UF1 BIOLOGIA MOLECULAR

EXTRACCIÓ I ELECTROFORESI DNA

1. EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ ADN GENÒMIC

Introducció
•La major part de les investigacions bioquimiques requereixen de la purificació de l'ADN.
•Primers procediments de purificació de DNA genòmic eren llargs, tediosos i reactius altament
tòxics i mutagènics.
• Avui dia, podem obtenir suficient DNA de bona qualitat en unes hores.
•És més difícil treballar amb ARN que amb ADN, ja que és més inestable (gran abundancia de
ARNases que el degraden ràpidament).

Extracció DNA genòmic

L'extracció de l'ADN com a matéria primera en biotecnologia serveix per a:
- Caracterització de mostres/d'empremtes dactilars d'ADN (fingerprinting)
- Clonació de gens
- Diagnòstic clínic
- Estudiar els efectes del genoma en la regulació i expressió de gens

Quin tipus de cèl·lules fem servir?

EI DNA es pot aïllar de quasi qualsevol tipus de cèl·lula.
• Els limfòcits i les cèl·lules de la mucosa de la boca dels humans són les que més s'utilitzen
per diagnostic.
• No es poden extreure dels eritròcits o RBC (red blood cell) perquè no tenen nucli.
• Però també s'utilitzen cèl·lules de la pell, del cuir cabellut, semen per anàlisi forensics.

Etapa prèvia a l'extracció

• Les cèl·lules són aïllades de qualsevol fluid ( sang, femtes, semen, teixit, hisop rectal, hisop
nasal, etc ) per centrifugació a altes velocitats (separació de les cèl·lules del plasma).
• El pellet s'han de resuspendre en una solució tamponada.
• El tampó serveix per mantenir el pH.

2. ETAPES
Existeixen diversos protocols adaptats a les característiques de cada mostra, ja sigui animal,
vegetal o cultiu bacteria.
1. Trencament cel lular
2. Purificació o precipitació proteica
3. Precipitació del DNA o RNA
Trencament cel·lular
Destrucció de la membrana lipídica. Es poden fer servir diverses técniques:
- Lisi cellular: s'afegeix tampó de lisi (conté detergent, SDS) al pellet i es resuspen.
Posteriorment, la mostra es deixa incubar un cert temps (normalment 30 a 60 minuts) a
temperatura ambient o a 37°C. Métode valid per a cel.lules sense paret cel.lular com la
dels teixits animals, però no és adient per a cèl.lules vegetals
- Destrucció mecanica: molins, premsa French
- Congelació/descongelació

Purificació o precipitació proteica

- S'afegeix tampó de precipitació de proteïnes (que conté proteinasa K).
- Les proteÏnes precipiten
La proteinasa K a diferència d'altres enzims és capaç de mantenir-se activa a altes
temperatures, per tant l solució es pot escalfar a 55 °C per ajudar a inactivar les proteïnes i a
degradar el detergent.

Precipitació de l'ADN
Per a la precipitació de l'ADN s'utilitza :
- Una sal (acetat d'amoni o NaCl)
- Un alcohol al 100% ( isopropanol).
A l'afegir un alcohol o una sal, es trenquen els ponts d'hidrogen entre l'ADN i l'aigua, i aquest
precipita.

El DNA s'extreu amb l'ajuda d'una vareta agafant els trossos allargats. Es poden afegir
elements quelants (EDTA) per segrestar cations Mg 2+
Ca2+ i impedir a les DNAases que degradin el DNA.

- Per rentar l'ADN i ajudar a eliminar l'isopropanol s'afegeix etanol 70%.

- El DNA obtingut es resuspen en un tampó d'hidratació (tampó Tris-EDTA pH 8).

3.PLASMIDIS
Un plasmidi és un fragment circular d'ADN de doble cadena que està fora del cromosoma
bacteria i que conté uns pocs gens. Els bacteris utilitzen aquest ADN accessori per a
intercanviar gens que els confereixen resistència al medi on viuen, el cas més típic és la
resistència a antibiòtics.

En la divisió del bacteri, aquest realitza una còpia idèntica del plasmidi (replicació) de forma
independent de la copia del cromosoma. Aquesta copia es transmet a la cèl·lula filla.
Purificació dels plasmidis.
Quan es necessita produir un plasmidi en quantitat, es fa créixer el bacteri amb el plasmidi de
forma massiva en un mitjà de cultiu líquid (generalment LB) amb l'antibiòtic de selecció per a
després purificar l'ADN plasmídic.

Existeixen diversos mètodes de purificar ADN plásmidic però avui dia la majoria dels laboratoris
usen Kits comercials (Qiagen, Invitrogen o Promega) degut a la seva senzillesa i eficacia.

Aquests Kits es basen en columnes de silica que són capaces d'unir especificament ADN.

● Llisi trencament de la cèl·lula

● Precipitació de proteïnes i altres components no desitjats.

El sobrenedant amb ADN es fa passar per la columna de silica (l'aïllament del DNA plasmídic es
basa en la diferencia de mides entre el DNA genomic i el DNA plasmídic.

Primer es desnaturalitza i desprès ràpidament es renaturalitza. Com el DNA plasmídic és petit,

torna a la seva forma inicial molt més ràpidament, mentre que el DNA genomic, al ser més gran,
triga més en renaturalitzar-se i precipita.)

ADN Plasmídic
Els plasmidis tenen 3 conformacions :
- super enrotllada (supercoiled)
- circular
- lineal
De forma natural l'ADN plasmídic és una molècula superenrollada.

• L'ADN superenrotllada (supercoiled) està doblegat en si mateix i té una estructura més

condensada i enredada que el mateix ADN quan està relaxa

-L'ADN purificat té una estructura superenrrollada, per l'acció d'uns enzims anomenats
topoisomerases.

-L'ADN plasmídic superenrotllat purificat no és estable com les formes circulars o relaxades, i
amb el temps i lentament, desenvolupa nicks i es converteix en circular.

4.ELECTROFORESI EN GEL D’AGAROSA

Aquests gels presenten les següents característiques:
- Inert i transparent
- Més sensible que l'acrilamida als efectes del pH i temperatura resistència mecanica
menys
- Resistent a agents desnaturalitzants (com NaOH o formaldehid que trenquen els
enllaços de H del DNA
•Les molécules d'ADN, amb carrega negativa tindran tendència a desplaçar-se cap el pol
positiu, però en funció de la mida del fragment d'ADN la molécula avançarà mes o menys.

•De manera que els fragments d'ADN més petits seran els que més es desplacin i en canvi els
més grans seran els més retinguts

En funció de la mida dels fragments d'ADN que es vulgui visualitzar, el tant per cent d'agarosa
variarà.

Enzims de restricció

S'utilitza per determinar el pes molecular.

- L'ADN pot ser digerit amb un enzim de restricció que tallarà l'ADN en Iloc especifics.
- A continuació, els fragments obtinguts de la digestió podran ser separats mitjançant
l'electroforesi en gel d'agarosa, obtenint mapes de restricció.

Identificació per tinció

Per visualitzar l'ADN a l'electroforesi, s'utilitzen diversos productes:
• bromur d'Etidi: emet fluorescència amb Ilum UV
• blau de Coomassie
• Sybr Save
• Dabablue

que s'intercalen entre les bases nucleotídiques i permeten veure els fragments de DNA per
fluorescència.

A la práctica, farem servir GEL SAFE al preparar els gels d'agarosa. Emet llum fluorescent de
color verd quanes trova Iligat al DNA o RNA (emissió maxima del GELSAFE es troba a 537 nm).