BQ GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC MO TP. HO CHi MINH KHOA LUAN TOT NGHIEP Tén dé tai: TOI UU HOA MOI TRUONG NUOI CAY CHUNG Lactobacillus plantarum NT1.5 BANG PHUONG PHAP QUY HOACH THU'C NGHIEM KHOA CONG NGHE SINH HQC CHUYEN NGANH: VI SINH - SINH HOC PHAN TU’ GVHD: ThS. DUONG NHAT LINH SVTH : TRAN TH] KIEU MSSV : 1053012348 KHOA: 2010-2014 Tp.H6 Chi Minh, thang 05 nam 2014LOICAM 0! Em xin chan thanh giti 16i cam on dén: Cé Duong Nhit Linh vi thiy Nguyén Vn Minh — ging vién khoa Cng nghé Sinh hoc Truéng Dai Hoc Mé Tp Hé chi Minb, ¢6 thay ld ngudi da tan tinh huéng din, tao didu kign, truyén dat kién thire dé em 6 thé hoan thanh tét dé tai. Chin thanh cdm on cdc thay, 6 khoa Cong nghé Sinh hgc truéng Dei Hoc Mo Tp H6 Chi Minh da tan tinh giang day, nen tang dé em c6 thé hoan thanh dé tai. Thay Dan Duy Phap, chi Vo Ngge Yén Nhi, chi Pham Thj Minh Trang, chi Nguyn Thj Mj Linh, anh Nguyén Dat Phi li ngudi di truyén dat nhimg kinh tuyén dat cho em nhimg kién thite co ban lam nghiém, déng vién gitp 43 em vugt qua nhimg khé khin trong théi_gian thye hién 43 ai Xin cam on dén cac anh/ chi, cdc ban va céc em Phong thf nghiém Cong nghé Vi sinh da gidp d6, déng vién em trong thoi gian qua. Cudi ciing, con xin giti léi cém on dén Ba, Me, gia dinh da ludn bén canh ing hd tao diéu kign tét nhat cho con hoan thanh t6t viée hoc tap cla minh. ‘Chin thanh cam on! Binh Duong, ngay thang nam 2014 TRAN THI KIEUTONG QUAN TAI LIEU MUCLUC DAT VAN DE CHUONG 1: TONG QUAN TAI LIEU 1, TONG QUAN VE VI KHUAN LACTIC. LA. Gidi thigu. 112. Con duryng bién during ciia vi khuan lactic 1.13. ‘Téng quan vé Lactobacillus plantarui 1.2. TINH HINH NGHIEN CUU TRONG VA NG LACTOBACILLUS ... see wo bee eee 10 1 Cie nghién ciru trén thé gi 1.2.2, ‘Céc ng! 1.3. QUY HOACH THUC NGHIEM ... ciru trong née 1.3.1. Phuong php quy hogch thyc nghigm 3 ceil 1.3.2. Thi nghi¢m sing loc 1.3.3. Thi nghiém t6i uu héa. 1.4, PHAN MEM QUY HOACH THY'C NGHIEM MINITAB 16.2.0. CHUONG 2: VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU.. 2.1. THO GIAN VA DIA DIEM NGIEN CUU. 4 2.2. VAT LIRU NGHIEN COU. 24 2.21. D6i tong nghién ctu 20a) Méi truong — héa chat... 2.2.3. Dyng cy .. 24 2.2.4. Trang thiét bj seen seve 24 2.3. PHUONG PHAP NGHIEN CUU “s . eoeomentaS 2.3.1. Hoat héa ching 2 aS 2.3.3. Xfy dyng dudng cong ting trwéng ciia L. plantarum NT 1.5 26 SVTH: TRAN THI KIEU iTONG QUAN TAI LIEU 2.3.4. Khio sit nhigt d9, pH thich hyp cho sy ting truéng ciia L. plantarum NTLS 27 2.3.5. ng lgc cde yéu t6 dinh dong 2.3.6. ‘Thiét ké thi nghiém tim yéu t6 anh huéng dén qua trinh én men tang sinh khéi theo thiét ké Plackett- Burman...... i e aD. 2.3.7. Thi nghiém khéi dau. 32 2.3.8. Tim Khoang tdi wu cita cdc yéu t6 anh hung chinh bing phuong phap leo déc..... cane) 2.3.9. ‘Thi nghiém bé mat chi titu x4c dinh gid tri t6i wu cia céc yéu t6 anh hugng chink. a z 5 elas 2.3.10. Xie dinh thoi gian ting trig cia ching L. plantarum NT1.5 trén méi triréng téi wu. 33 CHUONG 3: KET QUA NGHIEN CUU VA THAO LUAN 3.1. KET QUA XAY DUNG DUONG TUONG QUAN GIU'A MAT DO TE BAO VI KHUAN VA GIA TRI OD610...+--:sessssseesesssessnsseseene i rrr! 3.2. KET QUA XAY DUNG BUONG CONG TANG TRUONG CUA L. PLANTARUM NT 1.5. ie . - connee ws aoeee 36, 3.3 KET QUA KHAO SAT NHIET BQ, pH THICH HOP CHO Sly TANG TRUONG CUA L. PLANTARUM NT1.5. 3.4 KET QUASANG LOC YEU TO DINH DUONG 341 Ngudn nito. 3.4.2, Ngudn cacbon.......... 3 Nogub hoding sisciisccasssniasssnsatusncissnticcusasativesints ei KET QUA XAC BINH CAC YEU TO ANH HUONG CHINH THEO THIET KE THi NGHIEM PLACKETT- BURMAN. coe cessecnseeeeseeien dd 3.6 KET QUA THIET KE THE NGHIEM KHOI DAU 0.00... ceeces cee eesee AB SVTH: TRAN THI KIEU iiTONG QUAN TAI LIEU 3.7 KET QUA THI NGHIEM LEO DOC ne si i 50 3.8 KET QUA THI NGHIEM BOX-BEHNKEN................ . sacssaetes D2 3.9. KET QUA KHAO SAT SY TANG TRUONG CUA L. PLANTARUM NTLS TREN MOI TRUONG TOI UU is sf x saanSt 41 KET LUAN.... 4.2 KIEN NGHI.. TALLIEU THAM KHAO... PHY LUC. SVTH: TRAN TH] KIEUTONG QUAN TAI LIEU DANH MUC CHU VIET TAT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs. Cong se L. plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogesa and Sharpe Nm nanomet op Optical Density P-B Plackett-Burman Wo World Health Organization BSH Bile salt hydrolase eee SVTH: TRAN TH] KIEU ivTONG QUAN TAI LIEU DANH MUC HINH ANH Hinh 1.1 Streptococcus. Hin 1.2 Lactobacillus 6 Hinh 1.3 Lactobacillus plantarum dw6i kinh bién vi dign tit (Reichelt J., 2013) a 9 Hinh 1.6 Hép den trong hé thng didu khién mét qué trinh. 13 Hinh 1.8 Ma tran bé tri thi nghiém theo thiét ké Box — Behnken (Box va Behnken, 1960) Hinh 1.9 SVTH: TRAN THI KIEU vTONG QUAN TALLIEU DANH MUC BANG Bang 2.1. Cac ngudn nito khio sit.. Bang 2.2. Cc ngudn cachon khio sat. Bang 2.3, Cac nguén khong khio sit Bang 3.1: Gis tr] do ODgy va mat d@ té bao (Log(N/mL) Bang 3.2. Gia trj ODsi» theo théi gian... Bang 3.3. Mat d9 té bao Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL) tai mdi gid tri nhigt d9 va d9 pH khdo sat Bang 3.4, Gia tri log (N/ mL) cia cc ngudn nito khao sii Bang 3.5. Gid tr] log (N/ mL) cita céc ngudn cacbon khio sf Bang 3.6. Gia trj log (N/ mL) ciia cdc ngudn mudi khodng khio sit .. Bang 3.7. Mite anh huéng cia tirng yéu té... Bang 3.8: Két qua thé nghiém Plackett- Burman Bang 3.11 Két qua thi nghigm leo déc. Bang 3.12 Bang gid tri cdc bién sé thi nghigm Box-Behnken. Bang 3.13 Bang bién sé cdc gid tri thi nghi¢m Box-Behnken. Bang 3.14 Két qua gid trj tdi wu cita cdc yéu 6... Bang 3.15 Gid tr] OD theo thai gian SVTH: TRAN THI KIEU iTONG QUAN TAI LIEU DANH MUC DO TH] ‘DO thi 3.4. Két qua khio sat ngudn nite. DO thj 3.5. Két qua khao sat nguén Cachon. ‘Db thi 3.6. K& qua khao sat ngudn mudi khoang.. Dé thi 3.7. Dé thi céc anh hudng chinh (Main Effects Plot)... DO thi 3.1 Dé thi ring mire biéu dién méi quan hé giira mat 46 té bao voi Ss Bd thj 3.2 BS thj bé mit bidu didn méi quan hi gitra mit 49 t8 bdo véi cde 56 DO thi 3.9 Duvng cong ting truéng cia L. plantarum NT 1.5 theo thdi gian 58 ce e&p bién khée nhau. c§p bién khée nhau.. trén méi trudng téi wu ——————— ee SVTH: TRAN THI KIEU iiTONG QUAN TAI LIEU DAT VAN DE SVTH: TRAN TH] KIEU 1TONG QUAN TAL LIEU Cholesterol trong mau ting lam ting nguy cor bénh tim va dgt quy, mét phin ba bénh tim thiéu mau cyc bd 18 do cholesterol cao, Nhin chung, cholesterol ing wéc tinh gay ra 2.6 trigu ca tir vong (4.5% ctia tong s6) va 29,7 trigu ngudi ganh hau qua. Tong sé cholesterol trong mau cao la nguyén nhan chinh gay bénh tét 6 cd cic murée phat trién va dang phat trién nhw li mgt yéu t6 nguy co bénh tim thiéu mau cue b6 va dét quy (WHO, 2013). Vigc gidm cholesterol 1 van dé rat quan trong dé ngin ngira bénh tim mach (Lim va cs., 2004). M6t trong nhing tinh probiotic va vita c6 hoat tinh lam giam cholesterol 1 van dé thiét thu, duoc nhiéu ii php d6 la nghién ctu vi khuan lactic vira c6 hoat nha khoa hoe trén thé gidi quan tam va nghién ciru ‘Trong nhimg nim gin day c6 nhiéu nghién ctru chimg minh enzym thiy phan muéi mit (BSH) tir vi khudn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus...) 6 téc dung lam gidm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngoai ra, vi khuan lactic con c6 kha nang gidm cholesterol bang cach hap thu tryc tiép vao mang té bao (Ziamo, 2007). Ngiy nay viée san xuat thyc phim chite ning chia vi khuan probiotic nhw Lactobacilli cé tim quan trong _ngiy cing ting. Nhiing vi khuan nly c6 téc dung khdng khuin, lam ting gid trj cdm quan, dinh duéng va mang Iai Igi ich site khde cho ngudi tiéu ding (Shahravy, 2012). Vi khuin Lactobacillus plantarum NTLS da duge chimg minh c6 kha nang lam gidm cholesterol thong qua viéc hap thu cholesterol qua mang té bao va kha nang sinh enzym BSH déng théi cé hoat tinh probiotic nhu: kha nang chiu pH da day, khing muéi mft, khang khuan,... (Duong Nhat Linh, 2013). Vi vay Lactobacillus plantarum NTL.5 cé thé duge ting dung dé san xuat cdc ché phim probiotic cé hoat tinh [Am giam cholesterol. Ngay nay, nhu clu str dung thyc phim lén men két hgp véi ché phdm sinh hoc ngay cing ting. Dé dap img nhu cau nay, viéc san xuat lvong lon sinh khéi vi sinh vat dang duoc quan tim, Do dé, nghién ett phat trién moi truéng mudi cly moi dé ting ——————— SVTH: TRAN TH] KIEU 2TONG QUAN TAILIEU cung san xuat sinh khdi o6 thé (Shahravy, 2012). Vi vay ching t6i thue hién 48 ti “T6i uu héa moi trong nudi céy ching Lactobacillus plantarum NT1.5 bing phwong php quy hoach thye nghi¢m” én vige sin xuat probiotic c6 higu qua kinh té hon N6i dung thye hign: — Xay dung duge biéu dé thé hign méi tong quan giitta gid tri OD va néng do té bao tuong tg vii timg gid wi OD. — Xay dung dung cong tang truong cua chiing L. plantarum NTL.S, xac dinh thei gian tng tragmg téi wu cua vi khuan. — Khao sit nhiét 46, pH téi uu cho sy phat trién ciia ching L. plantarum NTIS — Chon Iya nguén cacbon, nito va cdc nguén khodng. —Xae dinh céc yéu 16 anh huong chinh dén qua tinh tang sinh khdi cua Lactobacillus plantarum NT1.5 bang thiét ké Plackett ~ Burman (P - B). — Xée dinh gid tri ti wu cita cdc thanh phan dinh dudng va didu kign nudi cdy bing phuong phap Box-Behnken. — Nudi cay thir nghiTONG QUAN TAILIEU, CHUONG 1: TONG QUAN TAI LIEU SVTH: TRAN TH] KIEU 4TONG QUAN TAL LIEU 11. TONG QUAN VE VIKHUAN LACTIC 11.1. Gidi thigu Vi khuan lactic acid (LAB) I nhém vi khuan pho bién trong ty nhién duge ting dung trong nhiéu nganh cong nghiép, 1a mot ché pham sinh hoc an toan cho con ngudi (David, 2013). Theo khéa phiin logi Bergey (2001), vi khuin lactic durge sip xép: Gidi: Bacteria Nganh: Firmicutes Lép: Bacilli B9: Lactobacillales Ho I: Lactobacillaceae Gidng I: Lactobacillus Gidng II: Pediococcus He I: Enterococceae Gidng: Enterococcus Ho III: Leuconoscaceae jéng: Leuconostoc Ho IV: Streptococcaceae Gidng I: Streptococcus Giéng II: Lactococcus Vi khuan lactic 1a nhiing vi khudn Gram duong, thurong khéng di déng, khong sinh bao tir, cde phan img catalase am, oxydase 4m, nitraveductase am. Nhing vi khuan nay c6 kha nang sinh téng hop nhiéu hop chat can cho su s6ng rat yeu, cho nén ching 1 nhimng vi sinh vat khuyét dudng di v6i nhiéu loai acid amin, nucleotic, nhidu loai vitamin... binh thudng ching khdng ¢6 cytochrome. Vi vay, ching durge xép vao nhém vi khudn ky khf tty nghi, hofe goi la vi hiéu khi, c6 kha nang lén men trong diéu kign vi hiéu khi ciing nhu ky khi. RAN THI KIEU 5TONG QUAN TAI LIEU LAB 6 lién két chit ché véi vi khudn cé Igi trén niém mac ruét cla ngudi va dGng vat. LAB bao gém khoding 20 chi trong dé chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus va Streptococcus 1a nhiing chi dign hinh (Marcel, 2005). Trong dé té bio cla ching c6 dang hinh c4u nhur Sirepiococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoac hinh que nhu Lactobacillus. Hinh 1.1 Streptococcus a: Streptococcus du6i kinh hién vi dign tir b: Streptococcus nhujm Gram Hinh 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus duéi KHYV dién tir b:Lactobacillus nhugm Gram SVTH: TRAN TH] KIEUTONG QUAN TAI LIEU Bifidobacteria cing duge xem 1 mét chi ciia lactic acid bacteria do c6 cling di diém tiéu biéu va cach thite én men dung. 1.1.2, Con dwing bién dudng cia vi khuan lactic Sur phan logi gitta cae chi cia vi khuén lactic dya trén hinh thai, cach thtte 1én men durong, su phat trién 6 mhimg nhiét dO khdc nhau, cau tric cia san pham acid &m (Mascel, 2005). LAB cé hai con duréng lén men durong chinh (Mascel, 2005): lactic, kha nang chju mudi, chiu acid hoje — Glycolysis (Embden- Meyerhof- Pamas pathway): san pham cudi cling 1a acid lactic hay cdn goi ld con dudng Ién men lactic déng hinh, = Con dung 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sain phdm cua qua trinh én men nay ngoai acid lactic con c6 ethanol, acetate va CO2 hay cdn goi la qué trinh 1én men dj hin. Dya vao kha ning Ién men duréng nguéi ta chia LAB thinh LAB déng hinh va LAB dj hinh, 1.1.2.1 Lén men dong hinh Vi khuan lactic Ian men dong hinh gan nhu chuyén h6a hoan ton dudng ching sir dung thamh acid lactic. Trong diéu kign thita glucose va oxy han ché lén men déng hinh 1 mol glucose theo con duréng chuyén héa EMB (Embden ~ Meyerhoff ~ Parnas) tgo 2 mol pyruvate. Sy cfin bing oxi héa khir trong té bao duge duy tri théng qua céc gua tinh oxi h6a cia NADH, song song dé la sy Khir pyruvat thanh acid lactic. Cée phan tg dién ra wong phin nén té bao cht. Cac enzym dae wrung trong qué trinh nay la aldolase va triozophosphateisomerase. Glucose khong phai la duéng duy nhat co thé duge sir dung. Voi hé théng enzym thich hgp, cac loai dung khée c6 thé duroe chuyén di thnh glucose hoe m6t trong nhiing chit trung gian trong qué trinh_nhwr glucose- 6-phosphate (hoic trong trurbng hop during pentose, ribulose-5-phosphate). Kha ning sit dung céc loai dung khée nhau & vi khuan lactic thay déi theo loai. Dai din cho SVTH: TRAN THI KIEU 7TONG QUAN TAI LIEU Kigu Ign men nay Ti cde giéng Lactococcus, Streptococcus,Petiococeus va ., 1989) Lactobacillus nhém I. (Desantis 1122 Lénmen dj hinh Lén men dj hinh sir dung con during pentose phosphate, céich goi Khdc 1a con dung phosphoketolase pentose. Mot phin ttr glucose-6-phosphate ban dau bi khir hydro thanh 6- phosphogloconate va sau dé khir nhém carboxyl hinh thanh mét phan tir CO}. K& qua Ia pentose -5- phosphate bj chia ra thinh m6t glyceraldehyde phosphate (GAP) va mot phan tir acetyl phosphate. GAP sau dé duge chuyén héa thinh lactate nhu trong lén men déng hinh, véi acetyl phosphate bj bién déi thanh ethanol qua chat tung gian 1a acetyl ~ CoA va acetaldehyde. Vé mat ly thuyét, san pham cudi cing (bao gom ATP) duge san xuat c6 sO lugng bang véi san pham tir qua trinh dj hoa mot phan tir glucose, Hai enzyme dic tnmg trong qué trinh nay ld transketolase xiic tac chuyén h6a nhém ketol-2C va transaldolase xiie tée chuyén héa nh6m 3C. Qué trinh nay xay ra trong cytosol. Cée LAB lén men dj hinh bit bude gdm Leuconostoc oenococeus, Weissella va Lactobacillus nhém II, (Desantis va cs., 1989) 1.1.3. Téng quan vé Lactobacillus plantarum 11.3.1. Phan logi Theo Bergey va cOng str, (1923) Lactobacillus plntarum duge phan loai: Giéi (Kingdom): bacteria Nginh (Division): Firmicutes Lép (Class): Bacilli B6 (Order): Lactobacillales Ho (Family): Lactobacillaceae Giéng (Genu: Loti: 1.1.3.2. Dic diém chung cita vi khudn Lactobacillus plantarum : Lactobacillus Plantarum Lactobacillus plantarum li mt trong hon 50 loai Lactobacillus. Lactobacillus plantarum 1a vi khudn gram duong, catalase m (Bujalence, 2006), hinh tre khong SVTH: TRAN TH] KIEU 8TONG QUAN TAI LIEU sinh bio tir duge tim thay trong hé ‘u héa cia ngwai va dong vat. Vi khuan ni 1009) mt loai vi Khudn c6 kha ning thich nghi cao, né 6 dau tién duge tim thay trong nude bot cia con ngubi. (Waugh Lactobacillus plantarum thé tén wi 6 pham vin (ét dO rOng Ibn (tir 1-60°C) (Natural New, 2010), ki khf ty nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarwn durge xép vao nhom vi khuan len men di ju mdi tnrong nhw thit, cA, . cde qué trinh 1én men thuc vt, thye vit va trong nhidu logi pho mat. (Kohajdovi, 2012). L plantarum ¢6 nhiéu diém khde bigt so v6i ede Lodi lactobacillus Khe 6 nhimg jém sau: - C6 bd gen tuong déi lon nén c6 thé thich Gng voi nhiéu digu kign khde nhau (Kleerebezem va cs., 2003) - C6 thé Jen men nhiéu loai duéng. -Thich nghi cao véi diéu kién acid, chju pH thip (Daeschel va Nes 1995). - C6 thé chuyén héa acid phenolic (Barthelmebs va cs., 2000; Barthelmebs va es., 2001), phan gidi mudi tanat nho hoat dOng cita enzyme tannase (Vaquero va cs., 2004). Hinh 1.3 Lactobacillus plantarum duwéi kinh hién vi dign tir (Reichelt J., 2013) 1.13.3. Loi ich ctia vi khudn L, plantarum Lactobacillus plantarum cé nhigu trong nude bot va dudng tiéu hoa ca con ngudi. N6 thudéng duge sit dung trong cde qué tinh Jen men thyc phim va lam probiotic. Cac ché pham sinh hoc sir dyng L. plantarum ngay cdng duge cong abjn én thj trong.TONG QUAN TAI LIEU L plantarum 6 thé nang cao tinh toan ven rudt, hoat dong trao déi chat ctia cdc 1 bao duéng rugt, kich thich phan tmg mién dich (Nissen va cs., 2009). Gidm thiéu mot sé wigu chimg réi loan tigu hoa khi diéu ui bing khéng sinh (Lonnermark vacs., 2009), Theo nghién ciru cua nhém Karlsson va cOng sy (2009) duge tién hanh & Thuy Din cho thay uéng tryc tigp ZL. plantarum cé thé ting tinh da dang cita hé vi sinh vat & rudt két. Bao vé té bao bidu m6 khoi sy giy hai cita E. coli bing each thay Adi hinh théi 8 bao chi, gim hinh thanh tén thuong, tang site dé khdng va kha ning thm théu don J6p phn ur Qin va cs., 2009). 12. TINH HINH NGHIEN CUU TRONG VA NGOAL NUGC VE LACTOBACILLUS Cée nghién ciru vé vi khuan lactic di va dang duge trién khai rng rai trén to’n thé gidi, trong d6 da cd rdt nhiéu cng trinh nghién cima vé Lactobacillus. Tuy nhién & Vigt Nam, sé lugng cac nghién cia vé vi khudn lactic cdn qué khiém tén va 6 rat ft cOng tinh nghién ctu vé ti wu hoa moi trudng nudi cly Lactobacillus. Phin 16n cdc nghién city vé Lactobacillus 6 tong muéc chi 1a nghién ciru co ban vé nhom vi khuan nay nhu mite phan lap va dinh danh, tuyén chon gidng cé hoat tinh tét dé lam probiotic 1.2.1, Cée nghién ciru trén thé gigi Nam 2012, Hu va cOng sur di céng bé nghién citu vé 161 wu héa méi trudng nudi cy Lactobacillus plantarum YSQ khi sit dung céc san phim nong nghigp c6 gid thanh thap nhu bot dau nanh, bét ng6, lita mi va nuée ép ca chua lam nguén dinh dudng, tir 46 [dm gidm gid thanh san phim khi lén men theo quy m6 lén, Nam 2010, Magdalena va céng sir da cing bé nghién cttu vé tdi wu héa cae yéu 16 dinh duéng nh nguén cacbon, nito, mudi khodng va cdc yéu t6 ting truéng (vitamin B, axit amin) khi ding phwong phap bé mit dap tng dé ting sinh khéi vi khuan Lactobacillus rhamnosus PEN. SVTH: TRAN TH] KIEU 10TONG QUAN TAI LIEU ‘Nam 2006, Altaf va cng sy di t6i uu héa méi truéng thu acid lactic cho ching Lactobacillus amylophilus GV6 bét bap, bot 1g ech sir dung ede nguén cacbon, nito ré tién nhu: jiu lang do thay thé cho pepton, glucose trong méi trudng MRS bang phwong phap Plackett-Burman va dip tmg bé mat (RSM). Két qua cho thay Lactobacillus amylophilus GV6 dat duge higu sudt 78,4% va nang suat 96% (g acid lactic/ g tinh bot durge sir dung). Farooq va céng sur (2012) da sir dung mit ri during (phy phim ca qué trinh san uu thu sinh khdi cia vi khudi xuit duéng mia) Kim ngudn cacbon trong méi traéng Lactobacillus delbrueckii. ‘Nam 1995, Oh va cong su da cdng bé nghién citu vé cac gid wi tdi uu cua trypton, cao nam men, glucose, nhiét 46 nudi cay cho sy tang truong cula Lactobacillus casei YIT 9018. Két qua gid tr) t6i um cia cde yéu t6 anh hung dén sir phat trién cia L.casei YIT 9018 nhw sau: trypton, 3,04%; cao nm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhigt 45 nudi cdy 1 35°C. Nam 2006, Zhong da céng bé nghién cir vé Lactobacillus casei LC2W bang phuong phip bé m§t dap img dé tang cudng san xudt i wu hoa méi trudng nudi exopolysaccharid. Két qua toi uu cac diéu kién nudi cay dé san xudt exopolysaccharid: mhiét d6 nudi cay 12. Nam 1996, Nguyén Ding Digp va cdng sy di céng bé nghién cima v8 méi trong 32,5°C va théi gian nudi 1a 26 gid. Cée nghién etru trong nuée nui vi khudn lactic tét nhdt, Méi trrong dé la sita gdy hoan nguyén voi théi gian lén men tot nhat la 18-20 gid, bd sung gidng 2-3%. ‘Trong cdng bé nghién ctru cia Nguyén Thi Hong Ha va cong su nam 2003 da sir dung hai chiing Bifidobacteria bifidum va Lactobacillus acidophilus d8 sin xuat ché phim probiotic. Tim ra duc ba mdi tnrdng thich hop nudi cy vi khudn Bifidobacteria bifidum 1a méi trong thyoglycolat, mdi trréng nude chiét gan, méi trudng nude chiét thit bd 6 digu kign nudi cdy ky khi, Méi trréng thich hgp cho L. acidophilus 18 moi SVTH: TRAN TH] KIEU uTONG QUAN TAI LIEU truéng MRS, moi trong nutéc chiét ci chua, méi tring nude chiét gid, méi tnrng nue t Cong ty sita Vinamilk. 13. | QUYHOACH THUC NGHIEM Quy hoach thuc nghiém 1a dang nghién ciru vé méi quan hé nguyén nhan — két )) can va 06 thé qua. Trude hét, nha nghién ciru can xc dinh ede thong sé (hay cde quan tim ri dua ra cae chién thuat lam thue nghiém tir giai doan dau dén giai doan két thie cita qué tinh nghién ciru d4i twong (tir nhdn théng tin md phéng dén vige tao ra mé hinh toan, xée dinh céc diéu kign t6i uu), trong diéu kign da bode chua hiéu biét day di v8 co ché cia déi tong. (Nguyén Van Dy va cs., 2011). 1.3.1. Phuong php quy hogch thyc nghiém Quy hoach thye nghiém 14 co sé phuong phdp Iudn cia nghién cizu thye nghiém hign dai. B6 la phuong phap nghién ctu moi, trong 6 céng cu toan hoc gidt vai trd tich cue. Cor s6 todin hge nén ting cia 1¥ thuyét qui hoach thye nghiém 1a todn hoc xde suat théng ké véi hai inh vye quan trong 1a phan tich phuong sai va phan tich héi qui (Giang Thj Kim Lién, 2009). 13.1.1, Khdi nigm Quy hoach thyc aghiém 12 t4p hgp cdc tac déng nhim dua ra chién thuat 1am thyc nghiém ti giai doan dau dén giai doan két thiic cla qua tinh nghién ctu déi tugng (tir nhn théng tin mé phéng dén vigc tao ra mé hinh toan, xc dinh céc digu kign ti mu), trong diéu kign d3 hoje chira hiéu bidt diy dit vé cor ché cita d4i tromg (Giang Thi Kim Lién, 2009). 1.3.1.2, Déi tucong chua biét La mét qué tinh hodc hign wong nao dé cé nhing tinh cl can nghién ctru. Nguoi nghién citu c6 thé chura hiéu biét day di vé déi trong, nhung da 6 mot sé théng tin tién nghigm di chi [2 su ligt ké sor Luge nhitng thong tin bién déi, anh huéng dén tinh cl rng. Cé thé hinh dung ching nhu mét “hép den” trong hé théng digu khién gém cc tin higu du vao va dau ra Giang Thi Kim Lién, 2009). SVTH: TRAN TH] KIEU 2TONG QUAN TAI LIEU “WORDEN (QUA TRINIL z Lauvigccua F—> ¥ HE THONG) - TT Hinh 1.6 H6p den trong hé théng digu khién m@t qua trinh. Céc tin hiéu dau vao duge chia thanh ba nh6m: (Giang Thj Kim Lién, 2009) 1) C&e bién kiém tra duge va diéu khién duge, ma ngudi nghién ciru c6 thé DOL TUONG NGHIENCUU Y r digu chinh theo dy dinh, biéu dién bing vecto: 2Z=[Zl, Z2,...., Zk] 2) Cac bién kiém tra durgc nhung khéng diéu khién duge, biéu dién bang vecto: T=[TI, T2, ..., Th) 3) Cc bién khong kiém tra durge va khong diéu khién duge, biéu dign bing veeto: E1, E2, Ef] Cac tin higu diu ra ding dé danh gid déi tuyng fa vecto Y = (yl, y2,... ya). Ching thuéng duoc goi la ede ham myc tigu. Biéu dign hinh hoc cia ham myc tiéa durge goi li mit dap tmg (bs mat biéu din). Phuong phip todn hac trong xir ly s6 liga tir ké hoach thy nghiém 1a phurong phap théng ké. Vi vay cdc mé hinh biéu dién ham mye tigu chinh 1a cdc mé hinh théng ké thye nghigm. Céc mé hinh nay nhan duge khi 66 cong tinh nhiéu ngdu ohién. 1.3.1.3. Ui diém vé quy hoach thye nghiém Quy hoach thyc nghiém dong vai tro quan trong trong khoa hoc ky thuat. Cac mo hinh ly thuyét, gidi thudt, qué trinh méi ludn duye kiém nghiém thye trade khi dem ra SVTH: TRAN TH] KIEU 13TONG QUAN TAI LIEU ing dyng. Hon nifa, quy hogch thye nghigm con cé ¥ nghia bé sung, hoan chinh cdc {a duge phat trién (Giang Thi Kim Lién, 2009). C6 thé néi, 1 thuyét quy hogch thye nghiém tir khi ra dei d@ thu hit sy quan tam két qua nghién citu sng tao ly thy va nhan dugc nhiéu dong gép hoan thién cua cdc nha khoa hoc. Nhiing uu diém ro rét ciia phuong phap nay so voi cdc thye nghiém cé dién 1a: (Giang Thi Kim Lién, 2009) - Giam dang ké sé lurgng thi nghiém can thiét. = Ham lung théng tin nhiéu hon 16 rét, ahd danh gid duge vai t qua lai gitia cde yéu t6 va anh huéng cia ching dén ham myc tigu, Nhin durge mé hinh toan hoc théng ké thyc nghiém theo cdc tiéu chudn thing ké, danh gid duge sai sé cua qué tinh thyc nghiém theo cac tiéu chuan thong ké cho phép xét anh hung cita cdc yéu t voi mite dé tin cay can thiét. - Cho phép xée dinh duge dieu kién t6i uu da yéu té cia déi tung nghién ct mét cach kha chinh xée bing ede cng cy todn hoc, thay cho cdch giai gn ding, tim ti uu cye bé nhu cae thye nghiém thy dong. 1.3.2, Thi nghigmsang loc ‘Thi nghiém sang lgc 1a thi nghiém duge tién hanh nhim cdc muc dich sau: Xe dinh dau la yéu t6 anh hung chinh dén déi tuong hay qué trinh cn kho sat. Ding gid mite d9 dinh huang cia cée yéu té. Danh gid mire dé anh hudng tuong tic gitta cde ydu t6. ‘Thi nghiém sing loc thing Khai théc céc dang thf nghiém toan phan 2 mite khi sé yéu t6 th aghiém khong lon hoc thiét ké thi nghiém riéng phin hay thiét ké tht nghiém Plackett — Burman (P-B). 13.2.1. So luoc vé thét ké thi nghiém tim cdc yéu t6 anh hiong cia Plackett- Burman + Mue dich cita thiét ké Xac dinh cac “yéu t6 quan trong” anh huéng dén qué trinh myc tiéu. » Dac diém cia thiétké SVTH: TRAN TH] KIEU 14TONG QUAN TAI LIEU Bat ngudn tir ma trin day dui (full - factorial matrices), sir dung gid dinh ring tat ca cdc tuong tac khéng 6 dau higu lién quan dang ké so vé cde yéu td chin, thiét ké Plackett — Burman dy trén ma tran hai cp cho méi yéu té va sira déi né 48 giam that bai (Plackett va Burman, 1946) ‘yéu 16 tac dong chfnh tong thié ké Plackett - Burman thay thé tt ca cdc wrong tic cita mot ma tran diy du. Tuy nhién, digu nay khOng cd nghia la thong tin vé sur turong tac khong thé duge xac dinh tir thiét ké Plackett-Burman (Plackett va Burman, 1946). Voi mét thiét ké Plackett - Burman gdm n thi nghiém (véi n 1a bg s6 cua 4, n< 100, ngoai trirn = 92 a chura thé xc dinh) vi sé yéu tk <(n - 1) Nhu vay thiét ké Plackett — Burman 12 thiét ké tiét kigm thoi gian va s6 tht nghiém nhat véi so yéu t6 can khdo sat 1a cao nhat. Thiet ké Plackett — Burman 1a mét thiét ké khong thé thiéu khi d6i tuong dang nghién ciru chu c6 nhidu thong tin vé cde yéu t6 c6 kha nang anh huéng chinh da duge khdo sit (Plackett va Burman, 1946). Vige chon ede ma trin ma s8 phy thuge vio sé yéu té thi nghiém trén céng véi cae phuong phip lya chon dé xac dinh sai sé thi ngl C6 nhigu cach dé xc dinh sai sé thf nghiém nhu (Plackett va Burman, 1946): - Chon diém trung tam va cho mot sé thi nghiém tai diém dé. ~ Lap lai toan b6 ma tran thi nghiém. - Thy hign nhiéu phép do dgc lap trong 16 hop. > Phan tich két qua thi nghigm Sau khi thir nghigm duge tién hanh, dit ligu ti thi nghigm duge sir dung dé tinh todn céc higu tmg va dé Burman, 1946). ¢ dinh ¥ nghia théng ké cita nhig higu tmg (Plackett va Dé tinh todn cic higu tmg, nhap cdc gid tri trang binh vao ma tran. Sau do, so sinh sir khic bigt gitta cic dip img trung binh & mife cao va dip img trung binh & mite thdp. Cac anh hudng ciia yéu té ludn ludn thay déi trong cdc phan ting khi di tir cip dOTONG QUAN TAI LIEU Xae dinh durge mite 46 dé (Plackett va Burman, 1946): Ap céc yéu té phu thugc vio muc tiéu thir nghiém ich 1a dé ti da hoa mét phan img, tit ca cae yéu td €6 tac dOng tich &t lap dé hoat dong & mire dé cao va tit ca cae yéu t6 c6 tac dong tiéu cure sé dugc thiét lap dé hoat dong 6 mite thap. Néu muc tigu la d@ gidm thiéu céc phan tng, tit ca céc yéu té 06 tac dng tich cue s@ duoc thiét lip 6 mtic thip va tat ca déucé mét tic dng tigu cyc sé duge thiét ip & mite cao, Néu nhu anh huéng cia céc yéu té duye kiém tra cd ¥ nghia théng ké thi yéu 6 d6 1a 1 yéu t6 quan trong. 13.3, Thi nghiém téi wu héa Mét trong nhimg myc dich chinh cia nghién citu thyc nghiém trong ki thugt Ia tim gid trj eye tr] hay tim viing tdi un cho mot qua trinh hay cde digu kign tdi wu dé van hang mét hé théng. Lép ede bai todn nghién ctru thye nghigm vé vin dé ti wu thudng duge biét dén vdi tén goi “phwong phap bé mat chi tiéu” (Response Surface Method — 2011): kign van hanh, thyc thi) sao cho tao ra RSM) nham muc dich (Nguyén Vin Dy va cs Chi ra tap gid tri céc bién dau vao ( img xit cita d6i tung nghién cttw Ha t6t nhat. Tim kiém cc gid tri bién dau vao nhim dat durge céc yéu cu cu thé vé img xir cia déi tugng nghién ctru. ‘Xac dinh cdc diéu kign van hinh méi nhim dam bao c ign chat lugng hoat d6ng cia déi trong so véi tinh wang ci. MG hinh héa quan hé gitta d6i tuong dau vio va img xit cia déi tong nghién ciru, ding kim co sé dy doan hay diéu khién qué trinh hay hé thong. ‘Tién trinh ti wu héa RSM thuéng gdm 3 giai doan: Giai dogn : Thi nghigm khéi dau. Giai doan 2: Leo dé tim ving cue ti. Giai doan 3: Thf nghiém bé mat chi tiéu. SVTH: TRAN TH] KIEU 16TONG QUAN TAI LIEU 13.3.1. Thi nghiém khoi déu Sau khi tién hanh c: thy nghigm sing lgc, ta cin loai bd bot a © anh véi hung khng ding ké dén him myc tidu. Tigp tue tién hanh mot sé thi ng bien dn lai, dng thoi bd sung thém mot sé diém thf nghiém tung tm nhdm danh gid mite d9 phir hgp (Lack-of-fit) cia m6 hinh hdi quy bac nhdt da xay dung cho ham myc tiéu, Vige dinh gia nhu vay duge goi la “kiém dinh mite 46 khong phi hgp cia md hinh”, Gia thuyét théng ké duge phat biéu nhur sau Gia thuyét dao: M6 hinh khép véi dir ligu. Gia thuyét chfnh: M6 hinh khdng khép véi dit ligu. Dé kiém dinh vé nhin 3 mite gid wi, mic d6 phi hyp ca m6 hinh méi bién wong mét ké hoach edn Ciing nhwr cdc phép kiém dinh théng ké khée théng sé quan trong dé chp nhan hay logi bo gia thuyét dao IA gid tri p (p-value). LY thuyét tinh todn théng ké chi ra nhur sau: Néu gid tri p nho hon mite ¥ nghia a, ta loai bé gid thuyét dio. Nghia 1d m6 hinh xay dung khong khép véi dit ligu. Néu gid tj p lon hon mic ¥ nghia a, md hinh da dmg 12 ph hgp dé md ta de ligu. 1.3.3.2. Leo doc tim ving cue tri Néu két qua thi nghiém khoi dau cho thiy o6 thé m6 ta him mye tigu bing mot ham hdi quy bac nhat, digu dé chimg t6 ving thf nghigm cita ta cdn 6 xa ving chira cue tri. (Nguyén Van Dy va es., 2011). Dé tim duge ving chita cue thay d6i gid ri cdc bién thi nghigm va thyc hign mot chudi cdc thi nghiém lién tiép img voi cdc gid tri méi cia bién thi nghiém dé theo dai su thay ddi ciia ham myc tiéu, Céc thi nghiém ny goi 1a céc thé nghiém leo dée/ xudng déc Bé tién nhanh dén ving chita cy tri cua ham muc tiéu, ta cin xée dinh ding chinh gid tri céc buée thi nghiém. RAN TH] KIEU 17TONG QUAN TALLIEU Cac bute xac dinh cdc thong sé leo déc: Bube 1: Chon trade mot gid tj ia sO cho m@t bién thf nghigm x; nio dé. Thong thudng ta chon bién dé digu khién nhat hode bién img voi hé s6 hdi quy c6 gid wi tuyét doi 16n nhat Butée 2: Xéc dinh gia s5 cdc bién cin lai theo cng thite: BA, = Pos acre Trong dé: 8, — bude chuyén déng duge chon cia yéu t6 1 §, — bude chuyén dng cita yéu td j b,,b; — nig hé s6 hdi quy ca cae yéu t6 tong img Ay, A, —khoang bién thin cita cic yéu té tuong img Bute 3: Tién hanh thi nghiém. Co thé tién hanh cdc thi nghiém don hodc lp dé giam sai sé, theo doi két qua thay doi cua ham muc tiéu. Gia tri ham muc tigu sé thé hién su cai thién (tang khi leo déc, giam khi xuéng déc). Tién hanh cdc thi nghiém cho dén khi ham muc tiéu déi chiéu 13.3.3. Thi nghiém bé mat dap ting Khi can mé ta chinh xdc quan hé gitta him muc tiéu va cdc bién thi nghiém, ta tién hanh ké hoach thf nghi¢m bé mat chi tigu. Muc dich ciia ké hoach nay 1a b6 sung cdc diém thf nghiém nhim co thé xay dyng mo hinh bac 2 mo ta ham muc tigu. (Nguyén Van Dy vacs., 2011) M6 hinh bgc hai c6 dang: inadiepern ae Ein Bed o a a Voi: YY: Ham muc tigu Bo: HG sé hdi quy SVTH: TRAN THI KIEU 18TONG QUAN TAI LIEU B: Hé sé héi quy bac 1 mé ta anh huréng ctia yéu td X; déi voi Y Bz HG 86 quy Bj: He sé hdi quy tong tac mo ta anh hung ding thoi hai nhan t6 X; va Xj déi voi Y. * Cac bude tién hanh: 2.mé ta anh hudng cia yu t6 X, d6i voi Y + Xay dymg ké hogch thi nghiém. ~ Tién hanh cic thi nghigm va thu th4p két qua. Phan tich s6 ligu thf nghiém; xy dung mé6 hinh hdi quy. - Xacdinh digu kién t6i uu héa. - Thye hign céc thi nghiém kiém dinh. C6 hai dang ké hoach thi nghiém bé mit chi tigu: thiét ke dang hon hgp tam xoay (CCD — Central Composite Design) va thiét ké Box — Behnken (Box — Behnken Design). + Thi Box-Behnken ‘Thiét ké Box-Behnken dure hai téc gia Box va Behnken dé xudt nim 1960 véi mue dich thiét ké 6 tinh chat tam xoay hoac gan nhur c6 tim xoay. (Nguyén Van Dy va cs., 2011) thf nghigm 3 mite nhim xay dyng bé mat chi teu. Thiét ké nay S6 thi nghigm duge tinh theo cing thite: (Giang Thi Kim Lién., 2009) N=2%42k+ng Trong dé; —_N: 36 thi nghiém. k: s6 yéu té thf nghigém. n: 6 thf nghiém tai tam. SVTH: TRAN TH] KIEU 0TONG QUAN TAI LIEU feed i 8 aden Matic ao (tag orn Hinh 1.8 Ma tran bé tri thi nghigm theo thiét ké Box — Behnken (Box va Behnken, 1960) ‘Thiét ké Box-Behnken cé nhimg wu diém: - S6 lan thi nghiém cho méi lan lap it. - Khong 6 diém thi nghiém nao vuot ra ngoai khoang gitia 2 mite da thiét lap cho méi bién. 1.4. PHAN MEM QUY HOACH THY NGHIEM MINITAB 16.2.0 Cée két qua nghién citu cn duge phin tich va xir li dé théng qua d6, chi ra cdc ¥ ngliia cia bang ké qua. Voi sy ug gidp cla may tinh va céc phan mém chuyén dung, thiét ké thi nghiém va xir Ii sé gu thyc nghiém da tré nén nhe nhang va don gian hon rat nhiéu (Nguyén Van Du va es., 2011). Minitab 1a mt phin mém may tinh gidp ta hiéu biét thém vé théng ké va tidt kiém thoi gian tinh ton. SVTH: TRAN TH] KIEUTONG QUAN TAL LIEU Phin mém niy ban dau duge thiét ké dé phuc vy gidng day mén théng ké, sau dé 43 duge phat uién thanh cong cy phan tfch va winh bay dir ligu rit higu qua. Giao dién cla Minitab 6 dang dé hga, véi cdc menu va hOp thoai rat don gin va 8 ding, van hanh nhu mot hop den, nhan dit ligu dau vio va phan tich, xir ly theo yéu cu ciia ngudi sit dung sau dé hién thi két qua théng qua cdc cdc cita s6 (Nguyén Van Dy vacs., 2011) — Dit ligu nhap vao cé thé duge nhfn théng qua nh§p ligu truc tiép vio cdc cita s5 bang tinh hoac lay file dé ligu cua Minitab hoae wr cac img dung bang tinh khée nhur Excel hay Lotus théng qua chuic ning sao chép ~ din, Ngoii ra Minitab cing nhan nhap ligu tit Session Window thong qua cdc ng6n ngit nhap Iénh cua Minitab. — Két qua sé 1a cac két qua bang s6, chir va hinh anh d6 thi thong qua cic cira sd Minitab. = Cae 8 thi m6 ta théng ké ctia Minitab cé hinh thtte tinh bay rit rd rang, c6 thé 8 dang higu chinh theo ¥ muén, Cac dé thi nay ciing 6 thé két xudt ra nhiéu dang anh higu chinh duge.. SVTH: TRAN TH] KIEU aTONG QUAN TAI LIEU le Edit Dato Calc Stat Editor Tools Window Help Assistant Bob eta Hinh 1.9 Giao dign phin mém Minitab 16.2.0 SVTH: TRAN TH] KIEU 2VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU CHUONG ?: VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU SVTH: TRAN TH] KIEU 23VAT LIEU VA PHUONG PHAP 2.1. | THOIGIAN VA DJA DIEM NGIEN CU'U - Thoi gian: Ti thang 11/2013 dén thang 5/2014 - Dia did phé H6 Chi Minh. 2.2. VAT LIEU NGHIEN CUU 2.2.1. Déitwong nghién cia Phong thi nghiém Cong Nghé Vi Sinh-Trng Dai hoc Mo Thanh Ching vi khuin Lactobacillus plantarum NTIS duge cung cp tir Phong thi nghigm Cong ngh¢ Vi sinh“Tnong Dai Hoc Mo Tp Hé Chi Minh di duge ching minh 6 kha nang kim gi cholesterol va kha nang lam probiotic (Duong Nhat Linh va cs., 2013) 2.2.2, Méitrurng—héa chit —MGi trudng MRS (Deman, Rogosa and Sharpe), ~ Méi trréng MRSA. ~ Cdn 96°, cén 70°, H2SO4, NaOH, HCl. — Cée logi dung: glucose, sucrose, maltose, mat ri dung, xylose, manitol. —Cao ndm men, pepton, bgt dau nanh, b9t bap, amonium sulfate ((NH,)2SO,), uré (H,NCONH;) —Cée mudi khodng: NaCl, K;HPO,.3H;0, KH,SO, MgSO,.7H,0, CaCl, MnS0O,.4H30, CaCOs, — Nuwe ct, mre mudi sinh 1y 0.85 %. 22.3, Dung ey Dia petri, dng nghiém, erlen, becher, pipette, pipettman, diu tip cdc loai, , que cdy, lam, lamer, dén cén, kinh hién vi, gidy do pH. 2.2.4, Trang thiét bi -Tacay - Kinh hién vi - Tuam CO: ~ Can ky thuat = Cin phan tich SVTH: TRAN TH] KIEU 24VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU - Ti say - May do pH. ~ Ld viba ~ May do mat d6 quang 23. PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.3.1, Hoat héa ching ‘Tur Gng gitt chung 20% glycerol/ -20°C, tién hanh hoat hoa chung Lactobacillus plantarum NTIS trén SmL méi truéng MRS (DeMan Rogosa and Sharpe) i 6 37°C / 24-48 gir ‘Tir dng méi trudng long di hoat héa 24-48 gid chting t6i tién hanh edy ria trén méi trudng MRSA (DeMan Rogosa and Sharpe agar), ti 6 37°C, 5%CO>, 48 gids Sau 48 gid chon nhiing khudn lac rigng le, dién hinh cdy uén méi uudng thach dtmg MRSA giit ching cho cae thi nghigm tiép theo. 23.2. Xay dung biéu dé twong quan gitra gid tri OD va ndng d6 té bao. 2.3.2.1. Dinh long 1é bao bang phuong phip do OD Nguyén tic Khi mét pha léng c6 nhiéu phan tir khéng tan thi sé hinh thanh mét hé huyén phd. va c6 d duc béi cde phin tr hign dign trong mOi trudng 1éng lam can énh sang, Ham phan tan chum dnh sing tdi. Té bao vi sinh vat 1a mt thyc thé nén khi hign dign trong méi trudng cing lim méi trudng tro nén duc. D6 due ctia huyén phir ty 16 vei mat dé 16 bao. Trong mot gidi han ciia dO dyc va mat d6 t€ bao, c6 thé xéc Hip durge quan hé ty 18 tuyén tinh gidia mat d@ 18 bao va dé duc. Do dé, ¢6 thé dinh Iugng mat d6 té bao mgt cach gidn tiép thong qua do d6 duc bang cach so mau 6 cdc bude séng tir 550 — 610 nm (Tran Linh Thwéc va cs., 2001). ‘Thye hign Tién hinh pha loaing huyén dich vi khuan bing méi truéng MRS sao cho thu durge cfc huyén dich c6 + Thy hign dinh Iwong té bao bang phuong phap dém s Ing Khun Igo. + Céie gid tri Ogio twong ing duge pha lodng va trai trén dia mdi truong MRSA 6 cae néng do dém duge.& bao tuong ting véi cdc + Xay dyng dudng tuong quan gitta ODsio va mat huyén phi bang phan mém Excel cia Microsoft. 23.2.2. Dinh heong té bao bing phuong phap dém khudn lac Phuong phip dinh lugng té bao bang cach dém khuan lac duge tién hanh véi cdc buse sau: (Tran Linh Thuée va es., 2001) * Tai cdc néng 46 OD tén hanh pha loaing bic 10 nhu: 10°, 107, 10%, 10%, 10 + Trai 0,1 mL huyén phi sau pha loding Ién dia méi trrdng MRSA, mai néng dd pha loang tai 3 dia, 2 U3T'C/S% CO2 + Nhan dign khu: Lactobacillus plantarum NT 1.5 tai méi 46 pha loding: chon d6 pha loding cé sé khuan 24 -48 gid. lac dic trmg va dém sé khuan lac cla ching vi khuan Jac phan bé hop ly nhét va trong khoang 25 — 250 khuan Igc/ dia, dém sé Khun lac trén ci 3 dia lap lai trén cling d6 pha loang. Tinh sé lugng té bao cé wong 1 mL mau theo cong thitc s N 4 = Savi Trong dé: A: Mat dg 1é bao (CFU/ mL) N: Tong s6 khuan lac dém duge nj: S6 dia dure dém & ndng 46 pha lofing i V: Sé mL dich miu cdy vao méi dia. f; néng dé pha loding cé s6 khuan lac durge chon dém. 2.3.3, Xdy dung duiing cong ting trudng cia L. plantarum NT 1.5 2.3.3.1. Nguyen ide Su ting truong ciia vi sinh vat 1A su gia ting sd luong té bao vi sinh vat trong quan thé va téc 49 ting trudng [a sy ting tridng cia vi sinh vat trong mét don vi thé SVTH: TRAN THI KIEU 26AT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU gian. Mét quan thé i sinh vat thudng c6 nhig dic trung tang truéng rigng khi duge nui ‘Ay trong mt méi truéng va diéu kign nhat dinh. Dong th Sau dé, sy tang trudng bat dau va s6 lugng té bao tang lity tién, giai doan nay goi 1a 1g tudng cila vi sinh vat bat dau tir mot pha tiém tang (lag phase). pha log (log phase). Theo théi gian, ngudn dinh dudng trong méi truéng tra nén can kigt cing v6i sy tich Iiy cita déc chat. Sy ting truéng dimg lai va di vio pha dn dinh (stationary phase). Néu tiép tye nudi cAy, ede t8 bio bit dau chét va di vao pha suy tan (death phase). MGi logi vi khuan lai c6 dung cong ting trrdng riéng, do ¢6 can phai Khao sit duéng cong ting trudng cia chiing vi Khun dang quan tam dé xéc dinh duge théi gian thu nhan san phdm thch hgp (Nguyén Thanh Dat, 2011), 2.3.3.2. Thye hign =Diéu chinh dich khuin di hoat hod dat gid tri ODsi tuong duong 10° té bao/mL, sau dé hut 2 mL dich khuin cho vio erlen chtta 18 mL mdi trréng MRS. Nuéi dich khuin 6 37°C/5% CO». — Theo doi sw tang trrdng cia vi sinh vat & cae méc 0 gid, 3 gid, 6 gid, 9 gid, 12 gid, 15 gid, 18 gid, 21 gid, 24 gid, 27 gid, 30 gid, 33 gid, 36 Bid, 39 gid, 42 gid, 48 gir bang cich do ODgio dé x4c dinh mit dé té bao sau mdi thai gian nudi edy. — Sir dung duréng tirong quan gitta mat d6 té bio va ODsio dé xdc dinh mat 46 t8 bao tai cdc gid tri ODsio trong img tai mdi thi diém khio sat. —Dya vao nhiing méc thoi gian va mat d6 té bao, xay dung dudng cong tang trudng cia vi sinh vat bang phan mém Excel ciia Microsoft. 23.4, Khdo sit nhiét 6, pH thich hop cho sy tang truéng cia L. plantarum NTLS + Mue dich Xée dinh duoc nhiét dO va pH thich hop thu duge nhiéu sinh khéi vi khuin hit. + Nguyén tie RAN TH] KIEU 27VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU Hoat déng trao dai chat cia vi sinh vat Ia két qua ciia cc phan img héa hoc. Céc sic 49 anh hudng s phan img nay phy thuge chat ché vao nhigt d6, do a6 yéu t6 ni inh vét. Viing sinh trudng cita vi sinh vat qua trinh sinh trang va phat tién cia vi ig nay khée nhau gid 1a ving gidi han gitta nhigt d cye dai va nhigt d9 cye tiéu ma vi cae loa pH la dai Iuong ding dé do 46 hoat tinh cua ion H” trong moi trudng. pH anh hung dén hogt dng cia vi sinh vat Ia do sy tic dong qua lai gitta ion H* va cae enzyme chita trong thinh té bao va mang té bao chat, Mdi loai vi sinh vat chi thich hop sOng trong khong pH nhat dinh. (Nguyén Lan Diing va cng sy, 2000) Tién hinh Bidu chinh dich khudn da hoat hod dat gid tri OD trong duong 10° té bao/mL, sau 46 hit 1 mL dich khuan vao 9 mL méi trong MRS duge diéu chinh & cde gid tri pH lin lugt nhu sau: 4, 5, 6, 7, 8 (Bevilacqua va cs., 2008). Nusi 6 cae nhiét do: 30°C, 37°C, 40°C. Mi thi nghigm lap Iai 3 lan. Sau théi gian mudi cay, dich khudn dugc do ODgio va dya vao dudng tuong quan dé xac dinh mit dé 18 bao. « Két qua > $6 ligu duge xir ly théng ké ANOVA bing phin mai Statgraphics Plus 3.0 va Excel eita Microsoft > K& qua duge trinh bay duréi dang: trung binh + sai sé chuan, 2.3.5. Sing loc cae yéu 15 dinh dudng 2.3.5.1. Nguén nito Cae nguén nite duge Khao sat la: bot bap, bot dau nah, pepton, (NH4)2SOs, uré v6i ndng d6 khao sét duge thé hign trong bing 2.1. (Han va es., 2011; Altaf va cs., 2006) Bang 2.1. Cac ngudn nito khio sat eee SVTH: TRAN TH] KIEU 28VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU ‘Thanh phan Nong d@ (g/L) Pepton 10 Bot bap 15 Bot dju nanh 8 (NH4):SO. 5 H,NCONH, 3 MGi trudng chon Igc nguén Nite t6i wu gdm 66 nguén nito can khao sat, glucose 20 g/L va cde thanh phin con Iai cia moi trudng MRS nhu: tween 80, K:HPO,, CH;CO2Na, MgSO,.7H20, MnSOj.H:0. 2.3.5.2. Neuén cachon Cée nguén cacbon durge khéo sat 1a: sucrose, maltose, lactose, glucose, mat ri duréng, b6t bap véi khéi lrgng khao sat duge trinh bay trong bang 2.2. (Altaf va cs., 2006; Faroog va cs., 2012; Han va cs., 2011; Magdalena va cs., 2010) Bang 2.2. Cac ngudn cacbon khio sit "Thanh phn Khoilugng (g/L) BOt bip 30 Glucose 20 Maltose 20 Succrose 20 Mit ri duing 40 Lactose 20 MGi trréng chon Igc ngudn cacbon téi wu gdm 6 ngudn nite toi uu, nguén cacbon cin khao sat va cdc thanh phin cdn lai cla moi tudng MRS: tween 80, MgSO,, KzHPOs, CHsCOONa, MnSOj, 2.3.5.3. Ngudn khodng ——— SVTH: TRAN TH] KIEU 29VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU Khio sét céc nguén khong: CaCl, NaCl, CaCO;, MgSO,.7H,0, K,HPO4, KH,PO, voi knéi lugng duge winh bay wong bang 2.3.(Han va cs., 2011; Altaf va cs., 2006) Bang 2.3. Cac nguon khodng khao sit Thanh phan Khoi lirgng (g/L) KHPO, 05 KELPOs 0.5 Caco; 0.5 NaCl 0. CaCh, 05 MgSO,.7H20, 0. Mi trudng chon Igc ngudn khodng ti uu bao gdm ngudn nito téi uu (10 g/L), ngudn cacbon ti vu (20 g/L), va ngudn khong cin khdo sat. Tién hanh Ching L. plantarum NT 1.5 duge ting sinh trén méi trudng MRS & 37°C, 5% COs, 24 gid. Diéu chinh dich khuan vé 10° té bao/ mL sau d6 bé sung ImL dich khudn vao 20 mL moi trong khao (pH, ahigt 46 theo két qua myc 2.3.4.) trong khoang théi gian (theo két qua myc 2.3.3), 5% CO>. Sau thdi gian nudi cdy do mat dé té bao L. plantarum NT 1.5 bing phuong phap do d duc 6 bude séng 610 nm. Cae thir nghigm duge lip lai 3 Hin, két qua duge xir ly thing ké ANOVA mét yéu 16 bing phin mém Statgraphies Plus 3.0 va phin mém Excel. Két qua duge trinh bay dudi dang trung binh + sai sd. 2.3.6. Thiét ké thi nghi¢m Om yéu t6 anh hwéng dén qué trinh Ién men tang sinh khdi theo thiét ké Plackett- Burman ————— SVTH: TRAN TH] KIEU 30VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU Muc dich Xae dinh céc yéu t6 quan wong anh hudng chinh dén qué winh len men thu sinh khéi cia chung vi khudn L. plantarum NT 1.5. Thiét ké thi nghigm Plackett — Burman ‘Thiét ké thi nghiém theo ma trn Plackett — Burman vii céc yéu té gdm c6: nguén nito, cacbon va cdc nguén khoang di duge chon ¢ muc 2.4. Mi yéu t6 duge khao sat 6 2 mite d6: mire 4 cao (+1) va mite dé thdp (-1). ‘Thiét ké duye bé uf dya theo phuong phap qui hoach thy nghiém bang phan mém théng ké Minitab 16.2.0 clia Minitab Inc., USA dé ude tinh cdc gid tri tvalue, p- value va mite d6 tin cay. ~ Thye hign : * Tang sinh ching L. plantarum trén 20 mL méi truéng MRS u 6 37°C, 24-48 gid. © Diéu chinh dich khuan dat gid tri ODsio c6 mat dé té bio khoang 10° té bao/mL. B6 sung | mL dich khuan vao 20 mL méi truéng khao sit. # Nudi vi khudn & nhigt 46 khao sit theo myc 2.3.4., 5% COs. Sau thai gian nudi cdy dich khuan durge do ODe1o dé xe dinh mat dé té bao. © MGi nghigm thite cita thf nghiém duge thyc hign véi 3 Jan lp lai. — Két qua *# S6 ligu két qua thi nghiém duge théng ké bing phn mém Minitab 16.2.0 * Anh huéng ctia cde yéu 16 din sinh khéi ching vi khudn duge m6 té qua phwong trinh héi quy bac nhit: Y=8,+D BX, = Dua vao phan tich héi quy, néu mite ¥ nghia dat trén 95% (p < 0,05), thi yéu t6 dé durge cho 1a c6 anh huéng chinh dén sy tang sinh khéi té bao va véi két qua thu tiép tue thyc hign cde thf nghiém tiép theo dé xac dinh gid ui ti wu cho sw gia tang sinh knéi.VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 23.7. Thi nghi¢m khéi dau ‘Thiét ké thi nghiém dang day du 2°, c6 bo sung thém diém thf nghigm wung tam. Méi yéu td due kKhéo sét 63 cdp d@: mite dé cao (41) va mite d6 thp (-1) va mitc trung tam (0). Thiét ké dirgc bé tri da theo phuong phap quy hoach thuc nghiém bang phin mém théng ké Minitab 16.2.0 ciia Minitab Inc., USA. Thi nghiém duge lp Iai 3 Lan. Tién hanh, Tuong ty myc 2.3.6 2.3.8. Tim khoang t6i wu cia céc yéu 16 anh hudng chinh bing phuong phap leo déc 2.3.8.1. Thiét ké thi nghiém Néu két qua cia bude khéi dau cho thay cé thé mé ta him muc tigu bang mot ham héi quy bac nhat, diéu dé chimg t6 ving thi nghiém khéo sat cdn 6 xa ving cue tri. Tién hanh céc thf nghiém leo déc nhim xée dinh ving cue tri, Cac thong sé cho phuong php nay duge tinh todn thong qua hé quy tir phuong trinh hdi quy cua thf nghiém khoi dau. Y= Dot Dixy tot Dery ‘Tir mite co sé cila cdc yéu té nay va cic hé s i quy, cdc bude chuyén dong s& due tinh nhu sau: Chon buée chuyén dGng dytmg vei yéu té c6 gid tri tuyét “da hé sé hai qui Jon nhat va éng con lai bang céc cng thite: Trong dé: 4,: Khoang bién thién. b,: HG $6 hoi qui cia yeu to x1 6,: Bude chuyén dng cita yéu t6 x1. ee SVTH: TRAN TH] KIEU 32VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU Tir két qua tinh toan bude chuyén dong cia timg yéu t6 anh huéng, thi nghigm bat dau tr mire trung tm cita cde yéu t6 anh hudng chinh. (Nguyén Vin Dy va cs., 2011) 2.3.8.2. Tién hanh Tuong ty myc 2.3.6 2.3.9. Thi nghigm bé mit chi ti¢u xc djnh gid tri téi wu cua céc yéu té anh hung chink. ‘Tir két qua thf nghiém leo déc, tién hanh thiét ké thf nghiém Box-Behnken dé tim gid tri t6i uu cua cde yéu t6 anh hudng chinh. 2.3.9.1. Thiét ké thi nghi¢m MGi yéu t6 durge khao sat 3 mtic d6: mie d6 cao (+1), mite 46 thap (-1) va muc 46 tung tm (0) dua theo két qua 6 muc 2.3.8. ‘Thiét ké dirgc bé tf dia theo phuong phap quy hoach thy nghiém bing phan mém théng ké Minitab 16.2.0 cita Minitab Inc., USA. 23.9.2. Tién hanh Tuong ty myc 2.3.6. 2.3.10. Xée dinh théi gian tang truéng cua ching L. plantarum NT1.5 trén méi tring t6i wu Sau khi xée dinh dirge méi trrdmg vi digu kign nudi cay téi uu cho sinh khéi cao hanh kiém dinh két qua va khdo sdt lai théi gian ting trvéng tdi ma 4, 5% CO, nhat ching t nhat ciia ching vi khuan trén méi tuéng khao sat & nhiét d6 theo muc 2. 3: Phuong phap thyc hign tuong tyrmyeKET LUAN VA DE NGHI CHUONG 3: KET QUA NGHIEN CUU vA THAO LUAN SVTH: TRAN THI KIEU 34KET LUAN VA DE NGHI 3.1 KET QUA XAY DUNG DUONG TUONG QUAN GIU'A MAT DO TE BAO VI KHUAN VA GIA TRI ODo10 Dé cé durge dudng tong quan tuyén tinh gitta ODer0 va mat d6 té bao Lactobacillus plantarum NT 1.5 trén méi trrdng MRS, chiing tdi tién xc dinh mat 6 vi khuan 6 nhimg gid tri do ODeio tuong img. Két qua xy dyng dudng tong quan giita m 48 thi 3.1. ‘do vi khudn va gid tr] ODsio duge trinh bay trong bang 3.1 va Bang 3.1: Gid trj do ODeo va mat 9 té bao (Log(N/mL) OD6 100m 01 0,2 0,3 04 0,5 Sé khudn lac binh = a = 7 quan (CFU/ mL) 7,2.10° 1,31.10' 1,98.10 2,5.10 3,3.10' Log (N/ mL) 6,857 7AN7 7,297 7,398 7,519 7.600 = 7.500 ~——_________ 7.400 > = 7.300 z 7.200 + ¥=1.603x + 6.7566 z 7.100 R?= 0.9617 ° ® 7000 log¢N/mL) 6.900 + 6.800 +. 0 0.2 04 0.6 Gia tri) OD610 Dd thj 3.1. Duong twong quan tuyén tinh gira ODeio va mit 49 té bao Lactobacillus plantarum NT 1.5 trén moi trang MRS Qua khao sat qué trinh nudi cdy cua ching L. plantarum NT 1.5 trong 24 gir duge trinh bay uén bang va biéu d6 ching t6i nhin thay ring mat d@ té bao cia vi khuan L, plantarum NT1.5 tong huyén phi té bao tong quan tuyén tinh voi cae SVTH: TRAN THI KIEU 35gid tri ODgioam tit 0,1 — 0,5 theo phurong trinh y = 1,603x + 6,756 voi mite 6 tin cay 96,17%. 3.2. KET QUA XAY DUNG DUONG CONG TANG TRUONG CUA LL, PLANTARUM NT 1.5 Dya vio két qua xy dung duéng tuong quan giita mat d6 té bao vi khuan va gid tr] ODgio chting t6i tién hanh xay dyng dudng cong tang trréng trong cita ching Lactobacillus plantarum NT1.5. Su tang truéng cia ching Lactobacillus plantarum NTL. duge theo di tai cdc thi diém khdo sat bing cach do OD1o theo nhiing méc thoi gian nudi cay. Két qua duge tinh bay trong bang 3.2 va dd thj 3.2 Bang 3.2. Gia tri OD¢1 theo théi gian Thoi gian (gid) Gia tri OD610 Log (N/mL) 0 0,023 + 0,001 6,800 3 0,145 + 0,000 6,990 6 0,369 + 0,000 7349 9 0,625 + 0,000 77158 12 1,556 + 0,003 9,250 15 1,944 + 0,000 9,873 18 2,111 £ 0.000 10.41 21 2,084 + 0,000 10,097 24 2,078 + 0,000 10,088 27 2,070 + 0,000 10,075 30 2,049 + 0,000 10,041 33 2,036 + 0,000 10,021 36 2,035 + 0,000 10,019 39 2,013 + 0,000 9,983 SVTH: TRAN THI KIEU 36KET LUAN VA DE NGHI 42 1,994 + 0,000 9,952 45 1,993 + 0,000 9,954 48 1,988 + 0,000 9,944 S51 1,971 + 0,000 9,916 54 1,967 + 0,000 9,910 387 1,935 + 0,002 9,859 60 1,848 + 0,000 9,719 63 1,806 + 0,005 9,652 66 1,703 + 0,000 9,486 69 1,615 + 0,000 9,345 TR 1,470 + 0,016 9,114 12,000 10.000 8.000 a z Z cow e & 2.000 4,000 £ 30h, 33h. 36h 42h 45h 48h sth 63h ig 69h £ DB thj 3.2. Dwong cong ting truréng ciia L. plantarum NT 1.5 theo thii gian trén moi trong MRS Dua vio bang két qua gid tri OD (bang 3.2) va dé thi dudng cong ting trréng cia L. plantarum NT 1.5 trén méi truéng MRS (dé thj 3.2) chting 161 thoi gian tir 0 gid dén 6 gid 1a thoi gian vi khudn bude vao pha tiém tang (pha Lag) thoi gian nay vi khuan tang sinh rat it (log c6 gid tri tir 6,800 dén 7,349). Tir 6 gio dén 18 gid vi khuan tang sinh manh nat (log c6 gid trj tir 7,349 dén 10,141) day la SVTH: TRAN THI KIEU 37KET LUAN VA DE NGHI thoi gian thu duge nhiéu sinh khéi vi khudn nhat, Vi khuan bude vao pha edn bing trong thoi gian 18 dén 60 gid (log co gid tri tir 10,14] dén 9,719). Sau 60 gid vi khuan roi vao pha suy tan. Tir két qua trén chiing ti chon 18 gid (log = 10,141 N/ mL) la thai gian thich hop nit dé thu nhan sinh khéi cia L. plantarum NT 1.5. 3.3 KET QUA KHAO SAT NHIET DQ, pH THICH HOP CHO SY’ TANG TRUONG CUA L, PLANTARUM NT1.5. Tir két qua xy dung dung tong quan gitta mat d6 té bao vi khudn va gid tri ODgio, dung cong tang truéng tréng ching Lactobacillus plantarum NT 1.5, chiing t6i tién hanh khao sat anh huéng ciia nhiét 46 nudi cdy va pH méi trong dén su ting trudng cua L. plantarum NT1.5. Két qua dugc thé hién bing gid tri Log (N/ mL) cia méi nhiét d6 tai pH tuong ting. Két qua khao sit duge trinh bay trong bang 3.3 va dé thi 3.3. Bang 3.3. M§t d6 té bao Lactobacillus plantarum NTI.5 (Log (N/ mL)) tai mii gid tri nhiét d6 va d6 pH khao sat | pH=5 sip =6— pH=7 pH=8 30°C 7,605+ 0,027 8,724 0,174 9,782 0,034 9,990+0,025 — 9,352+ 0,129 37°C 8,588+ 0,167 9,389+ 0,136 9,942+ 0,020 10,011 + 0,014 9,677+ 0,007 40°C 7,173£0,126 8,522+ 0,061 8,82140,102 9,183+0,028 7,4234 0,114 SVTH: TRAN THI KIEU 38KET LUAN VA DE NGHI 12 10 84 ™ 30°C 6 m37°C = 40°C 4 0 pH=4 pH=5_—pH=6 —_pH=7 pH=8 Log (N/ mL) DO thj 3.3. Anh hung cia nhigt 46 va d6 pH lén sy ting truéng cia Lactobacillus plantarum NT1.5 Dya vao bang 3.3 va dé thi 3.3 ching t6i thay ring tai pH=4 va 40°C Lactobacillus plantarum NT1.5 ting trudng thap nhat (Log =7,605+0,027) va cao nhat 6 37°C va pH 7 (log (N/mL} (0,011 + 0,001), Nhu vay chting t6i chon pH=7 va nhigt d6 37°C Ia diéu kién nudi cdy thich hgp cho L.pantarum NT1.5 cho cdc thi nghiém tiép theo. 34 KET QUASANGLOC YEU TO DINH DUONG Tir nhiing két qua c6 duge 6 cdc thi nghiém truéc (xy dung duéng twong quan giita mat d6 té bao vi khuan va gid tri ODgio, durong cong tang truéng trréng , két qua khao sat anh hudng cia nhiét dO va pH dén sy ting trudng cita L plantarum), ching t6i tién dén bude sang loc cdc yéu t6 dinh dudng anh huéng dén su sinh trudng cua ching L. plantarum. Cac nguén dinh dudng khao sat gm c6: ngudn nito, ngudn cacbon, ngudn khodng. 3.4.1. Ngudn nite ‘Ching t6i tién hanh khdo st cdc nguén nito: pepton, bot dau nanh, bét bap, (NH,))SOj, Uré voi khoi lurgng méi ngudn duge thé hign trong bang 2.1 (muc 2.3.5.1). SVTH: TRAN THI KIEU 39KET LUAN VA DE NGH] Anh huéng ciia cée ngudn nito khao sit dén sinh trrong cia L. plantarum NTL.5 duge xc dinh théng qua gid tri Log (N/ mL). Két qua thf nghiém duge thé hign trong bang 3.4 va dé thi 3.4. Bang 3.4. Gid tri log (N/ mL) cia cde ngudn nito khao sét Ngudn Nito Log (N/mL) Mit 49 (CFU/ mL) Bot bap 7,193 £0,051" 15.10 BOt du nanh 7,644 + 0,164" 44.107 (NH4)2804 7,265 + 0,021° 1,10" Uré 7,381 + 0,012° 1.8.10" Trong cing mot cét cdc chi so c6 cling mau te khong c6 su khdc bigt 6 mite ¥ nghia 5% qua phép thie Duncan. HL Log (M/ mL) bap pepton bgt dju nin (NH4)2S04 DO thi 3.4. Két qua khao sat nguén nito’ ‘Theo két qua thf nghiém bang 3.4 va bigu dé 3.4 ching toi nhan thay ring: ~ Gitta cdc sé ligu c6 sy khdc biét ¥ nghia véi d6 tin cy p < 0,05 (phy luc 2). Trong cac nguén nito (hitu co va v6 co) thi ngudn nito hiu co anh hung dén mat 6 vi khuan cao hon cae nguén nito vo co. Pepton cho mat d6 vi khuan cao nhat (Log (N/ mL) = 8,721 + 0,081), thap nhat 1a bt bap (Log (N/ mL) = 7,193 + SVTH: TRAN THI KIEU 40KET LUAN VA DE NGHI 0,008. Vi vay, pepton duge chon la ngudn nito tét nhit cho san xuat sinh khéi cia L. plantarum NTL.5. 3.4.2. Ngudn cacbon Tir két qui muc 3.4.1 ching t6i tiép tuc khao sat cc nguén cacbon. Méi truéng khao sét gdm c6 pepton, céc nguén khodng cia méi trang MRS va cdc ngudn cacbon can khio sat. Cée nguén cacbon cin khio sa a: sucrose, maltose, glucose, lactose, mat ri duéng, b6t bap voi khdi long mdi nguén duge trinh bay trong bang 2.2 (myc 2.5.3.2), Anh huéng cita cic nguén cacbon khio sat dén su sinh trréng cia Lplantarun NTL.5 duge xac dinh thong qua gid tri Log (N/ mL). Két qua thf nghiém dugc trinh bay trong bang 3.5 va biéu dé 3.5. Bang 3.5. Gi tr] log (N/ mL) ciia céc nguén cacbon khio sit Ngudn Cacbon Log (N/ mL) Mat do (CFU/ mL) ‘Succrose 8,586 + 0,057° 3,9.108 Maltose 9,519 £0,007" 3,0.109 Glucose 9,155 +0,014" 10,5.109 Lactose 7,198 + 0,020° 1,6.107 Mat ri dung 9;25210,093" ‘18.109 Bot bap 6,912 + 0,012" 8,2.106 Trong cing mot cot cdc chi so cé cling mau te khong €6 su khdc bidt & mite ¥ nghia 5% qua phép thie Duncan. SVTH: TRAN THI KIEU 41KET LUAN VA DE NGHI Wil sucrose maltose. glucose. tactose. = sm@tri_——_bt ip duong, D6 thj 3.5. Két qua khao sat nguén Cacbon Theo két qua thf nghiém bang 3.5 va biéu dé 3.5, chting tdi thay ring: - Gitta céc sé ligu 06 su khdc biét y nghia véi d6 tin céy p < 0,05 (phy luc 2). -Cfe nguén cacbon déu anh huong dén sy ting truéng cia vi khuan L plantarum NT1.5. Trong céc nguén cacbon thi maltose cho mat d6 vi khudn cao nhat (Log (N/ mL) = 9,519 + 0,000). Glucose va mat ri duéng anh hudng dén kha nang ting trréng cua vi khuan ngang nhau (véi gid tri Log (N/ mL) tuong img 1a 9,155 + 0,001 va 9,252 + 0,026). Thap nhit la bét bap Log (N/ mL) = 6,912 + 0,000. Cae nguén cacbon maltose, glucose, mat ri duéng déu c6 anh hudng cao dén kha ning ting trudéng cia vi khudn, Mic di maltose c6 inh huwéng cao hon tuy nhién, xét vé gid thinh mét ri dudng gitip tiét kiém chi phi san xudt hon maltose va glucose rat nhiéu lan. Vi vay, chiing tdi chon mat ri duéng 1A nguén cacbon tét nhat cho san xuat sinh khéi L. plantarum NT1.5. 3.4.3. Ngudn khoang ‘Tir két qua myc 3.4.1 va 3.4.2 chting tdi tiép tuc khdo sat anh huang cita cdc . Cée nguén khoing duge khao sat 1a: CaCO3, K7HPOs, MgSQ,.7H20, CaCh, NaCl, KH2PO, voi khéi ign trong bang 2.3 (myc 2.3.5.3). nguén cacbon dén kha nang sinh trong cua chung vi kh lugng méi nguén duge SVTH: TRAN TH] KIEU a2Anh huéng cua cae nguén mudi khodng khao sit dén sir sinh truéng cua Lplantarum NT1.5 duge xac dinh thong qua gid wi Log (N/ mL). Két qua thé nghiém duge trinh bay trong bang 3.6 va bieu dé 3.6. Bang 3.6. Gid tri log (N/ mL) ciia cdc nguén mudi khodng khao st Ngudn khodng Log (N/ mL) Mit d6 (CFU/ mL) ‘CaCO3 44.108 K2HPO4 7,665 £0,121" 4,6.107 KH2P04 7,163 + 0,152° 1,3.107 Trong cing mét c6t cdc chi 86 c6 cting mau ne khong cé sic khdc bigt 6 mite ¥ nghia 5% qua phép thie Duncan, " | 10 8 CaCO3 K2HPO4 —-MgSO4—CaC12_ NaCl KH2PO4 6 LogtN/ mL) 4 2 0 DO thj 3.6. Két qua khao sat nguén mudi khodng Theo bang két qua 3.5 va biéu dé 3.5, ching ti nhan thay rang: ~ Gitta cdc sé ligu 06 sy khdc bigt y nghia voi d6 tin cay p < 0,05. — Tat ca cdc nguén khodng Khao sét déu cé anh hudng tich cue dén sinh ), CaCl, NaCl dén mat a6 té vi khudn L. plantarum NT1.5 khong c6 sy khéc biét ¥ nghia, gid tri trudng cla vi khuan. Trong d6, anh huéng cia CaCO3, MgSO..7H: SVTH: TRAN THI KIEU 43KET LUAN VA DE HI Log (N/ mL) cia CaCOs, MgSQ,.7H0, CaCl, NaCl lin lugt la 8,648 + 0,279; 9,348 + 0,269; 8,659 + 0,420; 9.07 + 0,037. KH»PO, va _K,HPO, cho mat 46 té bao thip hon véi gid tri Log (N/ mL) = 7,163 + 0,070; 7,665 + 0,044. Nhu vay, CaCOs, MgSO,.7H0, CaCl, NaCl 1a cde ngudén khodng tét nat cho sinh truéng cia L. plantarum NT1.5. 35 KET QUA XAC DINH CAC YEU TO ANH HUONG CHINH THEO THIET KE THI NGHIEM PLACKETT- BURMAN Tir két qua myc khao st cdc nguén dinh dudng, ching t6i xac dinh duge céc pepton, mit ri duéng, CaCOs, MgSO,.7H20, CaCl, NaCl c6 anh huéng dén yéu kha nang sinh trréng ciia ching L. plantarum NTIS. Bé xac dinh duge céc yéu t6 c6 anh huéng chinh dén kha ning sinh trréng c ching vi khudn chting tdi tién ké thf nghiém hanh thi nghiém xac dinh cdc yéu t6 anh huéng chinh theo Plackett-Burman (P-B). ‘Thiét ké thf nghiém Plackett — Burman duge thiét ké vGi 6 yéu t6 (bang 2.1) gdm 20 thé nghiém, lap lai 3 Kin duge bé tri dya theo phuong phap quy hoach thyc nghiém bang phan mém théng ké Minitab 16.2.0 cia Minitab Inc., USA (bang 3.7) Mi yéu t6 duge xem xét 6 2 mite d6: (-1) cho mire d6 thap va (+1) cho mite 6 cao. Mite gid tri ciia céc yéu té khao sat va két qua phan tich héi quy duge trinh bay 6 bang 3.8. Bang 3.7. Mire anh hwéng ciia timg yéu t6 Gia tri mire yéu t6 Ki i uz — er Mite anh Yéuté(g/L) " Gidtricao Gidtri thip P higu huéng (+1) cy A Pepton 15 5 0.8905 0,000 B Mari duong 20 10 1,1509 0,000 c NaCl 15 1 0.3968 0,000 D CaCh 15 1 05219 0,000 E CaCO, | 1 0,0506 0,554 F —_MgS0,.7H,0 0.2 0 0.7621 0,000 SVTH: TRAN THI KIEU “4KET LUAN VA DE NGHI Bang 3.8: Két qua thi nghiém Plackett- Burman Pepton Matri NaCl CaCl, CaCO, MgSO, = P-B Mat do dung 7H,0 (CFU/mL) 1 “1 “1 +l “1 1 6,344 2,2.10° 1 1 “1 1 1 - 8,702 5,0.10° a -l - 1 -l 1 5,734 5,4.10° 1 -l 1 1 “1 al 7,869 7.4.10" a -l 1 “1 1 Al 6,392 2,5.10° -l -l -l - 1 “1 5,943 8.8.10" BT 1 -l 1 1 1 7,055 11.107 a -l 1 1 -l 1 6,221 1,7.10° a 1 -1 ll -1 al 8,286 1,9.108 “1 -l 1 “1 1 “1 6,408 2,6.10° al 1 -l 1 1 1 7,061 1,2.10" -l 1 1 -l -1 -l 7,686 4,9,10" 1 -l 1 -l 1 1 6,808 6,4.10° 1 -l “1 1 1 -l 7,408 2.6.10" a -l - -1 “1 - 5,952 9,0.10° -l -l “1 1 “1 1 5,739 55.108 A A - -1 -l “1 5,943 8,8.10° 1 1 1 1 - - 9,157 1,4.10° a 1 1 “1 1 1 7,055 1.1.10" -l 1 1 -1 -l “1 7,664 4.6.10" 1 -l 1 -1 i 1 6,808 6,4.10° 1 -l 1 1 “1 “1 7,864 7.3.10" 1 -l 1 -l 1 1 6,815 6,5.10° 1 1 “1 -1 “1 “1 8,254 1,8.10° 1 1 -l 1 1 -l 8,739 55.108 -l -l “1 1 -l 1 5,764 5,8.10° 1 -l “1 t 1 -l 7,446 2,8.10" -l 1 -1 1 - 1 7,061 1,2.10" 1 -l 1 1 1 1 7,238 17.107 1 1 “1 1 1 “1 8,719 1 -l 1 1 -l -l 1,879 1 -l -l -l -l 1 6,350 SVTH: TRAN THI KIEU 45N VA DE NGHI a I -l -1 -l -l 8,284 1,9.10° -l 1 1 -1 1 1 7,061 1,2.107 1 1 -1 -l 1 1 7,640 44.10" 1 1 1 1 -1 -1 9,135 1,4.10° 1 1 1 1 -l -1 9,173 1,5.10° “ll 1 - 1 “1 1 7,055 1.1.10" 1 -l 1 1 1 1 7,240 17.10" 1 L 1 -1 -l -1 7,685 4.8.10" 1 1 1 -l -l 1 8,157 1,4.108 - -l -l “1 -l - 5,933 8,6.10° A 1 1 1 1 “1 8,119 1,3.10° -l 1 1 I 1 -1 8,135 1,4.10° ll -l -1 -l 1 “1 5,943 8,8.10° - 1 -1 1 1 1 7,093 1,2.10" BT 1 1 1 1 +1 8,120 1,3.10* z -l i I 1 1 7,254 1,8.107 1 -l -l 1 1 -l 7,425 2.7.10" 1 -l “1 - el 1 6,408 2,6.10° - al 1 1 I 1 6,203 1,6.10° dl 1 -1 1 -l 1 TAO 13.107 1 1 1 -l - 1 8,093 1,2.10° -l -l 1 - 1 - 6,391 2,5.10° 1 1 = - 1 1 7,661 4.6.10" -l 1 1 -1 1 1 7,093 1,2.107 -l -1 1 1 Al 1 6,238 1,7.10° 1 1 al “1 1 1 7,410 2.6.10° i 1 i -l -l 1 6,135 1,4.10° -l -l -l -1 1 -1 6,921 8,3.10° Theo két qua thi nghigm (bang 3.7), cdc yéu t6 pepton, 1 t ri dung, NaCl, CaCl, MgSO,.7H20 c6 mite d6 anh huéng cao vi vay cde yéu té nay anh huéng chinh toi kha nang ting sinh khdi cita L. plantarum NT 1.5. Trong dé, yéu t6 mat ri duéng c6 mire anh huéng cao nhat (mic anh huong 11,1905) tiép dén 1a pepton (mite anh huéng 1a 0,9305) ding thai c6 p<0,05. Yéu t6 MgSO,.7HL0 c6 p<0,05 va SVTH: TRAN THI KIEU 46KET LUAN VA DE NGHI ¢6 mite anh hudng (effect) am c6 nghia la cc yéu t6 nay lam ting kha nang tao sinh khdi khi G ndng d6 thap va giam kha ning tao sinh khéi khi 6 néng d6 cao. Yéu t6 CaCO; c6 p=0,214 (>0,05) vi vay yéu t6 nay c6 mirc anh hudng rat yéu c6 thé loai bo. Déng thoi, voi két qua danh gid mite 46 anh huéng ciia timg bién thi nghiém & 46 thi cdc anh hudng chinh (46 thi 3.7), 46 thi img voi yéu t6 mat ri dudng va pepton cé d6 déc rit lon chimg t6 cdc bién nay cé anh huéng manh nhat dén kha ning tao sinh khdi ctia ching L. plantarum NT1.5. Main Effects Plot for P-B Data Means Tara Dé thj 3.7. Dd thj cdc anh huéng chinh (Main Effects Plot) Dya theo dé thj céc anh hudng duge chun héa (Normal Plot of the Standardized Effects) va d6 thj Pareto ciia cée anh huéng (Pareto Chart of the Standardized Effects) (phy luc 2) cing cho thay cdc yéu t6 Pepton, Mat ri duong, NaCl, CaCl, MgSO,.7H20 nim xa duong chuan nén céc yéu té nay e6 anh huéng I6n dén kha nang tao sinh khéi cia ching L. plantarum NT 1.5. Tuong ty & biéu dé Pareto cita cdc anh huéng, céc yéu t6 nay nim bén phai duéng gidi han nén né 6 nh huéng dang ké dén kha ning tgo sinh khéi cia ching vi khuin thir nghigm, Diéu nay phi: hop voi két ludn nit ra tir vige phan tich 48 thi cde anh huréng chinh va dé thj anh huéng chuan héa. ‘TH: TRAN THI KIEU 47KET LUAN VA DE NGHI Bang 3.8 cho thay kha nang tao sinh khdi ciia ching L. plantarum NT 1.5 dao dGng tir 5,734 — 9,173 N/ mL khi cdc yéu t6 thay di. Dya vao bang 2.4 (phy luc 2) suy ra phuong trinh hi quy m6 ta anh huéng cita cde yéu t6 06 dang: Y = 7,2248 + 0,4652X, + 0,5954X2 + 0,1784X; + 0,2407X, + 0,0453Xs - 0,3610X. Trong d6, Y la hm muc tigu (CFU/mL), X1, Xo, Xs, X4, Xs, Xo Lan lugt 1 cdc yéu t6 pepton, mat ri dudng, NaCl, CaCl», CaCO3, MgSO,.7H;O. Theo mé hinh héi quy, cdc bién pepton, mat ri duéng, NaCl, CaCl, MgSO,.7Hy tr} P<0,05 fc bi 0 6 gid nén nay c6 y nghia trong phuong tinh hdi quy. Bién CaCO; c6 gid tri P>0,05 do vay cé thé loai bé trong phuong trinh hdi quy. Suy ra phuong rinh hoi quy c6 dang: Y =7,2248 + 0,4652X; + 0,5954X2 + 0,1784X; + 0,2407X, - 0,3610X. Phin tich phuong s ec sudt p tmg voi anh hudng chinh (Main Effects) <0,01 duge thé hign 6 c6t p c6 gid tr 14 0,00 do dé anh hudng cua cdc yéu t6 c6 ¥ nghia théng ké. Noi cach khde cdc anh hudng cita cde bién la ding ké. 3.6 KET QUA THIET KE THi NGHIEM KHOI DAU Tir két qua thf nghiém P-B, thi nghiém Khoi dau duge thiét ké vai ede yéu t6 anh hung chinh: pepton, mat ri duéng, CaCl, NaCl, MgSO,.71 dé danh gia mite 46 phi: hgp cua mé hinh hdi quy bac nhat nham xac dinh gid tri khao sat 6 gan ving cyc tri hay chura. Mdi yéu t6 anh huéng duge khio xc 6 3 mite 46: mite do (0). Thi nghiém duge thiét ké dang day dit véi 37 thi nghiém trong dé c6 5 thi thap (-1), mite d6 cao (+1), mie d6 trung (a nghiém trung tim duge bé tri theo phuong phap quy hoach thyc nghiém bing chuong trinh théng ké Minitab 16.2.0 cia Minitab Inc., USA. Két qua thiét ké thf nghiém va thyc nghiém dugc trinh bay trong bang 3.9. SVTH: TRAN THI KIEU 48KET LI VA DE NGHI Bang 3.9 Thiét ké thi nghiém khoi dau va két qua thi nghiém TT | Pepton | Mat ri | CaCl, [NaCI Log | Matdg dun; 1{ it ia 8,270 2 1 1 -1 1 9,110 [esi et a 1 i 8,366 4[ 1 “1 P iisst 7,199 5| 0 0 0 0 9,778 6| 0 0 0 | 0 9,658 7 |=s0 0 oo 9,613 af 2 1 af [ret 8,254 a “1 a | 1 7,655 | -1 1 1 1 8711 [it 1 aft 9,847 Rl 1 1 al | 1 9,173 Bi a 1 1 “I 8,964 14 1 L I -1 I 9,678 5 | =I 1 1 at 7,997 16| -1 1 fe “I 8,998 wii. = ie | 1 3,156 | -1 “1 a | -l 1 6,654 | - Ei Zien 1 6,526 20 1 1 -l 1 -l 9,997 ui} 0 0 0 [0 0 9,750 2| -l “1 a [it “1 7,446 alt 1 1 1 1 9,670 24 -1 -1 -1 -1 -1 7,486 25 | -i 1 1 1 “I 9,509 26 | -1 “I 1 [-l “I 7,991 aime El 1 1 1 7,199 28 | -l 1 15 [Real 1 8,702 2] 1 1 1 1 - 10,382 30] 1 “1 ee a 8,453 31; 1 1 es Ei 10,456 32 1 -1 1 -1 1 7,655, 33| 1 i sian |e 1 8,270 a4[ +1 1 tt at 8,998 SVTH: TRAN THI KIEU 49KET LUAN VA DE NGHI 35| 0 0 0 [0 0 9,578 | 3.8.10 36 -1 1 1 <1 -l 9,446 2.8.10 a7 i -l 1 - -l 8,964 | 9,2.10° Tir bang két qua thu duge (bing 3.9) cho thay gid tri Log (N/ mL) tang lén so véi thi nghiém P-B, thay déi tir 7,199 dén 10,456 (N/ mL). Theo két qua m6 hinh phan tich héi (phy luc 2) quy ta thay cdc yéu t6 pepton, mit ri duéng, CaCl, MgSO,.7H,0 6 gid t p<0,05 chimg t6 sucé mat ctia cdc yéu t6 nay la c6 ¥ nghia trong phuong trinh hdi quy. Yéu t6 NaCl c6 gid tri p=0,202 (20,05) ching t6 sy c6 mat ciia NaCI la khong c6 y nghia. Suy ra phuong trinh héi quy c6 dang: y = 8,5692 + 0,4825x, + 0,7578x. + 0,2677x3 — 0,381 1xs. Trong dé y la ham muc tigu Log (N/ mL), x1,X2,X3,Xs lin Iugt 1a cde yéu té MgSO,.7H;0. Gid tri “Lack-of-fit” c6 p=0,822 (>0,05) Diéu nay cé nghia la mé hinh héi quy pepton, mat ri dudng, CaCl, 1a phi hyp, gid tri ving khao sat cdn 6 xa ving cyc tri. Do dé tigp tye chuyén sang budc leo déc tim ving chita cyc tri 3.7. KET QUA THI NGHIEMLEO DOC Dya vao két qua thyc nghiém va m6 hinh héi quy nhan duge tr thf nghiém khdi dau, nhitng yéu t6 c6 hé s6 héi quy 4m, chimg té khi néng d6 ciia cdc yéu t nay 6 mite cao trong ving khao st thi sinh khdi sé gidm. Vi vay, cdn gidm gid tr khao sét cia cdc bién nay cho méi buée leo déc. Tir dé, buéc chuyén dng cia cic yéu té anh hung chinh sé dugc tinh todn va trinh bay trong bang 3.10. Bang 3.10 Bang tinh toan burée chuyén dgng cia cdc yéu t6 anh hudng chinh Pepton Matri CaCh MgSO.7H,0 Cée chi tigu (A) duing(B) — (C) @ Gée 5 20 15 0,25 Khoang biénthién Ay 7,5 75 1 0,05 HG sé by 0.4825 0,7578 0.2677. -0.3811 SVTH: TRAN TH] KIEU 50