Problema 4

Després clonar i seqüenciar el cDNA corresponent a un nou receptor de membrana denominat

BCN es considera que aquest està incomplet en el seu extrem 5‘ pel fet que té una seqüència 5'-
UTR molt curta. Per tal de clonar i caracteritzar la regió 5 'completa del cDNA es planteja la
utilització de la tècnica 5’-RACE.

A la Figura 1 s'indica la seqüència de nucleòtids del cDNA BCN (incomplet en el seu extrem 5'). A la
Figura 2 es mostra la regió de el gen BCN que suposadament podria contenir l'inici de transcripció
alineada amb la seqüència de nucleòtids de la regió 5‘ del cDNA BCN.

1. Indica els primers SP1, SP2 i SP3 que utilitzaries per obtenir el producte de 5'-RACE (mostra les
seves seqüències en sentit 5‘ > 3').

Després de completar tot el procés, el producte de RACE es va clonar en un vector plasmídic i

seguidament es va procedir a la seva seqüenciació. A causa de que l'equip de seqüenciació
automàtica estava avariat es va procedir a la seva seqüenciació manual mitjançant el mètode de
Sanger utilitzant un primer localitzat en el vector i flanquejant a el lloc de clonació (Figura 3). A la
figura 4 es mostra una representació esquemàtica de la autoradiografia corresponent a una regió
de el gel de poliacrilamida en la qual es mostren els fragments corresponents a les quatre
reaccions de seqüència realitzades (A, T, G i C).

Nota: La regió de el gel mostrada inclou únicament les bandes que permeten resoldre el problema.

2. Identifica el lloc d'inici de transcripció (nucleòtid +1) del gen BCN a partir d'aquestes dades.
Marca el nucleòtid +1 sobre la seqüència genòmica mostrada a la Figura 1A i justifica la resposta.
 Problema  5  
 
Tras  la  secuenciación  completa  del  genoma  de  un  organismo  X  se  identificó  un  gen  Y  
que   podía   tener   un   papel   esencial   en   el   desarrollo   de   dicho   organismo.   La  
secuenciación   de   un   clon   de   cDNA   correspondiente   a   dicho   gen   indicó   que   estaba  
constituido  por  5  exones  y  4  intrones  (ver  esquema).    

Início  de  
transcripción  

0,9 0,3 0,2 0,5 0,6 kb

E1 E2 E3 E4 E5
Los  números  indican  el  tamaño  (en  kb)  de  los  exones  (E1  a  E5)  
 
Con   el   fin   de   estudiar   el   patrón   de   expresión   de   dicho   gen   se   realizo   un   análisis  
mediante   northern   blot   de   muestras   de   RNA   aisladas   de   distintos   tejidos   del  
organismo   X   utilizando   el   clon   de   cDNA   como   sonda.   Se   observó   que   en   uno   de   los  
tejidos   analizados   se   detectaba   un   transcrito   de   2,0   kb   en   lugar   del   de   2,5   kb   presente  
en   el   resto   de   los   tejidos.   Estos   resultados   indujeron   a   pensar   que   en   este   tejido   en  
particular   se   producía   un   splicing   alternativo   del   transcrito   primario   del   gen   Y   que  
implicaría  posiblemente  a  los  exones  E2,  E3  y  E4  

 
1) Diseña  una  estrategia  para  identificar  los  exones  presentes  en  el  transcrito  de  
2  kb.  
   
2) Diseña  una  estrategia  para  determinar  si  el  transcrito  de  2,0  kb  se  transcribe  a  
partir  del  mismo  inicio  de  transcripción  que  el  de  2,5  kb.  
 
3) Diseña  una  estrategia  para  obtener  un  clon  de  cDNA  que  contenga  la  región  
codificante  del  transcrito  de  2  kb  
Problema  6  
 
Es  coneix  que  el  gen  ABC1  pot  generar  les  dues  variants  d’splicing  indicades  a  
continuació  

 
 
 
Per  tal  d’estudiar  l’expressió  de  les  dues  variants  d’splicing  (mRNA1  i  mRNA2)  en  
diferents  teixits  es  proposa  utilitzar  la  tècnica  de  protecció  a  la  RNAsa.    
 
Es  disposa  d’un  plàsmid  pBluescript  SK  recombinant  que  conté  el  cDNA  del  mRNA1  
clonat  entre  les  dianes  HindIII  i  EcoRI.  En  la  figura  1  es  mostra  la  seqüència  de  
nucleòtids  del  cDNA  present  en  el  plàsmid  pBluescript,  així  com  la  seva  
correspondencia  amb  els  exons  1,  2,  3  i  4.  S’indiquen  també  algunes  de  les  dianes  de  
restricció  existents    dins  del  cDNA.  En  la  Figura  2  es  mostra  el  detall  de  la  zona  del  lloc  
de  clonatje  múltiple  de  pBluescript  SK.  
 
 
A)  Dissenya  una  sonda  (ribosonda)  que  permeti  discriminar  els  mRNAs  1  i  2  i  fes  una  
representació  esquemàtica  indicant  la  mida  dels  fragments  protegits  en  cada  cas.      
 
B)  Indica  com  procediries  per  preparar  aquesta  ribosonda.  Fes  aqui  també  una  
representació  esquemàtica  del  procès  que  seguiries  i  argumenta  i  descriu  les  
diferents  etapes  del  procès.  
 
Disposes  de  tots  els  materials  i  equipaments  que  puguis  necessitar  (enzims  de  
restricció,  DNA  lligasa,  polimerases  T3  i  T7,  vectors,  síntesi  de  primers,    nucleòtids  
marcats  radioactivament,  Taq  polimerasa,  termociclador,  cubetes  d’electroforesi,  etc.)  
Figura  1.  Seqüència  de  nucleòtids  del  cDNA  corresponent  a  mRNA1.  Els  extrems  contenen  les  
seqüències  HindIII  i  EcoRI  utilitzades  per  clonar  el  cDNA  en  el  plàsmid  pBluescript.  S’indiquen  les  
seqüències  corresponents  als  exons  1,  2,  3  i  4.  S’indiquen  també  les  dianes  de  reconeixement  d’alguns  
dels  enzims  de  restricció  presents  en  el  cDNA.  Els  codons  d’inici  i  final  de  la  traducció    (ATG  i  TAA,  
respectivament)  estan  indicats  en  negreta  i  subratllats.  

 
Figura  2.  Detall  del  lloc  de  clonatje  múltiple  del  plàsmid  pBluescript  SK.