz placentu,
vezanje komplementa,
aktivacija makrofaga...)
merkapto-etanol
 Vezno mjesto
za antigen = paratop

V - varijabilni
C - konstantni
H - teški lanac
L - laki lanac

Efektorska
funkcija
 Varijabilne regije

CDR FR
(kostur)

Hipervarijabilne regije

Dvije kategorije
varijabilnosti položaja AK u
varijabilnoj regiji:
1. CDR oblikuju vezno
mjesto za antigen
2. FR određuju opću
strukturu varijabilne regije
(način savijanja i izgradnju
domene)

CDR zauzimaju 15-20%

ukupne VR, ima ih po 3 u
VL i VH, najvarijabilnija regija
CDR3
 Zglob = fleksibilni dio
između regija Fab i Fc,
omogućuje da se dvije
Fab regije pomiču
neovisno jedna od
druge i tako
istovremeno vežu
antigenske epitope koji
su različito udaljeni
jedni od drugih
(promjenjiv kut između
Fab regija)
 Stabilnost molekule protutijela
• Postoji zahvaljujući disulfidnim
vezama (20-25 po molekuli)
• Međulančane S-S
• Unutarlančane S-S
• Ugljikohidratni dijelovi
određuju biološka svojstva
protutijela (kovalentno vezanje za
CH, lanac J i sekrecijsku
komponentu)
 CH = klupko od anti-paralelnih
slijedova aminokiselina (cca. 110)

CH1
CH2

CH3
CH4 domene
Trodimenzionalna struktura molekule At

paratop
Imunoglobulini – monomeri, dimeri i pentameri

polipeptid
 Laki lanci Ig
• Sastoje se od oko 220 AK: VL=110 AK, CL=110 AK
• Temeljno se svrstavaju u skupinu κ i λ (prema
razlikama u građi CL)
• CL ima gotovo stalan slijed AK za određenu vrstu
• κ i λ lanci zastupljeni u svim razredima i
podrazredima Ig
• U istoj molekuli Ig oba laka lanca su jednaka (κ κ ili
λ λ)
 Teški lanci Ig
• Sastoje se od oko 440 ili 550 AK: VH=110 AK,
CH=330 AK (440 AK za IgE i IgM)

• Na temelju slijeda AK u CH Ig se dijele u 5 razreda ili

izotipova (IgG, IgA, IgE, IgD, IgM) i nekoliko
podrazreda (npr. IgG1-4)

• Članovi jednog razreda nisu baš posve istovjetni

među vrstama ili unutar jedne vrste
 Antigenske determinante Ig
• To su dijelovi molekule Ig koji izazivaju imunoreakciju
nakon prijenosa u drugi organizam
 Izotipske determinante
• To su zajedničke antigenske determinante Ig
jednake u svih pripadnika iste vrste (vezano za
isti izotip protutijela)
 Alotipske determinante
• To su redovito prisutne male antigenske razlike
između Ig istog izotipa (genski biljezi Ig), ali dviju
različitih jedinki unutar iste vrste
 Idiotipske determinante
• To su individualne antigenske determinante
specifične za skupinu potpuno istovrsnih Ig koju je
proizveo jedan klon limfocita
Obilježja glavnih izotipova protutijela

This figure summarizes some important

features of the major antibody isotypes of
humans. Isotypes are classified on the basis of
their heavy (H) chains; each isotype may
contain either κ or λ light chain. The schematic
diagrams illustrate the distinct shapes of the
secreted forms of these antibodies. Note that
IgA consists of two subclasses, called IgA1 and
IgA2, and IgG consists of four subclasses,
called IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. Most of the
opsonizing and complement fixation functions
of IgG are attributable to IgG1 and IgG3.
 Vezanje protutijela za antigene
• Vezno mjesto ta antigen na molekuli protutijela zove se paratop
• Dijelovi molekula antigena koje prepoznaju protutijela zovu se epitopi
(antigenske detrminante): linearni i konformacijski epitopi
• Afinitet interakcije = snaga kojom se jedan paratop veže za epitop
• Afinitetno sazrijevanje=povećanje snage interakcije (u sek. imun. odgovoru)
• Avidnost interakcije = ukupna jačina vezanja puno je veća od afiniteta
pojedinačne veze antigen-At
• Križna reakcija = At proizvedena protiv jednog antigena mogu se vezati za
druge strukturno slične antigene
Vezanje protutijela za antigene

This model of a protein antigen bound

to an antibody molecule shows how the
antigen-binding site can accommodate
soluble macromolecules in their native
(folded) conformation. The heavy
chains of the antibody are red, the light
chains are yellow, and the antigens are
blue.
 Stvaranje hibridoma i
monolonskih At

In this procedure, spleen cells from a mouse that has been

immunized with a known antigen are fused with an enzyme-
deficient myeloma cell line that does not secrete its own
immunoglobulins. The fused cells are then placed in a selection
medium that permits the survival of only immortalized hybrids;
the normal B cells provide the enzyme that the myeloma lacks,
and unfused B cells cannot survive indefinitely. These hybrid
cells are then grown as single-cell clones and tested for the
secretion of antibody of the desired specificity. The clone
producing this antibody is expanded and becomes a source of
the monoclonal antibody.
Odabrana monoklonska
At u kliničkoj uporabi
The figure lists some of the
monoclonal antibodies that are
approved for the treatment of
various types of diseases.
 Receptori T-stanica za antigene (TCR)
• TCR prepoznaje peptidne antigene predočene u sklopu molekula MHC na APC
• TCR je heterodimerni membranski protein sastavljen od lanca α i β, od kojih
svaki sadrži jednu V i C regiju
• U regiji V svakog lanca TCR nalaze se tri CDR (najveća varijabilnost CDR3)

• TCR prepoznaje antigen, ali ne može sam prenijeti signal u stanicu

• Koreceptorske molekule (CD4 ili CD8), signalne molekule (CD3 i zeta),
kostimulacijske molekule (CD28) osiguravaju prijenos signala i aktivaciju T-st.
 Specifični biljezi
limfocita T

TCR – antigenski receptor limfocita T

CD3-kompleks i molekula zeta:

signalne molekule

CD4 ili CD8 molekule: koreceptori

limfocita T

Kostimulacijske i inhibicijske
molekule:
CD28/B7, CD40L/CD40,
OX40(CD134)/OX40L, CTLA4/B7
inhibicijski signal
Koreceptorske molekule limfocita Tαβ
Struktura TCR

The schematic diagram of the αβ TCR (left) shows

the domains of a TCR specific for a peptide-MHC
complex. The antigen-binding portion of the TCR is
formed by the V domains of the α and β chains. N
and C refer to the amino-terminal and carboxy-
terminal ends of the polypeptides. The ribbon
diagram (right) shows the structure of the
extracellular portion of a TCR as revealed by x-ray
crystallography. Ig, Immunoglobulin; MHC, major
histocompatibility complex.
Prepoznavanje kompleksa peptid-MHC
pomoću TCR

This ribbon diagram is drawn from the crystal structure of the

extracellular portion of a peptide-MHC complex bound to a TCR
that is specific for the peptide displayed by the MHC molecule.
The peptide can be seen attached to the cleft at the top of the
MHC molecule, and one residue of the peptide contacts the V
region of a TCR. MHC, Major histocompatibility complex; TCR, T
cell receptor; β2m , β2-microglobulin.
 Predočavanje antigena limfocitima T
Limfociti Tγδ (5-10%)
Limfociti Tαβ (85-90%) APS
a) CD1a+ (MHC1-like)
APS
b) bez selekcije u timusu
a) profesionalne (za CD4+) c) Bez koreceptorskih
- makrofag molekula CD4 i CD8
- dendritična stanica d) Mala varijabilnost
receptora
- limfocit B
e) Ugl. prepoznaju
bakterijske fosfolipide i
glikolipide
b) neprofesionalne
f) Ugl. naseljavaju epitel
(za CD8+) sluznica
 Razlika u prepoznavanju antigena pomoću BCR i TCR

• Protutijela mogu vezati puno kemijski različitih struktura obično s

visokim afinitetom: neutralizacija različitih mikroba i toksina

• TCR veže samo kompleks peptid-MHC s relativno niskim afinitetom:

potrebne adhezijske molekule za pojačano vezanje s APC
Razlika u prepoznavanju antigena pomoću BCR i TCR
 Razvoj imunološkog repertoara
• Imunološki repertoar = skup različitih klonova limfocita s antigenski-
specifičnim receptorima
• Postoji puno različitih klonova limfocita (109) koji nastaju prije susreta s
antigenom
• Stvaranje vrlo raznolikih antigenskih r. iz ograničenog broja gena
• Usko vezan uz proces sazrijevanja limfocita T i B
• Imunološki sustav može specifično prepoznati gotovo sve antigene s kojima
dođe u dodir. Što je osnova toga?
• Teorija klonske selekcije: razjasnila biološku osnovu specifičnog
prepoznavanja antigena
 Postulati hipoteze klonske selekcije

Svaki limfocit izražava jednu vrstu receptora jedinstvene

specifičnosti
Interakcija antigena i receptora dovodi do aktivacije ili inaktivacije
limfocita (ovisno o zrelosti limfocita)

Diferencirane efektorske stanice nastale od aktiviranog

limfocita izražavaju identičan receptor

Limfociti specifični za vlastite antigene bivaju odstranjeni

tijekom razvoja limfocita
 Teorija klonske selekcije

• limfocit - monospecifičan (za antigen)

• ≈105 istovjetnih receptora na membrani
• vezanje receptora i antigena – načelo
stereokemijske komplementarnosti
Specifično vezanje
limfocita i antigena

ishod ovisi o
zrelosti limfocita
i vrsti antigena
 Nastanak raznolikih antigenskih receptora
• Stvaranje funkcionalnih gena koji kodiraju BCR i TCR započinje somatskom
rekombinacijom genskih segmenata koji kodiraju varijabilne regije tih receptora pri
čemu nastaje njihova raznolikost
• Svi genski lokusi za antigenske receptore sadrže V, J i C gene, a samo lokusi za
teške lance Ig i lanac β TCR sadrže i segmente D
• Somatska rekombinacija genskih segmenata V, (D) i J posredovana je enzimom
specifičnim za limfoidne stanice, rekombinazom VDJ, i dodatnim enzimima
uključenim u popravak dvolančanih lomova DNA (ligaza)
• Raznolikost antigenskih r. nastaje odabirom različitih kombinacija genskih
segmenata V, D i J u različitim klonovima limfocita (kombinacijska raznolikost), a
još u većoj mjeri promjenama u sekvencama nukleotida na spojevima
rekombiniranih segmenata V, D i J (spojna raznolikost)
 Organizacija genskih lokusa Rekombinacija i ekspresija
antigenskih receptora u zametnoj imunoglobulinskih gena
lozi
Mehanizmi različitosti
antigenskih receptora

Diversity in immunoglobulins and T cell

receptors is produced by random
combinations of V, D, and J gene segments,
which is limited by the numbers of these
segments and by removal and addition of
nucleotides at the V-J or V-D-J junctions,
which is almost unlimited. The numbers of
gene segments refer to the average
numbers of functional genes (which are
known to be expressed as RNA or protein)
in humans. Junctional diversity maximizes
the variations in the CDR3 regions of the
antigen receptor proteins, because CDR3
includes the junctions at the site of V-J and
V-D-J recombination
 Razvoj i sazrijevanje limfocita
1. Primarna diferencijacija:
- U koštanoj srži (limf. B) i timusu (limf. T)
- Neovisna o stranim antigenima
- Preuredba gena za antigenski receptor
- Selekcija (odabir) limfocita
- Stvaranje zrelih imunokompetentnih stanica
2. Sekundarna diferencijacija:
- U limfnim čvorovima i slezeni
- Ovisna o stranim antigenima
- Stvaranje izvršnih (efektorskih) stanica
 Primarna diferencijacija limfocita
• Opredjeljivanje zajedničkih limfoidnih progenitora u koštanoj srži
prema lozi B ili T stanica
• Limfociti u razvoju prolaze kroz proliferaciju tijekom nekoliko faza
procesa sazrijevanja

• Tijekom sazrijevanja limfociti prolaze kroz nekoliko faza selekcije

kako bi zadržali korisne osobine
• Pozitivna i negativna selekcija
Koraci u sazrijevanju limfocita

During their maturation, B and T

lymphocytes go through cycles of
proliferation and expression of antigen
receptor proteins by gene
recombination. Cells that fail to
express intact, functional receptors die
by apoptosis, because they do not
receive the necessary survival signals.
At the end of the process, the cells
undergo positive and negative
selection. The lymphocytes shown may
be B or T cells.
 Sazrijevanje limfocita Tαβ
1. Primarna diferencijacija u timusu:
- Spregnutost na vlastito: prepoznavanje vlastitog peptida samo u
sklopu vlastitih MHC molekula
- Proces selekcije zbiva se na razini dvostruko pozitivnih stanica
(CD4+CD8+)
- Preživljavaju samo one stanice koje prepoznaju vlastito
(MHC/HLA+antigen) slabim afinitetom (pozitivna selekcija)
- Odumiranje autoreaktivnih klonova (negativna selekcija):
tolerancija na vlastito
- Zreli naivni limfociti T (CD4+CD8- ili CD4-CD8+)

2. Sekundarna diferencijacija u perifernim limfnim organima

Sazrijevanje i selekcija limfocita Tαβ
The maturation of T lymphocytes in the
thymus proceeds through sequential steps
often defined by the expression of the CD4
and CD8 coreceptors. The T cell receptor
(TCR) β chain is first expressed at the
double-negative pre-T cell stage, and the
complete T cell receptor is expressed in
double-positive cells. The pre-TCR consists
of the TCR β chain associated with a
protein called pre-Tα. Maturation culminates
in the development of CD4+ and CD8+
single-positive T cells. As with B cells,
failure to express antigen receptors at any
stage leads to death of the cells by
apoptosis. Only class II MHC is shown for
negative selection, but the same process
eliminates self-reactive class I MHC–
restricted CD8+ T cells.
 Sazrijevanje limfocita B
• Primarna diferencijacija – u koštanoj srži
– Preuredba gena za receptor B limfocita
– Nezreli limfociti B se otpuštaju u cirkulaciju (izražavaju
IgM)
– U sek. limf. organima pojavljuje se molekula IgD i CD21
(zreli naivni limfociti)

• Sekundarna diferencijacija – u perifernim limfnim

organima (LČ, slezena, MALT)
– Gensko prekapčanje razreda Ig-uloga CD4+ limfocita T
– Somatske hipermutacije gena za varijabilnu regiju
Sazrijevanje i selekcija limfocita B

The maturation of B lymphocytes proceeds

through sequential steps, each of which is
characterized by particular changes in
immunoglobulin (Ig) gene expression and in the
patterns of Ig protein expression. Pro-B cells
begin to rearrange Ig heavy-chain genes and
large pre-B cells are selected to survive and
proliferate if they successfully rearrange an Ig
heavy-chain gene and assemble a pre-BCR.
The pre-BCR consists of a membrane-
associated Ig μ protein attached to two other
proteins called surrogate light chains because
they take the place of the light chain in a
complete Ig molecule. Small pre-B cells initiate
Ig light-chain gene rearrangement, immature B
cells assemble a complete membrane IgM
receptor, and mature B cells coexpress IgD,
with the same V regions and specificity as in
the first Ig produced. BCR, B cell receptor;
HSC, hematopoietic stem cell; mRNA,
messenger RNA.
 Subpopulacije limfocita B
• Limfociti B2 (>90%) – nosioci humoralne imunosti
• Limfociti B1 (5-10%) – većina izražava CD5
- uglavnom se nalaze u pleuralnoj i trbušnoj šupljini
- imaju vrlo ograničenu varijabilnost BCR
-proizvode tzv. prirodna protutijela razreda IgM (nastaju bez
prethodne imunizacije, izostanak suradnje s pomagačkim
limfocitima T, nema genskog prekapčanja)
- ne nastaju memorijske stanice
-protutijela usmjerena na polisaharide mikroorganizama i i
vlastite molekule (DNA, proteini citoskeleta)
 Razvoj limfocita
učenje na vlastitim Ag ovisno o tuđim Ag Plazma-stanice

T-efektori