Jihan el Kichouhi Salhi P.

Lab 1
24/04/2022

PRÀCTICA 1. PREPARACIÓ DE MATERIAL DE PRÀCTIQUES

 Explicar la diferència entre medi de cultiu líquid i sòlid. Amb quin objectiu s’utilitza
cadascun d’ells?

La diferència clau entre els medis sòlids i líquids és que els medis sòlids contenen agar, mentre els
medis líquids no contenen agar. És a dir, l'agar és un agent de solidificació en els medis de creixement,
per la qual, els medis sòlids contenen un agent de solidificació, mentre que els medis líquids creixen
d'un agent de solidificació.

En el cas del medi sòlid aquest s'utilitza per obtenir bacteris aïllats per la formació de colònies sobre
la superfície del medi de cultiu i per a l'estudi de la morfologia de les colònies, cosa que no permeten
els medis líquids.

Per l'altra banda el medi líquid s'utilitza preferentment per afavorir el desenvolupament bacterià de
cèl·lules estressades. Aquest és útil per a diverses finalitats, com la propagació d'un gran nombre
d'organismes, estudis de fermentació i diverses altres proves..

 Explicar la diferència entre medi mínim i medi complex. Enumera els medis de cultiu que
es van preparar a pràctiques i indica si són mínims o complexos?

La principal diferencia en aquests dos medis, es dona en el coneixement de la composició química

dels ingredients del medi.

Els medis complexos s'utilitzen en casa que sigui decisiu conèixer la composició exacta del medi.
Mentre que el medi mínim és aquest en el que estan definits els components químics del medi i que
conté els nutrients mínims indispensables per al creixement d'una colònia.

Durant les pràctiques no es van usar cap classe de medi mínim, per tant, els medis complexos que vam
fer servir són els següents.

- LB (Luria-Bertani)
- PCA (Plate Count Agar)
- MH (Mueller-Hinton)

1
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

 Quins passos cal seguir per a preparar plaques de Petri amb medi PCA (plate count agar)
estèrils?

Per preparar plaques de Petri amb medi PCA, es parteix pesant 23,5 d’un medi comercial que conté ja
barrejats els seus ingredients.

Seguidament, s’introdueix el medi pesat en una ampolla on s’haurà de dissoldre amb aigua destil·lada.

Per passar al procés d’esterilització serà necessari tapar l’ampolla i segellar-la amb una cita indicadora
per tal de transportar-la a l’autoclau a 121 ºC durant 20 min a 1 atm.

Passats els 20 min, s’extreu de l’autoclau deixant-lo refredar a l’interior d’un bany termostàtica a uns
50 ºC.

Per acabar, dintre d’una cabina de flux laminar, es podrà començar a plaquejar en plaques de Petri,
omplint-les amb el medi fos sense deixar bombolles o espais buits.

Donat aquest procés només quadra deixar les plaques solidificar i emmagatzemar aquestes fins a ser
utilitzades.

 Cita tres mètodes diferents d’esterilització de material. Indica quins d’aquests mètodes s’han
utilitzat a pràctiques i posa exemples del tipus de material que s’ha esterilitzat amb cadascun
dels mètodes.

Els mètodes d’esterilització es divideixen en tres grups: mètodes de esterilització físics, químics i els
mecànics

FÍSICS:

- La calor seca
o Flama directa
- La calor humida
o Autoclau

MECÀNICS:

- Filtració

Dels mètodes indicats hem utilitzat a la pràctica el mètode físic de calor humida, l’autoclau. Amb
aquest mètode hem esterilitzat material com:

- Els tubs de dilució: aquest contenien 9 ml d’aigua destil·lada tapats amb un serotap
- Discs d’antibiograma
- Swinndex amb filtres
- Nanses de sembra

2
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

- Puntes de pipetes

També com a mètode d’esterilització mecànica hem utilitzat el mètode de filtració, amb el qual vam
esterilitzar la mostra problema d’aigua de peptona i la pela de poma.

A quines condiciones programaries un autoclau?

El programaria a una temperatura de 121 Cº, amb una durada de 20 min pel material a esterilitzar
20 min, a 1 atm de pressió.

3
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

PRÀCTICA 3. AÏLLAMENT I RECOMPTE DE MICROORGANISMES

 Quants tipus de colònies diferents s’han aïllat a partir de la mostra problema? Descriure
les característiques de cadascuna de les colònies aïllades.

El nombre de colònies aïllades a partir de la mostra problema van ser 4 i aquestes són les
característiques que les distingeixen:

1- Coloració vermella, de forma rodona amb mida mitjana

2- No presentaven coloració, per tant transparent. Tenien una forma rodona i amb mida petita

3- Presentaven una forma irregular i eren transparents

4- Coloració blanca pàl·lida, rodones, amb una mida més gran que les colònies 1 i 2. Per tant, eren
les colònies més grans.

 Completar la següent taula referent a la quantificació de bacteris de la mostra problema

Mètode Medi Dilució en la Factor (a Volum Unitats Concentració

que s’han multiplicar sembrat a formadores de de cèl·lules
comptat per fer els la placa colònies (UFC) (UFC/g de
entre 30 i càlculs) (ml) per placa mostra)
300 colònies
Sembra en
superfície
PCA i KB -2 10^2 0,1ml 4,6·10^5 4,6·10^6

Sembra en massa
PCA
-4 10^4 1ml 1,08·10^6 1,08·10^7

 Quina concentració de cèl·lules hi ha en la mostra problema? (calcular la mitjana dels dos

valors obtinguts)
𝟒, 𝟔 · 𝟏𝟎 + 𝟏, 𝟎𝟖 · 𝟏𝟎𝟕
𝟔
= 𝟏, 𝟓𝟒 · 𝟏𝟎𝟕 𝐔𝐅𝐂/𝐠
𝟐

4
 Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

PRÀCTICA 4. OBSERVACIÓ DE MICROORGANISMES: MORFOLOGIA CEL·LULAR

 Característiques morfològiques de les cèl·lules dels 4 bacteris aïllats de la mostra problema

Aïllat Observació in vivo Tinció

Morfologia Motilitat Presència Gram
d’endòspores
1 Coc-bacil + - -
2 Coc-bacil + - -
3 Bacil + + +
4 Bacil + - -

Fer un esquema de 7 fongs diferents que observats al microscopi, assenyalant les estructures que
s’hi poden distingir. Indicar augments totals amb els que s’ha observat cadascun dels fons i el nom
de l’espècie identificada segons els esquemes aportats.

400X 400X
400X

Fong 1: Saccharomyces Fong 2: Fusarium Fong 3: Stemphylium

400X 100X
400X

Fong 4: Penicillium Fong 5: Alternaria Fong 6: Aspergillus

5
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

400X

Fong 7: Rhyzopus

6
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

PRÀCTICA 5. UTILITZACIÓ DE DIFERENTS CARÀCTERS BIOQUÍMICS I DEL METABOLISME

PER A LA IDENTIFICACIÓ DELS MICROORGANISMES

 Caràcters bioquímics i de metabolisme de 4 bacteris aïllats de la mostra problema:

Aïllat Caràcters bioquímics i de metabolisme

Oxidasa Catalasa OF RM VP Fermentació Indol Citrat
de lactosa
1 - + Facultatiu - + - - +
2 - + Facultatiu + - + + -
3 variable + Aerobi - + + - variable
4 + + Aerobi - - - - +

 Utilitzar els resultats de les característiques morfològiques i els caràcters bioquímics i de

metabolisme (pràctiques 4 i 5) per tal d’identificar els 4 aïllats de la mostra problema de la
pràctica 1 i anotar el resultat d’aquesta identificació (als quadres annexos de pràctiques hi
ha informació disponible sobre diferents espècies de bacteris)

1- Serratia mercescens

2- Escherichia coli

3- Bacillus subtilis

4- Pseudomonas fluorescens

 Indicar quin mínim de proves es necessitarien per identificar els quatre bacteris aïllats?

El mínim de proves necessàries per identificar els quatre bacteris son:

A partir del microscopi:

- La tinció de gram

(Observació in vivo):

- Morfologia
- Motilitat
- Presència d’endòspores

----------------------------------------------------------------------------------

- Prova per determinar la presència de catalasa

- Prova per detectar la presència d'oxidasa
- Prova de l’oxidació/fermentació de sucres
- Prova del roig metil

7
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

- Prova de Voges-Proskaue
- Fermentació de la lactosa(medi MacConkey)
- Prova de l’indol

Resultats de la identificació amb la metodologia API.

 Justificar quines característiques dels aïllats s´han utilitzat per escollir la galeria API
utilitzada.

L'API utilitzat per realitzar la identificació del nostre bacteri (bacteri 2) ha estat l'API 20E, pel fet que
l'Escherichia coli 1 es tracta d'un bacteri gram negatiu d'oxidasa -.

Aïllat Galeria API utilitzada Codi obtingut Espècie identificada

Bacteri 1 API 20E 5317563 Serratian mercescens
Bacteri 2 API 20E 5044572 Escherichia coli 1
Bacteri 3 API 20E 1057451 Pseudomonas fluorescens

8
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

PRÀCTICA 7. SENSIBILITAT DELS MICROORGANISMES A DETERMINADES SUBSTÀNCIES:

ANTIBIOGRAMA

Radi de l’halo d’inhibició (mm) *

Producte Dosi Microorganisme indicador

µg ml-1 Staphyloccocus Escherichia coli Penicillium expans
aureus
Ampicil·lina 1000 10 - -
100 - - -
10 - - -
1
0.1
- - -
0.01 - - -
Àcid Nalidíxic 1000 - 13 -
100 - 7
10
-
- - -
1
- -
0.1 -
0.01 - -
-
Cicloheximida 1000 - - -
100 - - -
10 - - -
1
0.1
- - -
0.01 - - -
Rifampicina 1000 27 5 -
100 22 - -
10 20 - -
1 14 - -
0.1 14 - -
0.01 18 -
*es mesurarà el diàmetre en mil·límetres

Calcular la CMI de cadascun dels productes enfront cada indicador i comentar els resultats obtinguts
en la pràctica d'inhibició de microorganismes en referència a les substàncies assajades.

Producte CMI µg ml-1

Staphyloccocus aureus Escherichia coli Penicillium expansum
Ampicil·lina CMI=100-1000 µg ml-1 - -
Àcid Nalidíxic CMI>1000 µg ml-1 0,11 µg ml-1 -
Cicloheximida CMI>1000 µg ml-1 CMI>1000 µg ml-1 -
Rifampcina 3,52·10^-9 µg ml-1 CMI=100-1000 µg -
ml-1

9
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

PRÀCTICA 8. CORBA DE CREIXEMENT

Resultats cultiu Escherichia coli:

Temps DO Recomptes Ln(UFC/ML)

en placa
Min 600nm dilució Factor dilució Colònies en 20 Colònies per ml
µl en el cultiu
0 0,05 -3 - - -
30 0,047 -3,06 -6 3,50·10^8 19,67
60 0,279 -1,28 -6 2,25·10^8 19,23
90 0,518 -0,66 - - -
120 0,787 -0,24 - - -
150 1,039 0,04 -6 9·10^8 20,62
180 1,252 0,22 -7 2,00·10^9 21,42
210 1,353 0,30 -7 2,75·10^9 21,73

Transformar les dades en logaritmes i calcular els paràmetres de creixement. Realitzar els càlculs
per conèixer del nombre de bacteris inicial (No), el nombre de bacteris final (N), el nombre de
generacions als 210 min (n), la taxa de creixement (μ) i el temps de generació (g).

No N n μ g
19,67 689,41 5,15 0,017 40,77

10
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

R esponeu breument les qüestions següents:

 Per què al fer les dilucions per realitzar el recompte de microorganismes és important emprar
una pipeta o punta diferent per a cada dilució ?

Si s’utilitza una mateixa pipeta per extreure i dispensar una mostra i després pipetejar un altre mostra
immediatament sense canviar-la, es podria introduir una contaminació en la mostra. En aquest cas
alteraríem les concertacions de les dilucions.

 Dos grups de pràctiques han realitzat un recompte de bacteris presents en una mostra, els
dos han emprat el mètode de les dilucions successives (posant 1 mL del tub mare al següent
tub i així successivament ). Per fer les dilucions el grup 1 disposava de tubs de 9 mL de Ringer
i el grup 2 de tubs amb 7 mL. La tècnica utilitzada en la sembra ha estat en tots dos casos per
sembra en superfície (sembrant 0,1 mL). El recompte del grup 1 a la placa on havien sembrat
0,1 mL de la dilució 10-6 ha estat de 40 ufc. Quin tub de dilució ha sembrat el grup 2 si en la
placa compten 152 ufc.

Grup 1 ---------------------------------------------------------> (40 UFC/0,1 ml)·10^6= 4·10^8 UFC/ml

- Factor de dilució = 10^-6
- 100 μl
- 40 UFC
Grup 2 --------------------------------------------------------> (152 UFC /0,1 ml)·8^X= 4·10^8 UFC/ml
- Factor de dilució= ? 1520·8^X=4·10^8 UFC/ml
- 100 μl 8^X=263157,8947
- 152 UFC log8 (263157,8947)= X
X=6

Per tant el tub de dilució que ha sembrat el grup 2 és el tub de factor 10^-6

11
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

 Quin medi de cultiu s’ha utilitzat a les pràctiques que al mateix temps de ser selectiu és
diferencial? Explicar-ho breument. Quin medi era només diferencial?

El medi MacConkey es tracta d’un medi diferencial i selectiu per bacteris, donat que serveix per aïllar
selectivament bacils Gram negatius i entèrics i diferenciar-los sobre la base de la fermentació de la
lactosa.

Un dels medis que va ser exclusivament diferencial, era el medi KB (King B). Els medis diferencials són
aquells que deixen créixer diferents colònies en un mateix medi i en addició, aquells en què es posa
de manifest propietats que un determinat tipus de microorganismes posseeix, en aquest cas podíem
diferenciar la fluorescència del bacteri Pseudomones fluorescents.

 S´han guardat les plaques dels cultius purs obtinguts en les pràctiques, però ara al laboratori
solament es disposa d’un microscopi i dels colorants per la tinció de Gram. Per a la
identificació d’un dels quatre amb el mínim de temps, què caldria fer?

Per identificació d’un dels quatre bacteris amb un mínim de temps, es podria començar amb una tinció
de gram, prova de microscòpia que ens ajudarà a identificar ràpidament a partir de la seva coloració
que adopten amb el colorants de la tinció, si es tractarà d’un bacteri gram + o gram -.

Seguiment es podria passar a realitzar les proves morfològiques, de motilitat, i la prova de presència
d’endòspores. La morfològica ens servirà per saber si es tracta d’un, coc, bacil, o espiril. La de motilitat
per identificar moviment o no del bacteri amb l’observació per microscopi dels flagels que els dona
la capacitat de moure’s en medi líquid i semi sòlid, i tal com el seu nom indica, la prova de presència
d’endòspores, que es pot deduir donat que es poden observar estructures refringents en cas que si
hi haig endòspores.

Totes aquestes provés, es poden realitzar a parit del microscopi, amb el que s’anomena observació in
vivo

12
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

 Fes un esquema general del què s’ha realitzat a les pràctiques a partir de la mostra problema
de la pràctica 3 (incloent les pràctiques 4, 5 i 6). Quin és l’objectiu principal d’aquestes.
pràctiques?

El principal objectiu d'aquesta pràctica ha sigut la identificació i classificació a partir de la sembra en

diferents medis i diferents proves, dels bacteris presents en la pela d'una poma (mostra problema
preparada amb peptona).

 Quins són els avantatges i inconvenients de la tècnica PCR enfront de les tècniques clàssiques
de microbiologia per a la detecció i identificació de microorganismes?

Entre els avantatges de la tècnica de PCR trobem:

- És una solució ràpida (24 h) i fiable per a la detecció de patògens en aliments, etc
- S'aconsegueix l'alliberament ràpid de producte acabat i lots en el procés de producció.
- És possible conèixer l'absència o presència de patògens, estalviant costos de transport i
millorant els terminis d' entrega. I, el que és més important, garantint la innocuïtat del
producte.
- No requereix cultius purs per la seva pràctica

13
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

D'altra banda, un altre dels avantatges és que amb un únic enriquiment, podrem obtenir resultats
equivalents o superiors als que s'assoleixen amb altres mètodes utilitzats en la microbiologia
convencional, que resulta més lenta.

Entre els inconvenients/limitacions tenim:

- La PCR és una tècnica que, per la seva aparent simplicitat i la seva alta sensibilitat, és molt
susceptible d'errors d'execució i de contaminacions.
- No es pot saber la viabilitat de DNA, per tant, tot el procés en cas de DNA mort seria nul·la.
- Pot obtenir falsos positius per restes d'ADN de micoplasma en medis, sèrums, etc
(contaminació).

 En la pràctica 2 s’ha utilitzat la filtració, quin són els resultats que espereu?

L’objectiu era obtenir creixement bacterià en el medi de cultiu no filtrat i nul·la presència bacteriana
en el medi de cultiu amb la mostra problema filtrada a partir la utilització del Swindex amb filtres de
membrana, i per tant, obtenir una mostra esterilitzada i poder avaluar la tècnica de la filtració com a
mètode d’esterilització.

 En la pràctica 4 s’ha utilitzat la tècnica de la PCR, amb quina finalitat? Quins han sigut els
resultats obtinguts?

La finalitat d'aquesta part de la pràctica ha sigut, acabar d'identificar la Pseudomonas fluorescens.

Sabem que la reacció en cada de la polimerasa és una tècnica de laboratori comuna que s'utilitza
per fer moltes còpies d'una regió determinada d'ADN per tal d'identificar presència d'un
microorganisme.

Els resultats obtinguts en la nostra pràctica es troben en la imatge 1 adjuntada. En aquesta podem
observar el resultat de les mostres problema, incubades en pràctiques anteriors (la,1,2,3, i 4).
Podem analitzar en la imatge 1, com una de les quatre mostres dona positiva, corroborant la
presència del bacteri a identificar. Afagidment, es pot captar com el control negatiu i el de l'aigua
donen resultats negatius, a diferència del control positiu, el qual tal com indica el nom ha donat
positiu. Amb això ens indica la bona pràctica de la tècnica, i es pot dir que no hi ha hagut cap tipus
d'error que inhabiliti la identificació del bacteri

14
Jihan el Kichouhi Salhi P.Lab 1
24/04/2022

Seguidament, podem observar que la mostra problema 4 (la del bacteri a identificar), ha donat positiu
a 650mp, indicar que presenta amplificació, i, per tant, indica presència del bacteri (Pseudomonas
fluorescens). A diferència de la mostra 4, les mostres 1,2,3, no presenten amplificacions, i, en
conseqüència, no estan infectades del bacteri a analitzar.

Imatge 1. Resultats de la PCR

15