1.- LA SEPARACIÓ.

És un conjunt de tècniques molt importants que permeten analitzar si un o diversos components

(analits) estan o no presents a una mostra (anàlisi qualitatiu), i si ho estan, en quina concentració
(anàlisi quantitatiu).

1.1.- Aplicació de les Tècniques de separació.

Aquestes tècniques permeten:
- Purificar les mostres (separar impureses)
- Obtenir alguna substància de les presents a la mostra
- Identificar la presència d’una substància present a la mostra
- Quantificar la concentració de la substància en la mostra

1.2.- Les tècniques de separació.

Existeixen diversos mètodes de separació, depenent de l’objectiu. Quan separem ho fem gràcies a
les diferents propietats que té la substància que volem separar respecte de la resta del preparat.

Classificació de les tècniques de separació:

Segons les propietats en què es basen.
Propietats físiques.
- Propietats electroquímiques.
- Solubilitat.
Segons la quantitat de mostra.
- A tota la mostra. Ex. filtració
- A una part (alíquota). Ex: electroforesi.
Segons la fase analítica.
- A la fase pre-analítica. (Pre-tractament de la mostra).
- A la fase analítica.
2.- SEPARACIÓ A PARTIR DE PROPIETATS FÍSIQUES
2.1.- La filtració.
És un mètode mecànic de separació de suspensions en funció de la mida de les partícules.
Consisteix en fer passar la suspensió per un medi porós anomenat filtre.
Obtenim:
- El filtrat: fluid que ha travessat el filtre.
- El residu: partícules retingudes al filtre.
Objectiu:obtenir el residu, el filtrat o tots dos.

Filtres: el filtre sempre ha de ser un medi porós, per tal que retingui una part del material filtrat
(residu) que sempre presentarà un diàmetre major al del porus del material filtrant. Si el filtre
presenta moltes partícules retingudes, diem que està “colmatat”, perd la seva funcionalitat i s’ha
de substituir

Els materials que s’utilitzen per a filtrar són molt variats:

- Filtres de paper: es presenten en diverses formes, mides i diàmetre de porus. Elegirem un

o altre en funció de les característiques i volum de líquid que volem filtrar. En general:
- Filtre llis o alemany: per a conservar el sòlid retingut
- Filtre de plecs o francès: per a conservar el líquid filtrat (Filtra més ràpid degut a la
major superfície de contacte.)

- Filtres de membrana: Per a fer filtracions esterilitzants. Tenen forma de disc i estan
compostos d’acetat o de nitrat de cel·lulosa. Hi ha opció de mida de porus.

- Filtres de vidre mòlt o plaques filtrants: Són plaques de pols de vidre mòlt, tamisat i
aglomerat que van muntats en un embut filtrant. Permeten fer un gran nombre de
filtracions sempre i quan es faci una bona neteja després de cada ús.

Filtració al laboratori.

Tipus de sistemes de filtrat a petita escala:

- Per gravetat: la tècnica és molt senzilla, els passos a seguir són:
1. preparació del filtre si cal
2. es col·loca el filtre de plecs o llis en un embut i un recipient de recollida a sota de
l’embut
3. es vessa el líquid sobre el paper de filtre i evitant que el líquid vagi a les vores
4. el líquid va a travessant el filtre i va caient al recipient de recolida, la fracció sòlida
es queda retinguda al filtre.
 - Al buit: s’aplica el buit per a succionar el líquid i accelerar la filtració.S’usa quan interessa
recuperar el sòlid d’una filtració.Un cop fet el filtratge cal netejar el filtre amb aigua o
dissolvent adequat.Els passos a seguir són:
1. es col·loca un disc de paper a sobre d’un embut Büchner i se li afegeix una mica de
dissolvent perquè s’adhereix a l’embut.
2. s’acobla l’embut a un matràs kitassato, fent passar el tub pel tap del matràs.
3. s’acobla l’extrem d’un tub de goma a la boca lateral del matràs i l’altre extrem a una
bomba de buit.
4. es vessa el líquid a l’embut i es connecta la bomba.

- Esterilitzant: mètode per a esterilitzar líquids que no tolerarien una esterilització amb
calor (autoclau). El fonament és fer passar el líquid per filtres amb porus molt petits que
només deixin passar el líquid i es quedin retinguts els microorganismes. (filtres de
membrana).

2.2.- Decantació.
Mètode mecànic que separa mescles hereogènies sòlid-líquid (suspensions) o líquid-líquid
(emulsions) segons les seves densitats i gràcies a l’acció de la gravetat.
● Rep el nom també de clarificació o de sedimentació
● No és un mètode massa eficaç i se sol usar com a mètode complementari : és una etapa
prèvia per a purificar una barreja, i posteriorment usar un sistema de filtrat més adequat o
centrifugar.

2.3.- Centrifugació.
Mètode mecànic que separa mescles heterogènies sòlidlíquid (suspensions) o
líquid-líquid(emulsions gràcies a l’acció de la força centrífuga.

● L’objectiu és accelerar la sedimentació que de manera natural faria la gravetat, aplicant

una rotació ràpida (força centrífuga és mol potent, intensa)
● Separació molt més ràpida i efectiva
En una centrifugació estàndard es produeix la separació de la mescla en dos fraccions:
● Pellet o precipitat, que és el component de major densitat i sedimenta a la zona del
recipient més allunyada de l’eix de rotació.
● Sobrenedant, que és el component de menor densitat i per sobre el precipitat. S'obté per
decantació o amb una pipeta pasteur.
- Coeficient de sedimentació: fa referència al temps que tarden les partícules o
macromolècules a sedimentar (es calcula dividint la seva velocitat de sedimentació m/s
per acceleració aplicada m/s, les unitats s’expressa en svedbergs (S)).

La centrífuga: són els equips utilitzats per a centrifugar, consta d’un rotor on es posa la mostra
que gira al voltant d’un eix central mitjançant un motor elèctric.
- Els controls de la centrifuga:
- El temps de centrifugació.
- La velocitat de gir de la centrífuga. Es mesura en r.p.m.
- La temperatura. És necessari controlar-la per si hi ha algun component termolàbil.
- IMPORTANT: s’ha d’equilibrar el pes dintre la centrífuga.
- Ús de la centrífuga
- Conèixer les característiques de l’equip i el seu ús.
- El manual d’instruccions ha d’estar disponible al costat de l’aparell.
- Les centrífugues han d’estar lluny de fonts de calor i materials perillosos (líquids
inflamables).
- En el cas de les de sobretaula han d’estar a una taula ben anivellada i estable,
deixant un espai lliure de almenys 30 cm per cada costat.
- S’ha de desconnectar l’equip de la xarxa elèctrica quan no s’hagi d’utilitzar
durant un període llarg de temps.
- Manteniment preventiu de la centrífuga:
- Diari:
● Es netegen les superfícies amb un drap humit amb solució sabonosa.
● Si es trenca algun tub s’ha de netejar i desinfectar l’interior retirant les
peces trencades.
- Mensual:
● L’ajustament dels rotors i el lúbricament necessari.
● L’estat del mecanisme de la tapa de la centrífuga.
- Anual (ho fan els serveis d’electromedicina):
● Examinar l’exactitud dels controls de temps.
● Verificar la velocitat de rotació real amb un tacòmetre o amb un
fototacòmetre.
● Confirmar el funcionament del sistema de frenada.
● Verificar el funcionament del sistema de refrigeració, si és que en té.
- Tipus de centrífuga:

- Tipus de centrífugació
1. CENTRIFUGACIÓ ANALÍTICA:
Normalment no usada en laboratoris clínics.
- Es treballa sobre poca quantitat de mostra, i el més pura possible.
- S’utilitzen velocitats molt elevades
- Observació de les molècules mitjançant sistema òptic, per això els tubs
han de ser de quars.
- Objectiu: mesurar les propietats físiques de les partícules que sedimenten
(coeficient de sedimentació, massa molecular)
Aplicacions en recerca:
- Analitzar la puresa d’un compost
- Determinar la proporció de cada component
- Conèixer i interpretar estructures moleculars de diferents compostos

2. CENTRIFUGACIÓ PREPARATIVA
L’objectiu d’aquest tipus de centrifugació és la separació dels components d’una
mostra.
- Es treballa amb grans volums de mostra.
- Emprada àmpliament en un laboratori clínic
- És un procés de preparació de les mostres per a una analítica posterior.

Tipus: Preparativa Diferencial (+ comú) i preparativa en gradient de densitat.

 Aplicacions:
- Obtenció de leucòcits. S’utilitza una centrifugació per gradient de densitat
zonal.
- Fraccionament subcel·lular. A partir d’un homogenat tissular per
centrifugació diferencial s’obté els diferents components cel·lulars
(orgànuls, macromolècules, cèl·lules..).
- Obtenció de sèrum o plasma. Aplicant a la sang una FCR de 1500 g durant
10 minuts.
- Concentració de cèl·lules. En líquids corporals com orina, LCR es
concentren les cèl·lules per al seu posterior estudi.
- Extracció de biomolècules. Es realitza una separació de fases per
centrifugació per a la seva posterior separació per extracció amb
dissolvents orgànics.

a. CENTRIFUGACIÓ PREPARATIVA DIFERENCIAL:

Aplicació: sedimentació de cèl·lules en sang y en orina
Procés: 3 centrifugacions successives
- Centrifugació 1 a baixa velocitat. Recollida del sobrenedant
- Centrifugació 2 a mitja velocitat del sobrenedant recollit. Recollida del
sobrenedant
- Centrifugació 3 a alta velocitat del nou sobrenedant.

Resultat: 1 sobrenedant i 3 precipitats corresponents a substàncies diferents.

Depenent de la mostra, aplicarem més o menys centrifugacions i obtindrem
més o menys precipitats segons les centrifugacions fetes.

b. CENTRIFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITAT:

Hi ha 2 variants dintre d’aquest mètode de centrifugació:
- Centrifugació zonal: S’utilitza un gradient preformat (continu o discontinu) de
densitat màxima és menor que la del component de més densitat de la mostra.
S’ha de parar la centrifugació abans que les partícules arribin al fons.

- Centrifugació isopícnica: S’utilitza un gradient continu de densitat màxima major

que la del component de més densitat de la mostra, d’aquesta forma, les
partícules no sedimenten mai al fons del tub. Les partícules agafen una posició
estable al gradient i es concentren en una banda molt estreta.Té temps de
centrifugació llargs. S’utilitza un gradient d’autoformat i es necessiten velocitats
molt elevades.
3.- SEPARACIÓ A PARTIR DE PROPIETATS ELECTROQUÍMIQUES
De les diferents tècniques que es basen en propietats electroquímiques les més destacades són les
electroforesis.
Definició: Tècniques de separació de mescles basades en la diferència de mobilitat de les molècules
que les formen en aplicar un camp elèctric.

La tècnica de l’electroforesi es basa en posar la mescla a un suport i aplicar un camp elèctric. Les
diferents partícules migraran a diferents velocitats pel suport segons les seves propietats
electroquímiques, per tant les obtindrem de forma separada.
Perquè la tècnica funcioni una condició indispensable és que totes les partícules de la mostra
tinguin la mateixa càrrega per tal que es desplacin cap al mateix pol del camp elèctric.

3.1.- L’equip d’electroforesis.

- Components de l’equip:
● Font d’alimentació elèctrica: Crea el camp elèctric, establint una diferència de
potencial. Aquesta provocarà que els components migrin. En surten dos elèctrodes
(cable negre cap al pol negatiu i cable vermell cap al pol positiu).
● Cubeta: Dos recipients, que contenen una solució tampó, la qual evita l’acidificació
de l’ànode i alcalinització del càtode degut a l’electròlisi de l’aigua per l’acció del
camp elèctric. Un pont, on se situa el suport.
○ Són preferibles les cubetes de mida reduïda perque:
■ Presenten menys superfície d’evaporació
■ Es minimitzen les diferències de Tª
■ Permeten una reducció de la mida de les aplicacions
● Suport:Matriu on es diposita la mostra que es va a analitzar i sobre la que migraran
els seus components. Es col·loca sobre el pont i els seus extrems han d’estar en
contacte amb la solució tampó de la cubeta. Ha de ser inert i sense càrrega perquè
no hi hagi interferències en la migració de les molècules.
 - Preparació de l’equip:
- Preparació de la mostra (cal concentrar al màxim les substàncies a separar utilitzant
atres mètodes de separació (centrifugació))
- Preparació del suport (en el cas dels gels , s’han de preparar amb la composició,
gruix i textura adequats, utilitzant el medi que correspongui segons el producte.)
- Preparació el tampó (s’ha de separar la dissolució si no s’utilitza un tampó
comercial).
- L’ús de l’equip:
- Se sembra la mostra sobre el suport prop del pol oposat al que migrarà: molècules
positives prop de l’ànode, i molècules negatives prop del càtode. La sembra pot ser a
uns pouets («pocillos») amb una micropipeta o directament sobre el medi.
- Se seleccionen els paràmetres elèctrics i el temps i es posa en marxa creant una
diferència de potencial.
- Les substàncies migraran pel medi segons la seva càrrega.
- El resultat serà una sèrie de bandes sobre un suport, cada banda serà una
substància diferent.
- Es realitza un revelat per poder veure les bandes.
- Es fa la lectura o interpretació de la informació que proporcionen les bandes
(espectrofotometria, densitometria…)
3.2.- Factors que afecten a la velocitat de migració. En una electroforesi, a part de les propietats
electroquímiques de les molècules de la mescla, la migració d’aquestes també depèn:

- De la forma i mida de les molècules.

● Mida: Les molècules de mida més gran tenen més fricció, per tant la seva velocitat
de migració serà menor.
● Forma: Les molècules de forma esfèrica migren a més velocitat que les molècules
amb forma irregular, això permet que es puguin separar per electroforesi molècules
amb la mateixa mida i càrrega però diferent forma.
- Del suport.
● Adsorció: És una retenció inespecífica de les molècules de la mostra sobre el suport.
● Electroendòsmosi: És un fenomen que es dona en els suports no restrictius i
consisteix en la creació d’un flux de cations i anions degut al suport que interfereix
en la migració de la mescla.
● Tamisat molecular: Efecte degut al diàmetre del porus del suport, ja que actua com a
tamís separant les molècules segons la seva mida.
- De la solució tampó (mantenir el pH).
● Contribueix a pal·liar els efectes de l’electròlisi produïda pel camp elèctric.
● Manté una força iònica adequada. La força iònica condiciona la mobilitat
electroforètica dels ions de la mostra. Per tant la força iònica del tampó ha de ser
suficient per mantenir el pH i la conductivitat durant tot el procés.
● Manté una càrrega neta constant en les molècules que es van a separar ja que el
grau d’ionització depèn del pH del medi per tant s’ha de mantenir constant durant
tot el procés.
- Del camp elèctric: és un gradient de potencial que mobilitza les molècules carregades. Els
factors del camp elèctric que influeixen en l’electroforesi són:
 - Del temps.: És un factor que s’ha de combinar amb el voltatge i la mida del suport.
Augmentant el temps d’electroforesi augmentem les distàncies de separació entre molècules
que migren amb diferents velocitats.

3.3.- Principals tècniques electroforètiques.

ELECTROFORESIS EN CELLOGEL: és el suport que utilitzem per a fer proteïnogrames (electroforesi del
sèrum sanguini per fer un anàlisi semiquantitatiu de les proteïnes del plasma).

- Preparació:
- Mostra de sèrum a partir de sang total obtinguda per centrifugació.
- Tires d’acetat de cel·lulosa (obtingudes de fer reaccionar cel·lulosa en àcid acètic) és
habitual usar tires comercials (Cellogel). Les hem de submergir 10’ en la solució
tampó per emplenar els porus del material i assecar-les dixant-les entre 2 fulls de
paper de filtre.

- Preparació dels reactius:

- Solució tampó Veronal o tampó TRIS: mantenen les proteïnes sèriques carregades
negativament
- Colorant:negre misó/ blau de Coomaise/ roig Ponceau
- Solució decolorant: metanol (45%) i àc. acètic (10%).
- Solució transparentitzadora: metanol (85%) i àc. acètic (15%).

- Procediment:
- Sembrar en el costat catòdic mitjançant un aplicador, que és un tros metall amb el
sèrum i pot ser macro, semimicro o micro, depenent de la quantitat de mostra.
- Introduïm el pont a la cubeta, de manera que hi hagi contacte entre el Cellogel i el
tampó.
- Tapem i connectem la font d’alimentació ajustant la intensitat del corrent i el temps.
Per exemple: 0,1A, 35 min a 200V.
- Parar la font d’alimentació o assegurar-se que està parada

- El revelat: fer visibles les bandes o fraccions en què s’ha separat la mostra:
● Retirem la tira de la cubeta i la deixem 10 min submergida en un colorant.
● Decolorem passant la tira per 3 o 4 cubetes plenes del líquid decolorant, fins
observar les bandes.
● Passem la tira en una cubeta amb el líquid transparentitzador.
● Eliminem l'excés de solució decolorant posant la tira entre dos fulls de paper
de filtre.
- La lectura: se solen donar com un percentatge de cada fracció respecte de la
concentració total. Aquesta informació es pot obtenir de 2 formes:
● Per espectrofotometria: Es retallen les franges i es posen en un dissolvent
per a separar les proteïnes del Cellogel. S’obté una dissolució per a cada
franja, se li mesura l’absorbància i es compara amb l’absorbància obtinguda
prèviament per al total de proteïnes.
 ● Per densitometria: Un fotòmetre quantifica el colorant fixat en cadascuna
de les franges i el representa mitjançant un proteïnograma, donant com a
resultat les fraccions de cada component en relació amb les proteïnes totals
obtingudes prèviament.

ELECTROFORESIS EN GEL D’AGAROSA: El gel d’agarosa és el suport que utilitzem per a realitzar la
separació dels fragments d’ADN. És per això que a aquesta tècnica també se li diu electroforesis dels
àcids nucleics.

- Preparació:
- Primer hem d’obtenir els àcids nucleics mitjançant la seva extracció del nucli
cel·lular, tallats amb enzims de restricció i amplificació usant una PCR.
- Preparem una dissolució amb la mostra, seguint unes pautes (si pot ser usarem el
mateix tampó que el de l’electroforesi). A més, incorporarem sacarosa (40% p/v),
glicerol (30% p/v) o Ficoll (15% p/v), per a augmentar la seva densitat i facilitar la
sembra

- Preparació del gel:

És més complexa que el Cellogel. És important realitzar-la correctament i aconseguir un gruix
convenient (de 15-20 cm de llarg i 3-4 mm de gruix).
- Passos de preparació del gel d’agarosa:
● Hidratar l’agarosa amb la solució tampó durant uns 10 minuts.
● Portar la solució prèvia a ebullició, i posteriorment refredar fins uns 55 ºC.
● Posar la solució en un motlle, dins el qual gelificarà a mesura que es refredi.
L’ús de la pinta formarà els «pouets» de sembra.

- Preparació dels reactius:

- Solució tampó: Per exemple, tris-acetat 0,04M a pH 8, o TBE 5X. Se’ls acostuma a
afegir un o diversos marcadors electroforètics, que són molècules acolorides amb
una mobilitat electroforètica superior a qualsevol component de la mostra. Entre els
més usats trobem la dinitrofenil-lisina (DNP- Lys) i el blau de bromofenol.
- Substància reveladora: Bromur d’etidi, la qual s’intercala entre les bases
nitrogenades de l’ADN i emet fluorescència quan se la il·lumina amb llum UV. Es pot
aplicar en la fase de revelat, o directament en el gel en la fase de preparació.
- Marcadors de pes molecular: Tenen ADN de mida coneguda i s’empren com a
patrons electroforètics de control.
 - Procediment:
- Col·loquem el tampó a la cubeta i hi submergim el gel d’agarosa en ell (electroforesis
submarina). Aquesta disposició dissipa millor la calor generada pel pas de la corrent i
s’aconsegueix un camp elèctric molt eficaç.
- Retirem la pinta de manera que quedaran els «pouets» al descobert.
- Omplim els «pouets» amb les mostres d’ADN en dissolució que hem preparat; la
densitat que li hem donat fa que cada mostra caigui als «pouets» per gravetat. (la
mostra es dispensa en micropipeta, introduint uns 5 µl).
- Carreguem un o dos «pouets» dels extrems amb marcadors de pes molecular. Tapem
i connectem a la font d’alimentació. Ajustem la intensitat del corrent i el temps
(altament variable: normalment uns 5 V/cm separació dels elèctrodes).
- L’electroforesi s’acaba quan s’ha produït la màxima separació dels components de la
mostra, però sempre sense sobrepassar els límits del suport. Els marcadors
incorporats a la solució tampó ens indicaran quan parar.

- El relevat:
- Retirem la tira de la cubeta
- Afegim bromur d’etidi (BRET), si no s’ha incorporat prèviament en el gel

- La lectura: El bromur d’etidi s’intercala entre les bases nitrogenades de l’ADN i emet
fluorescència quan es il·luminat amb llum UV, permetent la seva visualització (Per a realitzar
la lectura, introduïm el gel en un transil·luminador que emet llum UV i provoca la
fluorescència del bromur d’etidi molecular.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLICRILAMIDA (PAGE): per a la separació de proteïnes, encara que

també s’utilitza per a fragments petits d’ADN (5-500pb), i per a la majoria dels RNA.

- Preparació:
- El suport està compost d’acrilamida i bisacrilamida, i pot preparar-se amb un ampli
interval de mides de porus, tenint en compte que:
● la concentració d’acrilamida és la que proporciona al suport entramats més o
menys densos.
● la concentració de bisacrilamida condiciona el grau d’entrecreuament de les
cadenes.
COMPTE!! Són compostos neurotòxics per absorció a la pell i per inhalació.
 - Preparació del gel:
- La preparació és molt semblant a la preparació en suport d’agarosa (preparant la
dissolució amb les concentracionsque corresponguin i gelificant-les en un motlle,
que en aquest cas pot ser en tub o una placa).
- Els suports en placa es poden col·locar en horitzontal en la cubeta, tot i que el més
habitual es fer-ho en vertical. En tots els casos, abans de que el gel es formi, fem els
«pouets» ambuna pinta.

- Preparació dels reactius:s la mostra es prepara en dissolució amb el tampó i se li afegeix

alguna substància, generalment glicerol, per a augmentar la seva densitat. Igualment, al
tampó se li incorporen un o diversos marcadors electroforètics, com el blau de bromofenol.

- Procediment: El suport ha de quedar cobert amb la solució tampó, i se sembra la quantitat

justa en cada «pouet». El final del procés queda determinat pel marcador electroforètic.

ELECTROENFOCAMENT (EEF): És un tipus particular

d’electroforesi en la que les proteïnes se separen segons el seu
punt isoelèctric (el pH en el qual una molècula té càrrega elèctrica
neutra i, per tant, no té mobilitat durant electroforesi si es troba
en el seu punt isoelèctric descrit) en un gradient continu de pH.
És una tècnica més complexa que les anteriors ja que s’utilitzen
voltatges variables i elevats , la qual cosa fa que es necessiti
refrigeració. Una de les aplicacions més importants del EEF és el
càlcul del punt isoelèctric de les proteïnes de la mostra.

ELECTROFORESI BIDIMENSIONAL: és una successió de dues electroforesis

diferents realitzades sobre una mateixa mostra.
Es combinen dos mètodes de separació diferents i s’aconsegueix el màxim de resolució possible
mitjançant tècniques electroforètiques, es a dir, es procura l’obtenció de substàncies pures.
L’electroforesi bidimensional acostuma a ser combinació dels 2
tipus d’electroforesis més resolutives:
- Electroenfocament-EEF 1ra dimensió
- PAGE-SDS 2na dimensió
ELECTROFORESI EN CAMPS POLSANTS (PFGE): aconsegueix la separació de grans fragments d’ADN
induint la seva reorientació mitjançant canvis periòdics en el camp elèctric.
La duració dels canvis periòdics dependrà de la mida dels fragments d’ADN, com més grans siguin
aquests, més gran haurà de ser la duració dels camps aplicats.
- En aplicar el camp inicial, els fragments s’estiren i orienten segons la direcció del camp.
- Després s’aplica un segon camp perpendicular que fa que els fragments d’ADN es relaxin i
s’alineïn segons aquest segon camp.
- La durada de cada pulsació pot anar des de fraccions de segon, per a fragments molt petits,
fins a una o dues hores per a fragments molt grans (> 5 Mb)

● Equip: per a realitzar una PFGE es diferencia notablement del d’altres electroforesis, tant en
la cubeta com en la font d’alimentació. En lloc d’un parell
d’elèctrodes, la cubeta en té un conjunt, de manera que la
seva disposició i disseny possibiliten les diferents
orientacions del camp elèctric.

IMMUNOELECTROFORESI: és una combinació d’una electroforesis en gels d’agarosa seguida d’una

inmunodifusió.
- Electroforesi en gel d’agarosa: es realitza una aplicació puntual de la mostra, i d’aquesta
manera al final les diferents proteïnes estaran distribuïdes al llarg del gel segons l’eix de
migració.
- Immunodifusió: una acabada l’electroforesi, amb un bisturí es un canal sobre el gel, que sigui
paral·lel a la direcció de migració i es diposita en aquest canal un antisèrum que contingui
anticossos específics front a una o diverses de les proteïnes separades en l’electroforesi.

● Els anticossos i les proteïnes (que actuen com a antígens) difonen, i si es troben en la
proporció adequada, produeixen complexes antigen-anticós insolubles que precipiten i
apareixen en el gel com a bandes el·lipsoïdals.
● La gran especificitat i sensibilitat de les reaccions de precipitació, permet diferenciar
substàncies amb mobilitats electroforètiques
idèntiques i detectar components que es troben en
concentracions mínimes, de l’ordre de micrograms.
S’usen molt en procediments d’inmunodiagnòstic.

ELECTROFORESIS CAPIL·LAR: És una tècnica que utilitza com a suport un capil·lar de diàmetre
intern molt petit de l’ordre de 75µm i 25 cm de longitud. Dins del capil·lar de separació es troba la
dissolució que conté les molècules que s’han de separar i el tampó encarregat de conduir el corrent.
Entre els dos extrems del capil·lar s’aplica una diferència de potencial d’alt voltatge (uns 500 V) que
farà que les molècules es moguin cap un extrem del capil·lar i se separin unes d’altres segons la seva
mobilitat electroforètica
- L’ús de l’alt voltatge permet:
 - un augment de la solució
- un temps d’anàlisi més curt
- menor consum de mostra i de reactiu

- És una tècnica electroforètica molt versàtil ja que es pot usar per a separar qualsevol tipus
de compost sempre i que elegim correctament el detector. S’hi pot acoblar un detector UV,
de fluorescència, un espectròmetre de masses, etc.

4.- SEPARACIÓ A PARTIR DE LA SOLUBILITAT

Les separacions a partir de la solubilitat utilitzen la diferència de solubilitat dels soluts en un mateix
dissolvent. En veurem dos tipus:

4.1.- Les extraccions amb dissolvents.

Les Tècniques d’extracció amb dissolvents s’utilitzen per a l’obtenció de macromolècules, per tant
tenim:
- L’extracció de lípids: Es duu a terme pel procediment de Folch, en el qual s’utilitza una
barreja de cloroform i de metanol. Els lípids es dissolen en el cloroform, després s’elimina el
cloroform per evaporació i es recuperen els lípids.
- L’extracció d’àcids nucleics (procediment):
● Afegim una solució de lisis per degradar les proteïnes i el ARN.
● Centrifuguem, retirem el precipitat i recollim el sobrenadant.
● Afegim etanol per fer precipitar el ADN.
● Centrifuguem i obtenim el precipitat que serà ADN de gran puresa.
- L’extracció de glúcids: mitjançant diferents tècniques que eliminem les proteïnes, àcids
nucleics i lípids presents, la majoria acaben amb una cromatografia.
- L’extracció de proteïnes: tècniques de centrifugació per separar les proteïnes solubles de les
unides a membranes; seguidament s’apliquen mètodes com la precipitació salina, que
provoca una separació de proteïnes concretes augmentant la força iònica del medi.

4.2.- Les cromatografies.

Les cromatografies són tècniques de separació de mescles per al seu estudi, que es basen en la
diferent interacció de les molècules que la formen amb una substància.

- Objectiu:és determinar la identitat i la concentració dels components d’una mescla (anàlisi

qualitatiu i anàlisi quantitatiu).

● De forma general, consisteix en col·locar la mostra sobre un suport (fase estacionària) i

submergir-la en un dissolvent adequat (fase mòbil).
● Els components de la mostra migraran sobre el suport segons la seva afinitat per la fase
mòbil o la fase estacionària. A l’igual que en l’electroforesi, s’obté una separació visible sobre
el suport.

Una possible classificació seria:

● Segons el tipus de contacte entre la fase mòbil i estacionaria:
 - Plana, en paper o en capa fina
- en columna
● Segons l’estat de les fases:
- Líquids: HPLC (cromatografia líquida d’alta eficàcia)
- Gasos: gas-líquid o gas-sòlid
- Fluids supercrítics
● Segons la interacció de les molècules amb la fase estacionària
- D’adsorcio
- De repartiment
- D’intercanvi iònic
- De penetrabilitat
- D’afiniat