Celia Flores

Memòria de Pràctiques : MP03-UF2: Biologia Molecular

1- Pràctica d’extracció d’ADN de sang perifèrica i amplificació de fragments de
PCR
1. Quina és la concentració d'ADN de la teva mostra? quina qualitat té?

1’4 ng/ul qualitat òptima.

2. Mix i programa de PCR utilitzat? Hem fet un mix amb Tp10X amb MgCl2, dNTPs 2mM, Primer
Mix, H2O, TaqGold i el DNA. El programa de PCR utilitzat es de 2,5 hores, 10’ a 95Cº, 40 cicles de
45’’ a 95ºC, 45’’ a 60ºC, 1’ 30’’ a 72ºC, 10’ a 72ºC i mantenir a 4ºC.
3. Resultats de la PCR. Suma la imatge i la descripció de cada carril.

4. Ha funcionat la PCR?, Perquè?

No ha funcionat, teòricament com no veiem banda a cap de les mostres ha passat o bé una
degradació del DNA o que no hi havia suficient concentració del DNA de la mostra.

5. Si no fos així, que creus que podria haver passat?

Veuríem bandes, fins a 5 per cada mostra segons els loci detectats per la pcr, a 100,200, 300, 400 i
600 pb.

6. Dona una explicació lògica i raonada a les següents situacions

a. No apareix cap banda a cap pou : error en el gel d’agarosa, concentració o components.

b. Al control positiu no apareix banda (a la resta de mostres sí) : hi ha algun problema a la

mix de pcr.
 c. Apareix una banda no esperada a totes les mostres, inclús al control negatiu:
contaminació de les mostres, no s'ha realitzat correctament la mix de PCR o s’ha detectat
com a banda dímers de primers,etc.

2- Pràctica Clonació del Plasmidi Puc19 en E.coli:

1. Què és la transformació bacteriana? La transformació bacteriana és el procés mitjançant el

qual una soca de bacteris és capaç captar molècules d’ADN presents en el medi extern.
2. Què vol dir que un bacteri és competent? El bacteri competent es aquell que pot realitzar la
transformació bacteriana. La competència d’un bacteri es dona normalment en la fase
exponencial, gracies a la qual s’intercanvia material genètic entre individus.
3. Què és un vector de clonació? Són molècules d’ADN que poden replicar-se autònomament
en una cèl·lula hoste i que permeten la inserció d’ADN estrany sense perdre la capacitat de
replicació autònoma.
4. Quines són les parts del pUC19 que el converteixen en un vector de clonació?
- L’origen de replicació: que permet replicar-se en la cèl·lula hoste junt amb el fragment
d’ADN estrany que transporta.
- Lloc d’inserció: seqüencies diana de enzims de restricció, per possibilitar la inserció del
ADN estrany. Quan les seqüencies diana es concentren en un segment curt del vector
s'anomenen polylinker o sitio multiple de clonacion.
- Marcador de selecció: que permet distingir les cèl·lules que porten el vector de clonació
d’aquelles que no la porten, normalment gens de resistència a antibiòtics o gens que
codifiquen enzims que no te de manera natural la cèl·lula hoste. En el cas del Puc19: gen
de resistència a l’ampicilina i el gen LacZ que codifica per l’enzim beta-galactosidsa quan
l’IPTG és present al medi, per tant, degrada un anàleg de la lactosa (X-gal) i es veuen de
color blau.
5. Resultats de la clonació. Suma la imatge del gel d’agarosa i la descripció de cada carril.
Quantes bandes has obtingut en cadascun dels carrils del gel? Quantes n’hauries d’haver
obtingut? Per què?
 Només s’ha obtingut dues bandes als carrils on hem posat el marcador de pes molecular:

Els resultats esperats serien:

- Mostra 1 amb l’enzim de restricció Ecori: una banda a 2686 pb.

- Mostra 2 amb l’enzim de restricció Scal: una banda a 2686 pb.
- Mostra 3 amb els dos enzims de restricció: dues bandes, una a 1783 pb i l’altre a 903 pb.

Quan només hi ha un enzim de restricció obtenim el mateix ja que tallem el ADN per un lloc i
obtenim 1 fragment, que sempre mesura 2.686pb. En canvi, si introduïm dos enzims de
restricció obtenim dos fragments de diferents pb.

6. En cas que no hagis obtingut bandes en un carril, raona què pot haver passat en el
procediment que expliqui el resultat que has obtingut.

La possible explicació a la no obtenció de bandes en les mostres però si al marcador de pes

molecular es que la quantitat o concentració de DNA de la mostra carregada al gel fos
insuficient o que s’hagi degradat el DNA.

7. Respon breument Després de la transformació dels bacteris DH5alfa amb el plasmidi

pUC19 els sembrem en dos tipus de plaques, les unes amb X-gal i IPTG i les altres sense X-
gal i IPTG. Tots dos tipus de plaques tenen ampicil·lina.
 a) Per què hem posat ampicil·lina a les plaques de LB-agar? Per que creixin només els
bacteris clonats (amb el plasmidi) ja que seran els que tindran resistència a l'ampicil·lina.

b) Quin color tenen les colònies obtingudes a les plaques amb X-gal i IPTG i per què? No es
veien blaves, encara que deurien . Perquè el X-gal i IPTG son l’enzim i el substrat que
reaccionen quan el plasmidi puc10 que te el gen LacZ està en contacte, fent virar el color a
blau. Aquest error pot ser degut a que vàrem afegir el X-gal i IPTG directament a les plaques
d’agar escampant-ho amb nansa de digralsky en comptes de afegir directament en el medi
fresc.

c) Quin color tenen les colònies obtingudes a les plaques sense X-gal i IPTG? No es veuen
blaves ja que estan sense l’enzim i substrat que fan que virin de color.

d) Totes les colònies obtingudes en aquestes plaques és d’esperar que hagin incorporat el
plasmidi? Per què? Si, ja que les quatre plaques obtingudes contenen ampicil·lina i per tant
si creix el bacteri es per que ha incorporat el plasmidi que te resistència a l'ampicil·lina.

8. Digereixo el pUC 19 amb l’enzim Ssp I, quants fragments se’m generaran i de quina mida?
Un fragment de 2.686 pb ja que només estem digerint amb 1 enzim de restricció, per tant
obtenim 1 fragment de la mida total del plasmidi tallat per el Ssp1.
9. On estan dins del pUc19 les dianes de restricció pels enzims EcoRI i ScaI utilitzats per a la
digestió del DNA plasmídic de la pràctica?

EcoRI: está a 396 pb al área LacZa.

Scal: está a 2179 pb al área del AmpR.