INFORME PREVI BLOC II MÒDUL MICROBIOLOGIA MOLECULAR 2020-21

Alumne: Maykal Ognyanov Iliev

Cas A: Datsenko and Wanner. 2000.

1. Descriu breument en què consisteix el sistema Lambda-Red recombinasa?

Aquest és un sistema de recombinació dels fags de forma homòloga que permet augmentar la taxa de
recombinació respecte la de certs mutants que fan servir DNA lineal. Requereix d’una λ Red (recombinasa
propia del fag) que és sintetitzada gràcies a un promotor induible en un plàsmid fàcilment eliminable i de
baixa còpia. El sistema presenta tres: γ, β i exo. Gam (inhibeix exonuecleasa V per permetre accés a Bet i
exo), Bet and Exo són els productes dels gens.

2. Detalla les característiques del plasmidi que conté la Lambda-Red recombinasa

pKD20 és el plasmidi seleccionat de nombre reduït de còpies i codifica per la Red recombinasa. Té una regió
de unió optimitzada del ribosoma per una traducció eficient de γ i expresa γ, β, and exo desd de el
promotor ParaB induible a través la arabinosa. I a més, a més és un replico termosensible cosa que permet
la seva eliminació sigui senzilla. També presenta una resistència a ampicil·lina i dianes de restriccion.

3. Enumera els elements que formen el fragment lineal que s’introdueix a la cèl·lula bacteriana per inactivar el
gen d’interès
El fragment lineal que s’introdueix a la cèl·lula bacteriana es un gen que codifica per una resistència
antibiòtica (útil per la selecció dels recombinats) i que es troba flanquejat per FRT (FLP recognition target),
també pot presentar zones d’interacció de primers útil per la comprovació per PCR.

4. Quina és la utilitat del plasmidi pCP20?

Es tracta d’un plasmid helper que te la utilitat d’eliminar les resistències als antibiòtics, que han sigut
afegides al DNA cromosòmic pel plasmid anterior. Aquest plasmidi helper presenta les regions FRT per tal
d’interaccionar amb els extrems de la resistència a antibiòtic que s’ha integrat al genoma i poder-la
eliminar. El plasmidi pCP20 pot ser eliminat de forma simple ja que es sensible a la temperatura, amb un
creixement a 37 graus centígrads aquest també és eliminat.

5. Ordena els passos necessaris per produir la inactivació d’un gen mitjançant el sistema Lamda-Red
recombinasa, indica la seqüència en el requadre.
A. Comprovació del creixement en plaques amb cloramfenicol de les cèl·lules electroporades amb el
fragment lineal
B. Transformació d’una casete de cloramfenicol amb cues de homologia amb el gen que es vol
inactivar.
C. Obtenció per PCR del fragment amb cues d’homologia amb el gen que es vol inactivar
D. Extracció del plasmidi pKD3
E. Incubació a 43ºC per eliminar el plasmidi pCP20
F. Comprovació del creixement amb ampicil·lina desprès de la transformació del plasmidi pCP20
G. PCR de comprovació de les colònies sensibles als antibiòtics
H. Transformació del plasmidi pKD20
I. Realització de rèpliques per comprovar l’eliminació de la resistència a ampicil·lina i cloramfenicol
J. Transformació del plasmidi pCP20
K. Incubació de les cèl·lules a 43ºC per eliminar el plasmidi pKD20
L. PCR comprovació colònies cloramfenicol resistents
M. Creixement de les cèl·lules amb presència d’arabinosa fins creixement en fase exponencial.

D,C,B,A,L,H,K,J,F,E,I,G,M
Cas B: Borloo et al., 2007
1. Descriu en què es basa el sistema doble híbrid descrit en aquest article.
El sistema de doble híbrid descrit en l’article es basa en la interacció de dues proteïnes funcionals i
complementaries amb truncaments no funcionals de la beta-galactosidasa.
Així s’impulsa l’activitat d’aquesta proteïna que abans de la hibridació no era funcional.
El reconeixement entre proteïnes es traduirà en una producció de betagalactosidasa funcional.

2. Descriu els elements que formen part dels plasmidis utilitzats en aquest sistema de doble híbrid.
Presenta seqüències de restricció BamHI i EcoRV, resistències a diferents antibiòtic: canamicina,
Presenta també un promotor taq que correspon a la taq polimerasa perquè presenten expressió autònoma
a l’expressió del genoma.
També presenten els fragments que corresponen a la zona de hibridació amb la seqüència que codifica per
beta-galactosidasa, per poder hibridar i fer-la funcional.

3. Ordena els passos a seguir per determinar la possible interacció entre dues proteïnes mitjançant aquest
sistema de doble híbrid. Indica l’ordre en el requadre corresponent.

A. Digestió dels plasmidis i desfosforilació

B. Seleccionar amb carbenicil·lina i cloramfenicol (per separat) i incubar a 37 oC
C. Lligació dels fragments de PCR dels gens d’interès i els plasmidis
D. Co-transformació dels plasmidis en soques de Escherichia coli (lacZ-)
E. Seleccionar amb cloramfenicol i carbenicil·lina i incubar a 37oC
F. Realització del assaig de Beta-galactosidasa
G. Digestió dels fragments de PCR dels gens d'interès amb primers amb dianes de restricció.
H. Transformació de les lligacions en soques de Escherichia coli i incubació a 37 oC
I. Extracció dels plasmidis
J. Cultiu de nit de la soca d’interès per demostrar producció de Beta-galactosidasa

B, A, G,C, H,E, I, D, J, F