Monoklonska antitijela

Seminarski rad - Biotehnologija

Cilj
Objasniti i predstaviti slijedee pojmove :
Imunologija
Imunoloki sistem
Antigen
Antitijelo
Monoklonska antitijela
ELISA test

Imunoloki sistem
Imunologija ( lat - immunitas = otpornost, gr logos =
nauka)- nauka koja se bavi otpornou organizma na
tetne uticaje okoline, tj.prouava sposobnost organizma
da se odupre stranim materijama (antigenima ).
Imunitet odbrambeni mehanizam koji titi organizam
od tetnih uticaja mikroba i slinih stranih agenasa.
Imunoloki sistem - skup elija , tkiva i molekula koji
posreduju u otpornosti na infekciju a koordinisana
reakcija tih elija i molekula na infektivne
mikroorganizme predstavlja imunoloki odgovor.

ta pojaava imunoloki odgovor i koje

su funkcije ovog sistema ?
Vakcinacija - pojaava imunoloki odgovor te titi od
infekcije.
Imunoloki sistem :
a. prepoznaje i odgovara na presaena tkiva i nove
proteine, odnosno predstavlja barijeru za transplantaciju
i gensku terapiju
b. ima ulogu i u odbrani od tumora

Organizacija imunolokog
sistema
Imunoloki sistem se sastoji od limfnih organa, tkiva i
cirkulirajuih sastojaka rasporeenih gotovo posvuda po
tijelu.
Organi ukljueni u imunoloki sistem dijele se na :
a. Primarne ( sredinje ) timus, fetalna jetra, kotana
sr
b. Sekundarne ( periferne ) slezena, limfni vorovi,
limfna tkiva

elije imunolokog sistema

Stanice imunolokog sistema nastaju iz pluripotentnih
praelija koje sazrijevaju u dva glavna puta:
a. iz limfoidnih prekursora nastaju limfociti (limfociti T,
limfociti B i prirodnoubilake elije)
b. iz mijeloidnih prekursora nastaju fagociti
(monociti/makrofagi, neutrofilni i eozinofilni granulociti elije za predoavanje antigena) i posrednike elije
(bazofilni granulociti, mastociti i trombociti)

elije imunolokog sistem

elije imunolokog sistema

Limfociti ( bijela krvna zrnca ) imaju najvaniju ulogu
u odravanju ljudskog zdravlja
Postoje tri osnovne grupe limfocita koji se morfoloki ne
razlikuju ve su razlike samo funkcionalne:
a. B-limfociti su odgovorni za humoralni imunitet- reguliu
stvaranje antitijela
b. T-limfociti uestvuju u elijskom imunitetu -imaju ulogu
da prepoznaju i razlikuju strane materije od onih koje
pripadaju organizmu i da ih unite.

elije imunolokog sistema

Granulociti - proizvode se u kotanoj sri a igraju vanu
ulogu u akutnoj upali zajedno sa antitijelima.
Monociti/makrofagi - imaju ulogu u fagocitozi i
predoavanju antigena i imunoregulaciji.
Funkcije monocita/makrofaga su:
a. izvrne-fagocitoza,
b. regulacijske funkcije-makrofag
. Trombociti - osim uloge u koagulaciji krvi posreduju i u
imunolokim reakcijama, u upali.

Antigeni
Antigen (gr.anti (protiv) + gen,
skraeno od lat. generatus - (stvarati,
roditi) je molekula koja potie stvaranje
antitijela, odnosno imunu reakciju u
organizmu.
Antigeni koji izazivaju stvaranje
antitijela u organizmu nazivaju se jo i
imunogeni.
U uem smislu, imunogeni potiu
reakciju imunog sistema dok su
antigeni supstance za koja se veu
odreena antitijela.

Antigeni
Ranije se antigen definirao kao molekula koja moe
potaknuti limfocit B na stvaranje antitijela (engl.
ANTIbody GENerator).
Danas taj izraz ima ire znaenje i oznaava svaku
molekulu koju mogu prepoznati mehanizmi steene
imunosti, bez obzira jesu li posredovani limfocitima B ili
T.
Molekula antitijela obino se ne vee na cijelu molekulu
antigena ve, zbog svoje specifinosti, samo na dio
antigenske molekule, koji se naziva epitop.

Antigeni
Antigenska determinanta ili epitop je dio makromolekula
koji prepoznaje antitijelo.
Epitopi mogu biti nepreklapajui, kada su prostorno
udaljeni i omoguavaju vezivanje dva ili vie antitijela.
Preklapajue determinante su blizu jedna drugoj i
dovode do sternih smetnji prilikom vezivanja antitijela, a
u rijetkim sluajevima je mogue i da vezivanje prvog
antitijela dovede do konformacione promjene strukture
antigena ime se utie na vezivanje drugog antitijela.

Antigeni

Antigeni
Antigeni su u 99% sluajeva proteini, mada mogu biti
i nukleinske kiseline, polisaharidi i neki sloeni lipidi.
Oni mogu initi dio bakterija ili virusa ili mogu biti toksini
(otrovi koje isputaju ti strani organizmi).
Neki antigeni su u tijelu prisutni od roenja, npr. oni koji
odreuju krvne grupe ABO i Rh sistema i tkivni antigeni.
Sopstvene bjelanevine nemaju odlike antigena, ali ako
se belanevine jedne osobe unesu u drugu osobu,
nastaju imunoloke reakcije. Imunoloke reakcije u
sluaju pogrene transfuzije krvi mogu biti vrlo teke.

Antigeni
Podjela antigena :
1. Antigeni klase 1 koje se nalaze u svim elijama.
2. Antigeni klase 2 koje se nalaze jedino u imunim
elijama.
. Porijeklo antigena :
. Egzogeni antigeni, su oni antigeni koji su dospjeli u
organizam izvana
. Endogeni antigeni, koji se stvaraju unutar elije, kao
produkt normalnog metabolizma elije ili zbog infekcije
unutar elije nastale djelovanjem virusa ili bakterija.

Antigeni

Antigeni
Princip odreivanja krvne grupe

Lijevo se nalazi serum krvi sa anti

B antitijelom. Desno sa anti A
antitijelom ,zbog aglutanacije sa
desne strane zakljuujemo da je
tip krvi A.

Antitijela
Antitijela (imunoglobulini) - proteini/bjelanevine iz grupe
globulina
Markiraju se antigenima
Nastaju u vrsti bijelih krvnih zrnaca, B-limfocitima
Antitijela su prisutna u krvi, limfi, tkivima te u
membranama sluzokoe

Antitijela
Svako antitijelo se sastoji od dva
jednaka teka lanca (heavy
chains, H) i dva laka lanca (light
chains, L) koji su kovalentnim
disulfidnim mostovima
meusobno povezani u strukture
oblika slova (Y).

Mehanizmi djelovanja antitijela

Postoji vie naina mehanizma djelovanja antitijela:
1. Neutralizacija antigena
2. Antitijela vezujui se na povrinske strukture nekog
antigena npr. bakterije uine ovu lake prepoznatljivom
za odbrambene elije organizma fagocite koji e tako
oznaenu bakteriju lake prepoznati i unititi je
"prodiranjem" njenog materijala
3. Trei nain djelovanja se ispoljava kroz takozvano
aktiviranje komplementarnog sistema

Mehanizmi djelovanja antitijela

Antitijela imaju sposobnost vezivanja i na neke elije
vlastitog organizma kod kojih je dolo do neeljenih i po
organizam opasnih promjena

Razliite klase antitijela

Imunoglobin A

Razliite klase antitijela

Imunoglobin D

Razliite klase antitijela

Imunoglobin E

Razliite klase antitijela

Imunoglobin M

Razliite klase antitijela

Imunoglobin G

Antitijela
Proces aglutinacije, odnosno sljepljivanje uoblienih
elemenata (bakterija, elija, eritrocita i dr.) u manje i vee
gomilice;
Liza, rastvaranje ili razaranje uoblienih elemanata
(krvnih elija hemolizini, bakteriolizini) i precipitacija,
taloenje supstance koja je dotad bila u rastvoru
(proteini)
Aglutinini, (hemaglutinini za eritorcite), lizini (hemolizini) i
precipitini
Aglutiniogeni, liziongeni i precipitinogeni

Antitijela
Antitijela za krvnogrupne antigene dijele se i prema
nainu dejstva, odnosno prema sposobnosti da stupaju u
reakciju sa odgovarajuim antigenom suspendovanim u
slanom fiziolokom rastvoru, na: kompletna i
inkompletna
Takoer, postoji podjela antitijela s obzirom na
specifinost antigena:
1. Monoklonska antitijela (antitijelo koje se vee na samo
jedan antigen)
2. Poliklonska antitijela

Otkrie monoklonskih antitijela

U odnosu na specifinost antigena, postoje dva tipa
antitijela:
1. Monoklonska antitijela (specifina)
2. Poliklonska antitijela (nespecifina)
. Poloklonska antitijela su heterogena-proizvodi ih vie
razliitih klonova elija.
. Monoklonska su homogena jer nastaju od jednog klona
elija.

Historijat
Paul Erlich, utemeljitelj
imunologije, elio pronai lijek
koji bi unitio mikroorganizme,
bez tetnog djelovanja na
ovjeka.

Historijat
George Kohler, Cesar Milstein I Niels K. Jerne su 1975.
se pribliili toj ideji i uspjeli su izolirati prva monoklonska
antitijela iz klonova stanica (elija).

George Kohler

Niels J. Kerne

Cesar Milstein

Definicija i podjela
Monoklonska antitijela su supstance proizvedene u
laboratorijama koje specifino prepoznaju odreene
strukture na povrini malignih elija kao to su na
primjer proteini. Svako monoklonsko antitijelo
prepoznaje samo jedan cilj (specifian protein ili
antigen.)
Tipovi monoklonskih antitijela:
1. Mija monoklonska antitijela
2. Himerina monoklonska antitijela
3. Humanizirana monoklonska antitijela

Upotreba monoklonskih
antitijela
Zbog visokog specifinog i selektivnog vezanja za
antigen koriste se u:
1. In vitro dijagnostici, kao terapijski agensi, kao ligandi u
imunoafinitetnoj hromatografiji, katalizi.
2. Monoklonska antitijela pokazala su se uinkovitim i
trino isplativim lijekovima za lijeenje raka.

Znaaj i princip djelovanja

monoklonskih antitijela
Stalna upotreba novih biotehnlokih metoda je
rezultirala, ne samo potpuno novim lijekovima, nego i
novim metodama istraivanja i razvoja proizvodnje
lijekova u novonastalim i brzo rastuim biotehnolokim
laboratorijama i kompanijama.
Nova slektivno molekulska grana medicine - razvoj novih
lijekova je baziran na monoklonskim antitijelima.

Znaaj i princip djelovanja

monoklonskih antitijela
Za biotehnologiju je interesantan je nain na koji antitjela
prepoznaju strane tvari i na njih se veu.
Svako monoklonsko antitijelo prepoznaje samo jedan cilj
(specifian protein ili antigen), potom moe da uniti
malignu eliju i/ili da stimulie imuni sisitem organizma
da napadne ovaj cilj.
Monoklonska antitijela napadaju samo i iskljuivo
molekul za koji su specifina tako da su neeljeni efekti
izbjegnuti ili znatno smanjeni.

Kako dobiti MA ?

Dobivanje MA
B-stanice umiru kratko nakon to se odvoje od tijela.
Njihov je ivotni vijek u laboratoriju suvie kratak da bi se
mogao stvoriti toliko veliki klon za koji bi se moglo tano
utvrditi koju vrstu antitijela proizvodi.
Zbog tog razloga ne moe se dobiti ni dovoljna koliina
antitijela za praktinu primjenu.

Dobivanje MA
Khler i Milstein su pronali tehniko rjeenje tog
problema.
Paradoksalno rjeenje - upotreba stanica raka
Stanice raka su vrlo prikladne za uzgoj, u primjerenim
laboratorijskim uvjetima one e rasti i dijeliti se
beskonano, kombiniranjem sposobnosti B-stanica da
proizvode antitijela s pseudobesmrtnou stanica raka
mogu dobiti velike koliine monoklonskih protutijela.

Dobivanje MA
Teak je bio zadatak usavravanje neke metode
stvaranja hibridoma stanica, ali ve nekoliko godina
nakon poetnih uspjeha Milsteina i Khlera, ti su
postupci dotjerani i uvedeni u svakodnevnu praksu u
stotinama laboratorija .
U poetku se to radilo mijeanjem stanica s virusima, a u
novije je vrijeme ustanovljeno da taj zadatak jo bolje
moe obaviti jednostavna i jeftina supstanca
polietilenglikol.

Dobivanje MA
Za dobivanje monoklonskih antitijela najee se koriste
stanice slezene i stanice mijeloma (stanice tumora kotane
sri) mia koje su kancerozni oblik B-stanica.

Dobivanje MA
Koraci u produkciji monoklonskih antitijela:
1. Imunizacija eksperimentalne ivotinje eljenim antigenom
2. Izolacija B limfocita iz limfnog vora ili slezene
3. Fuzija sa stanicama mijeloma
4. Selekcija in vitro u HAT medijumu Testiranje supernatanta
kulture na prisustvo antitijelala(ELISA, RIA)
5. Izdvajanje eljenog klona
6. Izdvajanje i preiavanje antitijela
7. Produkcija monoklonskih antitijela

Dobivanje MA
Imunizacija eksperimentalne zivotinje eljenim
antigenom (imunizacija mia na stimulisanu produkciju
AT)
Inokulacija antigena se vri subkutano ili
intraperitonealno

Dobivanje MA
Fuzijom nastaju hibridoma stanice: trajne stanine linije
koje izluuju monoklonalna antitijela

Dobivanje MA
Hibridoma stanice se dalje :
a) injektiraju u mia (in vivo) u abdomenalnoj upljini se
stvara tekuina bogata antitijelima (ascites)
b) uzgajaju u mediju za kulturu stanica (in vitro
antitijela se isputaju u medij (c < 20 g/ml) u kojem
nema (ili ima vrlo malo) seruma

Dobivanje MA

Primjena MA

Primjena MA
Poduslovi za primjenu MA :
visoka ekspresija na povrini elija
ne eksprimiraju se na elijama od vitalnog znaaja
odsustvo znaajne toksinosti u sluaju kompletne
eliminacije antigen pozitivnih elija
stabilna genetska struktura antigena (nema mutacija ili
varijacija)
neophodan za kritine bioloke funkcije ili elijsko
preivljavanje
ne dolazi do modifikacije nakon vezivanja antitijela

Primjena MA
Monoklonska antitijela se mogu primjenjivati u:
1. Detekciji razliitih proteina u tjelesnim tenostima
( Elisa testovi) citokini, tumorski markeri, hormoni itd.
2. Imunofenotipizaciji elija razliiti tipovi limfocita, NK
elije, makrofagi.
3. Imunohistohemiji- razliitih proteina u tkivima, elijskih
receptora itd.
Primjena monoklonskih antitijela moe biti : in vitro i in
vivo.
In vivo primjena: dijagnostika, terapija i profilaksa.

Primjena MA u dijagnostici
Identifikacija elijskih antigena: prema citoskeletalnim
proteinima, antitijela prema organ-specifinim antigenima
Identifikacija solubilnih antigena: hormoni, enzimi, i druge
bioloki aktivne supstance
Identifikacija bakterijskih, virusnih i parazitnih antigena
U terapiji se primjenjuju kao :
-Anti-tumorski agensi ( u terapiji nekih vrsta tumora plua)
-Imunosupresivni agensi ( u transplataciji nekih tkiva i
organa)
-Anti-toksinski agensi ( u neutralizaciji toksina nekih gljiva

Primjena MA u profilaksi
Aktivna i pasivna imunizacija
Aktivna imunizacija- imunosistemu domaina se
prezentira prikladan antigenski stimulans
Pasivna imunizacija- unoenje gotovog imunoreaktivnog
seruma, unoenje purifikovanih antitijela

Herceptin
Monoklonsko antitijelo protiv
ErbB-2 onkoproteina
erbB-2 gen prekomjerno
eksprimiran u ~ 30%
sluajeva raka dojke
Vezanjem Herceptina na
vanstaninu domenu ErbB-2
inhibira se rast stanica koje
eksprimiraju taj onkoprotin

ELISA test
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(Imunoadsorpcioni enzimski test)

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(Imunoadsorpcioni enzimski test)

ELISA test
Svrha testa: detekcija patogena, identifikacija hemijskih
komponenata i toksina.
Prednosti:
1. lahkoa pri izvoenju;
2. brzina pri izvoenju;
3. primijenjljivost na vei broj patogena;
4. mogunost djelimine automatizacije;
5. mogunost analize veeg broja uzoraka

ELISA test
Interakcija antitijelo-antigen klju za ELISA test.
Enzim kao "marker" za antitijelo.
Tipini supstrat-enzim kompleksi:

- alkalna fosfataza (enzim) sa para-nitrofenol fosfatom

(supstrat);

- peroksidaza hrena (enzim) sa tetrametilbenzidinom

(supstrat).

ELISA test
vrsti, fiziki nosa
reakcije:
- mikrotitarske ploe;
- papirne membrane;
- polistirenske lopatice.

Elisa test
Princip metode: konjugacija enzima sa antigenom ili
antitijelom.
Detekcija enzima: dodatkom bezbojnog supstrata i
mjerenjem enzimske aktivnosti

Elisa test
Mjerenje intenziteta boje kolorimetrijski.
Direktno proporcionalan sadraju specifinih antitijela u
ispitivanom materijalu.
Detekcija krajnjeg rezultata: okom ili spektrofotometrijski.

Elisa test

ELISA test
Tipovi ELISA testa :
1. Sendvi ELISA test
2. Indirektan sendvi ELISA test
3. Kompetitivan ELISA test

ELISA test
Sendvi ELISA test

ELISA test
Sendvi ELISA test

ELISA test
Indirektan sendvi ELISA test :
Detekciono protutijelo ne nosi vezani
enzim, ve posebne marker molekule koje
e se specifino vezati za drugu molekulu,
npr. protein.
Biotin kao marker.
Biotin avidin enzim.

ELISA test
Kompetitivan ELISA test

ELISA test

Prednosti i nedostaci ELISA

testa
OSJETLJIVOST
Osjetljivost veine ELISA testova je 105
elija/ml. ovaj relativno nizak nivo je
osnovni nedostatak koritenja ovog tipa
testa.

Prednosti i nedostaci ELISA

testa
SPECIFINOST
ELISA test treba da ima odgovarajuu specifinost
niskog broja lanih negativnih i prihvatljiv broj lano
pozitivnih rezultata. Antitijela koja se koriste bi trebala da
imaju visok afinitet za specifine antigene.
Dva tipa antitijela koja se koriste u ELISA testu su
monoklonska i poliklonska.
Jedan od nedostataak koritenja poliklonskih antitijela je
taj da se oni dobijaju ili iz zeijeg ili kozijeg seruma pri
emu moe doi do razliitosti u imunom odgovoru
razliitih ivotinja.

Prednosti i nedostaci ELISA

testa
Monoklonska antitijela su vie specifina i
djeluju na jedno antigeno mjesto.
Veina ELISA testova je brza ( analiza od
4-5 dana je svedena na 24-30 sati).

Rezime
Imunitet odbrambeni mehanizam koji titi organizam
od tetnih uticaja mikroba i slinih stranih agenasa.
Imunoloki sistem - skup elija , tkiva i molekula koji
posreduju u otpornosti na infekciju a koordinisana
reakcija tih elija i molekula na infektivne
mikroorganizme predstavlja imunoloki odgovor.
elije imunolokog sistema : limfociti, granulociti,
monociti/makrofagi....
Antigen je molekula koja potie stvaranje antitijela,
odnosno imunu reakciju u organizmu.

Rezime
Podjela antigena :
1. Antigeni klase 1 koje se nalaze u svim elijama.
2. Antigeni klase 2 koje se nalaze jedino u imunim
elijama
. Antitijela (imunoglobulini) - proteini/bjelanevine iz
grupe globulina - Markiraju se antigenima.
. Svako antitijelo se sastoji od dva jednaka teka lanca
(heavy chains, H) i dva laka lanca (light chains, L) koji su
kovalentnim disulfidnim mostovima meusobno povezani
u strukture oblika slova (Y).

Rezime
U odnosu na specifinost antigena, postoje dva tipa
antitijela:
1. Monoklonska antitijela (specifina)
2. Poliklonska antitijela (nespecifina)
. Monoklonska antitijela su supstance proizvedene u
laboratorijama koje specifino prepoznaju odreene
strukture na povrini malignih elija kao to su na
primjer proteini.
. Fuzijom nastaju hibridoma stanice: trajne stanine linije
koje izluuju monoklonalna antitijela

Rezime
Primjena MA : detekcija razliitih proteina u tjelesnim
tenostima, imunofenotipizaciji elija te u
imunohistohemiji.
Svrha ELISA testa: detekcija patogena, identifikacija
hemijskih komponenata i toksina.
Interakcija antitijelo-antigen klju za ELISA test.
Princip metode: konjugacija enzima sa antigenom ili
antitijelom.
Tipovi ELISA testa : sendvi ELISA test, indirektan
sendvi ELISA test, kompetitivan ELISA test.

Hvala na panji