‭ iologia Molecular:‬‭estudia la composició, l’estructura‬‭i funció de les molècules biològicament‬

B
‭importants (àcids nucleics i proteïnes), així com els processos en els quals estan implicats.‬

‭ itogenètica:‬‭es considera com a part de la genètica‬‭que estudia l’estructura, funció i el comportament‬

C
‭dels cromosomes en la metafase.‬

‭ a tècnica bàsica que es dur a terme en un laboratori de BM és la reacció en cadena de la polimerasa‬

L
‭(PCR).‬

‭ CR:‬‭es tracta d’una tècnica de laboratori que ens‬‭permet a partir d’una quantitat mínima d’ADN,‬
P
‭obtenir milers de còpies idèntiques en aquesta (aquest procés es denomina amplificació de l’ADN).‬

‭EQUIPAMENTS ESPECÍFICS DE BIOLOGIA MOLECULAR:‬

‭1.‬ T ‭ ERMOCICLADOR:‬
‭Permet realitzar de forma automatitzada i seqüencial els cicles de temperatures necessaris per dur a‬
‭terme la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) d'amplificació d'ADN.‬

‭2.‬ E ‭ QUIP D'ELECTROFORESIS:‬

‭Serveix per separar molècules d'àcids nucleics de diferents mides. A més, permet analitzar els‬
‭productes amplificats en una PCR o bé purificar i obtenir fragments de mides concretes d'ADN.‬

‭ 'electroforesi es duu a terme aplicant un camp elèctric en una dió tampó, en què se submergeix‬
L
‭una matriu que conté les mostres d'AN. Aquests migren amb major o menor velocitat a través de la‬
‭matriu en funció de la seva càrrega neta, mida i estructura tridimensional.‬

‭ a matriu que s'utilitza depèn de la mida de les molècules que volem separar i de la resolució que‬
L
‭volem obtenir poden, per això poden ser:‬

‭-‬ ‭ els d'agarosa‬‭, tenen menor poder de resolució i s'utilitzen‬‭per separar molècules més‬
G
‭grans.‬
‭-‬ ‭Gels de poliacrilamida‬‭, tenen més poder de resolució‬‭i s'utilitzen per separar molècules més‬
‭petites.‬

‭ a localització final dels AN al gel es realitza amb un agent intercalant fluorescent com el‬‭bromur‬
L
‭d'etidi‬‭(s'utilitza per tenyir l'ADN per revelar la‬‭seva posició al gel, aquest agent és cancerigen per‬
‭això es va substituir pel Redsafe).‬

‭3.‬ D ‭ OCUMENTADOR DE GELS:‬

‭És un equip que permet visualitzar les bandes d'AN al gel, després de l'electroforesi i obtenir una‬
‭fotografia.‬

‭-‬ ‭ ransil·luminador:‬‭consisteix en una font de llum‬‭ultraviolada que quan il·lumina el gel,‬

T
‭l'agent intercalant emet fluorescència, de manera que es poden visualitzar les bandes.‬

‭-‬ ‭ àmara fotogràfica o sistema de captació d'imatges:‬‭permet visualitzar el gel a la‬

C
‭pantalla d'un monitor.‬

‭ al destacar que també s’inclouen els aparells automàtics necessaris per a la realització de processos‬
C
‭específics com ara: l’‬‭extracció dels àcids nucleics‬‭i la seqüència dels fragments que són objecte‬
‭d’estudi (‬‭seqüenciadors‬‭).‬
‭EQUIPAMENTS GENÈRICS DE BIOLOGIA MOLECULAR:‬

‭1.‬ C
‭ ABINES DE BIOSEGURETAT DE CLASSE II:‬‭Protegeixen‬‭de la contaminació la persona, la‬
‭mostra i el medi ambient. És molt útil quan es treballa amb ARN (ja que les ARNasa són‬
‭omnipresents i el poden degradar) i amb cultius cel·lulars.‬

‭2.‬ S
‭ ISTEMA DE PURIFICACIÓ D’AIGUA:‬‭És imprescindible‬‭per un laboratori (BM) l’obtenció d’aigua‬
‭purificada de classe II i agua ultrapura II.‬

‭3.‬ E
‭ SPECTROFOTÒMETRE:‬‭Mesura la concentració d'AN i la‬‭puresa. Requereix lectures d'absorció a‬
‭un rang de longituds d'ona compreses entre 230 i 320 nm.‬

‭4.‬ M
‭ ICROSCÒPI DE LLUM TRANSMESA I FLUORESCÈNCIA:‬‭Són‬‭imprescindibles per interpretar‬
‭les tècniques d'hibridació in situ fluorescent (FISH).‬

‭5.‬ A
‭ UTOCLAU:‬‭És imprescindible per treballar amb microorganismes‬‭(és un recipient de pressió que‬
‭fa una esterilització amb vapor d'aigua).‬

‭6.‬ I‭NCUBADOR O ESTUFA:‬‭Aquests depenen de les mostres‬‭que s'estudien i de les tècniques que‬
‭s'apliquen. Per exemple, amb bacteris es necessiten estufes de cultiu i amb cultius cel·lulars es‬
‭requereixen incubadores amb CO2.‬

‭7.‬ B
‭ ANY TERMOSTÀTICA:‬‭És bàsic per fer tot tipus d'incubacions,‬‭digestions i tractaments‬
‭enzimàtics.‬

‭8.‬ ‭CENTRIFUGADORA i MICROCENTRIFUGADORA.‬

‭9.‬ G
‭ ELERES i CONGELADORS DE -20℃ i -80℃.‬‭És important‬‭per conservar els reactius (enzims) a‬
‭-20‬‭℃‬‭i mostres d’ADN i ARN a -80‬‭℃.‬

‭10.‬‭ALTRES EQUIPAMENTS:‬‭balança (per pesar reactius),‬‭agitadors magnètics (per a preparació de‬

‭reactius), vòrtex (per homogeneïtzar mostres i reactius), pHmetre…‬

‭ESTRUCTURA DEL LABORATORI DE BM:‬

‭1.‬ ‭SALA DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS:‬

‭-‬ ‭Àrea neta (sense ADN), s'hi preparen tots els reactius que s'utilitzaran.‬
‭-‬ ‭Els reactius no s'han de contaminar amb ADN, per això la sala ha de tenir una lleugera‬
‭pressió positiva (per evitar l'entrada de qualsevol font de contaminació). Ús de la cabina de‬
‭bioseguretat.‬

‭2.‬ ‭SALA DE PREPARACIÓ DE MOSTRES I EXTRACCIÓ D’ADN.‬

‭-‬ ‭Sala bruta (amb ADN). La sala amb una lleugera pressió negativa (evitar fuga material‬
‭contaminant).‬
‭-‬ ‭Ha de tenir: cabina de bioseguretat + espectrofotòmetre.‬

‭3.‬ ‭SALA DE PCR‬

‭-‬ ‭Disposa de termociclador (PCR) + espai per afegir-hi mostres d'ADN.‬

‭4.‬ ‭SALA POST-PCR‬

‭-‬ ‭Sala bruta, té una font important de contaminació per productes amplificats, per això ha de‬
‭constar d'una lleugera pressió negativa.‬
‭-‬ ‭Disposa de kit electroforesi + documentador de gel.‬
‭ 'estructura del laboratori de BM està condicionada per la tècnica de PCR que implica: preparar‬
L
‭reactius, extracció i purificació d'ADN de les mostres, reacció d'amplificació i l'anàlisi de productes‬
‭amplificats per electroforesi i documentadors de gel.‬

‭-‬ ‭ adascuna d’aquestes reaccions s’ha de realitzar en una àrea de treball independent,‬
C
‭separades físicament, amb el seu propi equipament i material de treball.‬

‭-‬ ‭ er evitar la contaminació de les mostres, cal tenir molt present el flux de treball que és‬
P
‭unidireccional (des de les àrees netes cap a les brutes).‬

‭-‬ ‭ ondicions de treball: ús de bons hàbits de treball en condicions d'esterilitat basats en la‬
C
‭tècnica asèptica + control exhaustiu fent controls negatius en totes les tècniques.‬

‭CONTAMINACIÓ:‬
‭ s l’introducció accidental a les mostres de material exògen que n'altera la puresa. Això provoca‬
É
‭resultats erronis o no interpretables. Els dos tipus més contaminants són: AN (extranys a la mostra) i‬
‭enzims (degraden AN i nucleases).‬

‭FONTS DE CONTAMINACIÓ:‬

‭1.‬ ‭CREUADA:‬
‭-‬ ‭Material no amplificat del medi ambient o microorganismes ambientals. Per‬
‭exemple, els aerosols generats durant la manipulació de les mostres.‬
‭-‬ ‭Contaminants procedents del propi personal tècnic de laboratori.‬
‭-‬ ‭Contaminants de les superfícies de treball.‬

‭2.‬ ‭PER AMPLIFICACIÓ DELS PRODUCTES AMPLIFICATS:‬

‭-‬ ‭Generats mitjançant PCR al propi laboratori (carryover)‬

‭3.‬ ‭DELS REACTIUS COMERCIALS I DEL MATERIAL FUNGIBLE:‬

‭-‬ ‭Això és perquè la majoria dels fabricants garanteixen l'esterilitat dels seus‬
‭productes, però alguns mètodes d'esterilització no garanteixen l'eliminació de l'ADN‬
‭dels microorganismes ni la inactivació dels enzims (ARNasas).‬

‭ ÈCNICA ASÉPTICA :‬
T
‭Conjunt d'activitats destinades a prevenir la contaminació per microorganismes, AN i nucleases. Té un‬
‭doble objectiu, prevenir la contaminació de la mostra i evitar la contaminació del tècnic per productes‬
‭biològics i químics perillosos.‬

-‭ ‬ ‭ entat de mans.‬
R
‭-‬ ‭EP‬‭I‬‭(bata, guants i mascarilla).‬
‭-‬ ‭Descontaminació de superfícies‬‭, amb el mètode físic‬‭(irradiació UV) o amb el mètode‬
‭químic (rentat amb solucions d'hipoclorit sòdic a 10% o descontaminants comercials).‬
-‭ ‬ ‭Prevenció de carryover‬‭(flux unidireccional de les‬‭mostres).‬
‭-‬ ‭Prevenció de la contaminació ambiental‬‭(cabina de‬‭bioseguretat de classe II, ús de‬
‭puntes de micropipetes especials amb filtre).‬
‭EL LABORATORI DE CITOGENÈTICA I CULTIUS CEL·LULARS:‬
‭●‬ L
‭ aboratori de cultius cel·lulars:‬‭se centra en el‬‭creixement de les cèl·lules eucariotes‬
‭d'organismes pluricel·lulars en medis de cultius artificials en condicions controlades.‬

‭●‬ L
‭ aboratori de citogenètica:‬‭se centra en l'estudi‬‭de‬‭cromosomes eucariotes‬‭, en concret es‬
‭dedica a l'estudi de cromosomes humans tant a nivell morfològic (cariotip) com molecular.‬

‭EQUIPAMENTS ESPECÍFICS:‬

‭ ultius‬
C ‭1.‬ C
‭ abina de flujo laminar:‬‭és on es realitzen tots els‬‭processos i manipulacions dels‬
‭cel·lulars‬ ‭cultius cel·lulars cel·lulars (preparació de medis, sembra de cultius…)‬

‭-‬ ‭ abina de bioseguretat de classe II,‬‭evita la contaminació‬‭del cultiu i‬

C
‭protegeix el treballador i el medi ambient.‬

‭2.‬ I‭ncubadora de CO2:‬‭proporciona les condicions ambientals‬‭òptimes per el creixement‬

‭de les cèl·lules en el medi de cultius.‬

‭ .‬ M
3 ‭ icroscòpi invertit:‬‭s’utilitza per controlar i observar‬‭el creixement dels cultius.‬
‭4.‬ ‭Equip de criogenia:‬‭permet conservar a llarg termini‬‭i en forma viable mostres de‬
‭cèl·lules i línies cel·lulars.‬

‭ ècniques de‬ ‭1.‬ E

T ‭ quip d’anàlisi d’imatge:‬‭és bàsic per documentar‬‭i analitzar metafases, per obtenir un‬
‭citogenètica‬ ‭cariotip. Consta d'un microscopi convencional i una càmera digital.‬

‭ .‬ S
2 ‭ oftware específic:‬‭per analitzar metafases.‬
‭3.‬ ‭Microscòpi òptic convencional y de fluorescència:‬‭s’utilitza per el recompte de‬
‭cèl·lules, estudis de viabilitat, visualització d'hibridació in situ fluorescent (FISH).‬

‭ enèrics‬
G ‭1.‬ E
‭ quip d’esterilització:‬‭és imprescindible l'esterilització‬‭de materials (autoclau) i dels‬
‭(comú)‬ ‭reactius i les solucions que s'utilitzin (sistema de filtració).‬

‭ .‬ S
2 ‭ istema de purificació d’aigua:‬‭per preparar reactius‬‭i medis de cultius.‬
‭3.‬ ‭Gelera i congeladors de -20℃ i -80℃:‬‭per conservar‬‭reactius.‬
‭4.‬ ‭Altres equipaments:‬‭centrífugues, placa calefactora,‬‭pHmetre, balança, agitador‬
‭magnètic, micropipetes…‬

‭ESTRUCTURA DEL LABORATORI DE CITOGENÈTICA‬

‭1.‬ S
‭ ALA DE CULTIUS:‬‭Sala neta, on es realitzen tots els‬‭procediments directament relacionats amb el‬
‭cultiu cel·lular. Ha de tenir: cabines de flux laminar, incubadores i microscopi invertit.‬

‭2.‬ S
‭ ALA DE LABORATORI CONVENCIONAL:‬‭Sala bruta, on es‬‭realitzaran tots els procediments que‬
‭no estan relacionats directament amb el cultiu cel·lular, com la preparació d'extincions, tincions,‬
‭cariotips…‬

‭3.‬ ‭SALA DE FRED:‬‭sala separada de la sala de cultius,‬‭perquè els congeladors generen turbulències.‬
‭TÈCNICA ASÉPTICA EN UN LABORATORI DE CITOGENÈTICA:‬

-‭ ‬ ‭ entat freqüent de mans.‬

R
‭-‬ ‭Ús de guants i bates‬‭d'un sol ús estèrils.‬
‭-‬ ‭Ús exclusiu de‬‭material i reactius estèrils.‬
‭-‬ ‭Manteniment programat de les‬‭cabines.‬
‭-‬ ‭Accés restringit‬‭a la sala de cultius, excepte el‬‭personal que estigui fent algun‬
‭procediment.‬
‭-‬ ‭Totes les‬‭manipulacions‬‭es fan dins de la cabina de‬‭flux laminar.‬

‭LA SEGURETAT EN UN LABORATORI:‬

‭ EGURETAT:‬‭fa referència a la prevenció de l'exposició‬‭del personal a agents nocius i també a‬

S
‭impedir-ne l'alliberament a l'exterior.‬

‭En funció de la naturalesa d'aquests agents, la seguretat pot ser:‬

‭‬ B
● ‭ iològic o bioseguretat:‬‭prevenció davant de patògens‬‭i toxines.‬
‭●‬ ‭Química:‬‭prevenció a l’exposició d'agents químics.‬

‭ ioseguretat d’un laboratori:‬‭engloba les normes, les tècniques, les pràctiques i els hàbits de treball‬
B
‭que‬‭intenten evitar l'exposició accidental‬‭(no intencionada)‬‭del personal a agents biològics‬
‭potencialment perillosos (patògens i toxines)‬‭o el‬‭seu alliberament al medi ambient.‬