PRÀCTIQUES DE BIOLOGIA CEL·LULAR I GENÈTICA

CTA i NHiD

PRÀCTICA 1

OBSERVACIÓ DELS CROMOSOMES EN CÈL·LULES VEGETALS:

ESTUDI I IDENTIFICACIÓ DE LES DIFERENTS FASES DE LA DIVISIÓ
MITÒTICA

PRÀCTICA 2
FRACCIONAMENT D’ORGÀNULS CEL·LULARS PER CENTRIFUGACIÓ
DIFERENCIAL
PRÀCTICA 1

OBSERVACIÓ DELS CROMOSOMES EN CÈL·LULES VEGETALS:

ESTUDI I IDENTIFICACIÓ DE LES DIFERENTS FASES DE LA DIVISIÓ
MITÒTICA

1. Objectius de la pràctica:

• Visualitzar la mitosi com a mecanisme de creixement i reproducció asexual.

• Comprendre els principals esdeveniments que caracteritzen les fases del Cicle Cel·lular de
cèl·lules eucariotes.
• Analitzar les principals característiques de la mitosi.
• Realitzar preparats de mitosis utilitzant meristema apical d’Allium porrum (porro).
• Identificar les fases de la mitosi.
• Determinar el temps que les cèl·lules passen en cada fase del cicle cel·lular.
• Investigar sobre la importància biològica de la mitosi.

2. Material necessari per la realització de la pràctica.

- Meristema apical de l’arrel d’Allium porrum
- Microscopi
- Vasos de precipitats de 10 ml.
- Alcohol
- Colorant de Carmí acètic
- Àcid acètic
- Paper de filtre
- Manta calefactora
- Pinces de fusta
- Pinces i tisores
- Pinzells
- Portaobjectes i cobreobjectes

3. Reactius

• Reactiu de Carnoy
Àcid acètic glacial / Etanol 1/3 v/v

• Carmí acètic
Carmí (C.I. 75470) ------- 4-5 g
Àcid acètic ------------ 45 ml
Aigua destil·lada ------- 55 ml

2
 Es dissol el carmí en àcid acètic al 45% i la dissolució s'escalfa fins a ebullició durant una
hora, tenint la precaució de refrigerar contínuament els vapors per no variar la concentració; això
s'aconsegueix escalfant la barreja en un Erlenmeyer tancat mitjançant un tap de goma perforat per
on es passa un serpentí de refrigeració.

4. Tècnica per a la realització de preparacions microscòpiques

Els àpexs de les arrels s'obtenen submergint els bulbs de porro en aigua, de manera que
aquesta cobreixi la zona d’on emergiran les noves arreletes. Al cap de tres dies
les arrels comencen a créixer i quan aconsegueixen una longitud aproximada de 1 mm ja poden ser
tallades.
a) Tallar 2 o 3 àpex d’arreletes i col·locar-les en un morter amb el fixador de Carnoy de forma
que quedin totalment submergides.
b) Escalfar el morter durant 5 minuts.
c) Afegir el reactiu de Carmí acètic al morter i portar a ebullició molt suau durant 4-5 minuts.
d) Les arrels ja tenyides es situen en un portaobjectes i s’hi agrega una gota aigua destil·lada
abans de cobrir la preparació amb un cobreobjectes.
e) Sobre el cobreobjectes col·locar un paper de filtre diverses vegades plegat i pressionar
tractant d'aconseguir una bona dispersió i dissociació dels teixits.
f) Observar la preparació en el microscopi començant per objectius de petit augment.

5. Activitats

5.1) Identificació de les diferents fases de la divisió mitòtica en les preparacions realitzades

En la vostra preparació intenteu trobar almenys una cèl·lula en profase, en metafase, anafase i
telofase. Fixeu-vos que el pas d'una fase a una altra és gradual i que les imatges que observeu en
cada fase no són sempre idèntiques. Si teniu algun dubte consulteu el tutorial de la pràctica o bé
pregunteu al professor responsable.

5.2) Determinació del temps que les cèl·lules passen en les diferents etapes del cicle cel·lular, es a
dir, en interfase o en mitosi

3
a) Col·loqueu una preparació en el microscopi i observeu amb l’objectiu de 40x, comptant el nombre
de cèl·lules que estan en interfase i en cada una de les fases de la divisió mitòtica. El nombre de
cèl·lules contades no pot ser inferior a 30 perquè la mostra sigui representativa.

b) Determineu el temps que les cèl·lules passen en interfase i en cadascuna de les fases de la mitosi
utilitzant la següent fórmula:
Tf = Nfase x 720 min/ N total

Tf: temps requerit per la fase; Nfase: nombre total de cèl·lules en la fase; Ntotal: nombre de cèl·lules
contades; 720 min: temps total del cicle cel·lular en cèl·lules de l’àpex de porro.

c) Calculeu els percentatges en cada fase tenint en compte que el nombre total de cèl·lules que heu
comptat representa el 100 %.

d) Ompliu la següent taula amb les dades obtingudes:

Interfase i Mitosi Nombre de cèl·lules % de cèl·lules en cada fase

Interfase

Profase

Metafase

Anafase

Telofase

Nº total de cèl·lules 100%

4
5
PRÀCTICA 2
FRACCIONAMENT D’ORGÀNULS CEL·LULARS PER CENTRIFUGACIÓ
DIFERENCIAL

1. Objectius de la pràctica
- Obtenció de diferents fraccions cel·lulars enriquides en nuclis i plasts (cloroplasts, cromoplasts i
amiloplasts) per centrifugació diferencial
- Adquirir habilitats per al reconeixement de les diferents fraccions cel·lulars al microscopi òptic.

Introducció
Els diferents orgànuls d’un cèl·lula eucariota tenen diferents funcions. Per a l’estudi d’aquestes
funcions s’han desenvolupat tècniques d’aïllament que permeten separar-los en base a les seves
propietats físiques, com ara diferències en tamany o densitat. Aquestes tècniques, conegudes com a
fraccionament cel·lular, requereixen primer la disrupció del teixit a estudiar per tal d’alliberar els
orgànuls cel·lulars de les cèl·lules que els contenen sense afectar la seva estructura. El procediment
més comú consisteix en la disrupció mecànica del teixit. La presència d’una paret cel·lular rígida en
la cèl·lula vegetal fa que l’extracció en aquest tipus de teixit sigui més dificultosa. Donat que els
orgànuls intracel·lulars tenen una mida molt inferior a la cèl·lula, aquest procés d’homogeneïtzació no
els afecta tant i poden mantenir-se intactes, tot i que cal fer tot el procés amb molta cura. Orgànuls
com ara el nucli o cromoplasts són molt sensibles a l’extracció mecànica i la membrana que els
envolta es trenca fàcilment. Per al manteniment de l’estructura dels orgànuls durant l’extracció és
necessari fer aquest procediment en un medi isotònic. Hem de considerar que el producte de la
homogeneïtzació dels teixits contindrà no només els soluts intracel·lulars, sinó també tots els ions i
soluts extracel·lulars que poden provocar una pressió osmòtica i pH de l’extracte totalment diferent a
la intracel·lular requerida pel manteniment dels orgànuls. Per aquests motiu, la disrupció mecànica
del teixit es realitzarà en una solució aquosa que conté un agent tamponant de pH (Tris o HEPES) i
un agent osmòtic (sorbitol). Una vegada els orgànuls s’han alliberat, el següent pas és separar-los de
la resta de components cel·lulars. Aquest procediment es fa normalment per centrifugació. Els
materials que “precipiten” després de la centrifugació se’ls anomena sediment o pellet. El líquid que
queda a sobre del pellet se l’anomena sobrenedant. Hi ha dos mètodes bàsics de centrifugació que
s’utilitzen de forma rutinària en l’aïllament d’orgànuls:

6
- Centrifugació diferencial: separa orgànuls en funció del seu tamany, forma o densitat
- Centrifugació d’equlibri: separa orgànuls depenent només de la densitat.

En la centrifugació diferencial, el teixit homogeneïtzat és centrifugat a velocitats baixes (200-2000

g, on “g” és la força de gravetat [ veure la relació entre g i rpm (revolucions per minut) al final dela
pràctica]. En una primera centrifugació a 200g, els orgànuls pesants (nuclis) sedimenten al fons del
tub. Centrifugacions consecutives a velocitats majors provocaran la sedimentació d’orgànuls més
petits (plasts a 700 g, mitocòndries 12.000 g, fracció microsomal 105.000 g) . Aquest procediment
resulta en una significativa contaminació creuada de les diferents fraccions cel·lulars, per aquest
motiu es considera que són fraccions enriquides (enlloc de purificades) de diferents orgànuls
cel·lulars.

En aquesta pràctica aïllaràs una fracció enriquida de nuclis, cloroplasts, cromoplasts i amiloplasts de
diferents aliments d’origen vegetal.

Figura 1. Representació de diferents tipus de plasts. En la pràctica visualitzaràs els cloroplasts,

cromoplasts i amiloplasts.

7
2. Materials
- Teixit vegetal: pebrot, tomàquet i patata.
- Morter i mans de morter
- Bisturí
- Tubs de centrífuga
- Embuts
- Pipetes de vidre i de plàstic
- Filtres de nylon
- Portaobjectes i cobreobjectes

3. Reactius
Verd de metil 1 % (solució aquosa amb 1 % àcid acètic)
Buffer d’extracció (100 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.33 M sorbitol; 8mM EDTA; 10 mM àcid ascòrbic)

4. Instrumentació
Microscopi òptic
Centrífuga per a tubs

Precaucions de seguretat al laboratori

- Seguiu les instruccions del PNT per a l’ús de centrífugues. La centrifugació ha de fer-se sempre
amb els tubs equilibrats en el rotor.

- No pipetegeu cap reactiu directament amb la boca. Feu servir pipums o peres.

5. Procediment
5.1. Extracció de nuclis i cloroplasts de pebrot verd

Homogeneïtzació del teixit vegetal

- Renteu amb aigua la superfície del teixit. Assequeu amb paper.
- Sobre una càpsula de petri de vidre i amb l’ajuda de tisores i bisturí, talleu el teixit vegetal en
fragments petits i de forma uniforme.
- Una vegada tingueu el teixit seccionat de forma uniforme, passeu el teixit a un morter.
- Afegiu 2 ml de solució d’extracció al teixit en el morter.
- Homogeneïtzeu amb molta cura i amb l’ajuda de la mà del morter fins que l’extracte sigui verd.
Penseu que una fricció excessiva del teixit vegetal provocarà el trencament dels orgànuls,
especialment del nucli.

8
Filtració de l’extracte per membranes de nylon.
- Sobre un embut poseu una membrana de nylon subjectada amb clips. Aquesta ens servirà de filtre
per a no deixar passar partícules grosses i trossos de paret vegetal. (aquesta membrana s’ha de
netejar amb aigua per poder-la tornar a fer servir després).
- Poseu l’embut a sobre d’un tub net i buit.
- Feu passar l’extracte vegetal a través del filtre de nylon.
- L’extracte filtrat ha de ser homogeni i no ha de tenir partícules grans en suspensió.

Centrifugació 200g: fracció enriquida en nuclis

- Centrifugueu els tubs a 200 g durant 1 min. Assegureu-vos que els tubs estan perfectament
equilibrats en la centrífuga.
- Manipuleu els tubs de la centrífuga amb cura de no balancejar-los per no irrompre el pellet.
- Passeu el sobrenedant (SN1) fent servir una pipeta de plàstic i amb molta cura, a un tub nou amb
cura de no emportar-vos el pellet. Resuspeneu el pellet (P1) que queda en unes gotes de solució
d’extracció. La fracció P1 és enriquida en nuclis.

Centrifugació 700g: Fracció enriquida en cloroplasts

- Centrifugueu el SN1 a 700 g durant 1 min. Assegureu-vos que els tubs estan perfectament
equilibrats en la centrífuga.
- Manipuleu els tubs de la centrífuga amb cura de no balancejar-los per no irrompre el pellet.
- Elimineu el sobrenedant i resuspendre el pellet (P2) que queda en unes gotes de solució
d’extracció. Guardeu en fred. La fracció P2 és enriquida en cloroplasts.

Visualització de les fraccions enriquides en nuclis i cloroplasts

Nuclis
- Agafeu unes gotes de la fracció P1 i disposeu sobre un portaobjectes. Afegiu 1 gota de verd de
metil a sobre. Poseu un cobreobjectes. Visualitzeu al microscopi els nuclis tenyits amb verd de metil
ràpidament.

9
 - Has pogut identificar nuclis en la teva preparació? A quins
augments? Dibuixa un nucli que hagis visualitzat al microscopi.

- Sobre aquesta imatge d’un nucli de pebrot, indica quina és

l’envoltura nuclear i el nuclèol.

Cloroplasts

Agafeu unes gotes de la fracció enriquida en cloroplasts (P2) i

disposeu a sobre d’un portaobjectes. NO CAL CAP TINCIÓ.
Visualitza al microscopi. Has pogut identificar cloroplasts
intactes en la teva preparació? Quin tamany tenen respecte al
nucli? Fes un dibuix representatiu del que has vist al
microscopi.

10
5.2. Extracció de nuclis i cromoplasts de tomàquet.

Processament de la mostra i extracció

- Renteu amb aigua la superfície del tomàquet. Assequeu amb paper.
- Agafeu un segment del tomàquet, elimineu les llavors, el teixit gelatinós de les cavitats loculars i
l’epidermis per recuperar només el teixit pericàrpic.
- Sobre una càpsula de petri de vidre i amb l’ajuda de tisores i bisturí, talleu el teixit vegetal en
fragments petits i de forma uniforme.
- Una vegada tingueu el teixit seccionat de forma uniforme, passeu el teixit a un morter en fred.
- Afegiu 3 ml de solució d’extracció al teixit en el morter.
- Homogeneïtzeu lentament amb l’ajuda de la mà del morter fins que l’extracte sigui vermell. Feu amb
molta cura doncs els cromoplasts són molt sensibles al dany mecànic.

Els tomàquets poden ser biloculars o multiloculars. La majoria

d’espècies cultivades, excepte les varietats cherry, tenen quatre o
cinc lòculs. Els lòculs estan envoltats pel pericarp. El pericarp inclou
la paret interna, columnella; la paret radial, septa; i la paret externa.
El pericarp i la placenta formen el teixit carnós del tomàquet. Les
llavors es troben a dins de les cavitats loculars i estan envoltades
per membranes gelatinoses. El teixit vascular es distribueix per tota
la paret externa del pericarp i s’endinsa des de la tija al centre del
tomàquet, i des d’aquest es connecta amb cadascuna de les llavors
(Ho and Hewitt, 1986).

Tomàquet bilocular Tomàquet multilocular

11
- Sobre un embut poseu una membrana de nylon subjectada amb clips. Aquesta ens servirà de filtre
per a no deixar passar partícules grosses i trossos de paret vegetal. (aquesta membrana s’ha de
netejar amb aigua per poder-la tornar a fer servir després).
- Poseu l’embut a sobre d’un tub net i buit.
- Feu passar l’extracte vegetal a través del filtre de nylon. En cas que s’obturi el filtre, rasqueu amb
ajuda d’una espàtula per sobre.
- Acabeu d’extreure tot el líquid fent pressió sobre el filtre (com si es tractés d’una bosseta de té).
- L’extracte filtrat ha de ser homogeni i no ha de tenir partícules grans en suspensió.

Centrifugació 200g: fracció enriquida en nuclis

- Centrifugueu els tubs a 200 g durant 1 min. Assegureu-vos que els tubs estan perfectament
equilibrats en la centrífuga.
- Manipuleu els tubs de la centrífuga amb cura de no balancejar-los per no irrompre el pellet.
- Passeu el sobrenedant (SN1) a un tub nou amb cura de no emportar-vos el pellet. Resuspeneu el
pellet (P1) que queda en unes gotes de solució d’extracció. La fracció P1 és enriquida en nuclis.

Centrifugació 700g: Fracció enriquida en cromoplasts

- Centrifugueu el SN1 a 700 g durant 1 min. Assegureu-vos que els tubs estan perfectament
equilibrats en la centrífuga.
- Manipuleu els tubs de la centrífuga amb cura de no balancejar-los per no irrompre el pellet.
- Elimineu el sobrenedant i resuspendre el pellet (P2) que queda en unes gotes de solució
d’extracció. Guardeu en fred. La fracció P2 és enriquida en cromoplasts.

12
Visualització de les fraccions enriquides en nuclis i cromoplasts de tomàquet

Nuclis

- Agafeu unes gotes de la fracció P1 i disposeu sobre un

portaobjectes. Afegiu 1-2 gotes de verd de metil a sobre.
Poseu un cobreobjectes. Visualitzeu al microscopi els
nuclis tenyits amb verd de metil.

Dibuixa un nucli de la teva preparació. Identifica la

membrana nuclear i el nuclèol.

Cromoplasts
- Agafa unes gotes de la fracció enriquida en cromoplasts (P2) i disposa a sobre d’un portaobjectes.
Visualitza al microscopi.

Has pogut identificar cromoplasts intactes en la teva preparació?

Quin tamany tenen respecte al nucli? Quines diferències podeu
observar entre la fracció enriquida en cloroplasts i cromoplasts?
Has necessitat alguna tinció per visualitzar-los? Fes un dibuix
representatiu del que has vist al microscopi

13
5.3. Extracció de d’amiloplasts de patata

Processament de la mostra i extracció

- Agafeu un segment de patata. Elimineu la pell.
- Sobre una càpsula de petri de vidre i amb l’ajuda de tisores i bisturí, talleu el teixit vegetal en
fragments minúsculs i de forma uniforme.
- Una vegada tingueu el teixit seccionat de forma uniforme, passeu el teixit a un morter en fred.
- Afegiu 3 ml de solució d’extracció al teixit en el morter.
- Homogeneïtzeu lentament amb l’ajuda de la mà del morter fins que l’extracte sigui uniforme. Feu
amb molta cura doncs els amiloplasts són sensibles al dany mecànic.

Centrifugació 700g: Fracció enriquida en amiloplasts

- Centrifugueu l’extracte a 700 g durant 1 min. Assegureu-vos que els tubs estan perfectament
equilibrats en la centrífuga.
- Manipuleu els tubs de la centrífuga amb cura de no balancejar-los per no irrompre el pellet.
- Elimineu el sobrenedant i resuspendre el pellet que queda en unes gotes de solució d’extracció.

Visualització de la fracció enriquida en amiloplasts al microscopi.

Agafa unes gotes de la fracció enriquida en cromoplasts i

disposa a sobre d’un portaobjectes. Visualitza al
microscopi. Disposa unes gotes de la mateixa fracció amb
lugol. Visualitza al microscopi.
Fes un dibuix d’allò que has visualitzat a la teva preparació.
Què tenyeix el lugol?

14
5.4. Problema
Determinació de la força centrífuga a partir de les rpm.
La força centrífuga s’expressa com a força centrífuga relativa (RCF) i es mesura en unitats g. La RCF
és una funció de la velocitat de centrifugació en revolucions per minut (rpm) i la distància de les
partícules des de l’eix de rotació segons aquesta fórmula:

RCF = 1.12 x R x (RPM/1000)²

On R és el radi de rotació en milímetres. En la figura de l’exemple, aquest seria de 240 mm.

Quina força centrífuga estaríem aplicant a una mostra centrifugada a 10.000 rpm en aquest rotor de
24 cm? Seleccioneu la resposta:

RCF = (a) 10.000 g, (b) 26.880g, (c) 268.880g, (d) 2.680g, (e) 2400g

Mantenint les mateixes 10.000 rpm, quina RCF s’estaria aplicant a una mostra centrifugada en un
rotor de 12 cm? Seleccioneu la resposta:

(a) el doble que amb un rotor de 24 cm. (b) la meitat que amb un rotor de 24 cm (c) la mateixa que
amb un rotor de 24 cm. (d) cap de les anteriors.

15
GESTIÓ DE RESIDUS

RESIDUS
TIPUS

Acetato de etilo
Carmin de indigo
Acetato de Plomo
Eosina G
Acetona
Escarlata R
Etanol
Escarlata de Biebrichh
Metanol
Fucsina ácida
Benceno
Fucsina fenicada
Butanol
Giemsa
Eter
Disolvents orgànics no Hematoxilina
Fenol
halogenats Hemateína
Eucaliptol
Ponceau S
Formaldehido
Orceína
Glicerina
Pararosanilina
2-propanol
Rojo Congo
Timol
Rojo nuclear
Resorcina
Sudán negro
Xilol
Verde luz
Naranja G
Verde malaquita
Azul anilina
Wright
Carmín
Papanicolau
Formol

Alcohol clorhídrico
Pironina G
Hidrato de coral
Rojo neutro
Naranja de acridina
Safranina
Disolvents orgànics azul alcian
Verde de metilo
halogenats Azul metileno
Violeta de cresilo
Azul toluidina
Violeta de genciana
Fucsina básica
Violeta de metilo
Cloroformo
Tricloroetileno

Acetato sódico anhidr.

Ácido acético. Acido monocloroacético
Ácido benzoico. Acido oxálico.
Àcids orgànics
Ácido cítrico. Acido pitrico.
Ácido etilendiamino. Acido rubeánico.
Acido fórmico. Acido tricloroacético.
Acido fosfomolibdico. Cromotropo.

Bisulfito sódico Metabisulfito potásico

Bisulfito potásico Metaperiodato sódico
Borato sódico Molibdato amónico
Carbonato cálcico Nitrato de plata
Carbonato sódico Nitrato potásico
Clorato potásico Percloruro férrico
Cloruro de aluminio Periodato sódico
Sals inorgàniques i
Cloruro de hierro (III) Permanaganato potásico
òxids metàlics
Cloruro magnésico Sulfato alumínico
Cloruro sódico Sulfato doble de hierro
Cloruro de zinc (II) y amonio
dicromato potásico Sulfato doble de hierro
Ferrocianuro potásico (III) y amonio
Fosfato dibásico sódico Sulfato de cobre anhidro

16
Àcids inorgànics Ácido clorhídrico
Liquids concentrats Acido sulfúrico

17