3.

3 Hibridació d’àcids nucleics

Quan s'escalfa un ADN de doble cadena
(forma nativa) es trenquen les forces
d'unió entre els dos filaments i acaben per
separar-se. Per tant, l'ADN desnaturalitzat
és d'una sola cadena. La transició entre
l'estat natiu i el desnaturalitzat es coneix
com desnaturalització.
En determinades condicions, una
dissolució d'ADN monocatenari
(desnaturalitzat), pot tornar a formar l'ADN
natiu (de doble cadena). Aquest procés rep
el nom de renaturalització de l'ADN.
Quan l'ADN renaturalitzat es forma a partir
de molècules d'ADN de diferent origen, o
entre una molècula d'ADN i una altra
d'ARN, la renaturalització es coneix com
hibridació.

La forma més corrent de desnaturalitzar l'ADN és per escalfament. Un altre agent

desnaturalitzant és el pH elevat perquè canvia la càrrega d'alguns grups que formen part
dels ponts d'hidrogen.

142
3.3.1 Factors que afecten l’estabilitat dels àcids nucleics
• Nombre de parells GC respecte dels parells AT: a major nombre d'enllaços
d'hidrogen entre els filaments, major estabilitat dels híbrids (3 enllaços d'H entre
G i C, 2 enllaços d’hidrogen entre A i T).
• Grau de complementarietat: a menor complementarietat de bases, menys
enllaços d'hidrogen formats i, per tant, menor estabilitat.
• Longitud dels filaments: a major longitud dels filaments, més enllaços d’hidrogen,
més interaccions hidrofòbiques entre les bases, major estabilitat de l'híbrid.
• Concentració de sal en la solució: ↑ [sal] ⇒ ↑ estabilitat de l'híbrid. Les
càrregues negatives dels grups fosfat es repel·leixen unes a altres. Els ions positius
en solució redueixen la repulsió electrostàtica entre els filaments, tant cations
monovalents (Na+) com divalents (Mg + +).
• Temperatura: La temperatura ha de ser prou alta per trencar els ponts d’hidrogen
formats entre diferents bases d’un filament monocatenari i prou baixa per que es
formin els ponts entre filaments diferents. Es representa per Tm la temperatura de
separació dels filaments (melting temperature) i és una mesura de l’estabilitat
dels híbrids. Hi ha diferents fórmules per a calcular el càlcul de la Tm:
o Per hídrids ADN-ADN:
Tm = 81,5 ºC + 16,6·log[Na] + 41·(%G+C) - 0,63·(%formamida) - (500/L)
o Per híbrids ADN-ARN:
Tm=79,8 ºC+18,5log[Na]+58,4(%G+C)+11,8(%G+C)2-0,5(%formamida) - (820/L)
o Per oligonucleòtids (de 10-12 nucleòtids) en 1 M Na+:
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) -4
• Agents desnaturalitzants: com la formamida i la urea, desestabilitzen l’híbrid

143
3.3.2 Detecció d’àcids nucleics
La detecció dels àcids nucleics es realitza mitjançant sondes marcades que ens permeten
revelar, mitjançant un senyal, la seva presència. Les sondes s’uneixen a fragments d’àcids
nucleics complementaris. Les tècniques més utilitzades són el Southern blot, el northern
blot i la hibridació in situ.

3.3.2.1 SOUTHERN BLOT

La tècnica consisteix a tallar el DNA amb enzims de restricció per produir fragments de
diferent grandària. Els fragments se separen per la seva grandària molecular mitjançant
electroforesis en gel d'agarosa i tinció amb bromur d'etidi. Els fragments són després
transferits a una membrana que actua com a filtre. Per això els gels es submergeixen en
una solució salina per desnaturalitzar l’ADN en filaments senzills. Els filaments
s'adhereixen al paper secant que els rep i accepta a causa de les seves propietats
químiques. Després els fragments es fixen (per UV) al filtre membranós i poden ser
hibridats amb una sonda marcada radioactivament i que tingui una seqüència
complementària a la del fragment en qüestió. Després de la hibridació, es renta el filtre i
els fragments es detecten per radioautografia o mitjançant fluorescència (en cas de
marcatge no radioactiu)
Com que la transferència de l'ADN del gel a la membrana es produeix per capil·laritat,
amb el mateix principi utilitzat durant anys per netejar taques amb paper secant, el
procés es coneix en anglès com blotting; Edwin Southern va proposar utilitzar el terme
blot (assecat) o blotting per referir-se a aquesta tècnica i actualment es coneix com
Southern blot.

144
3.3.2.2 NORTHERN BLOT
És similar a la tècnica anterior, però permet detectar RNA en comptes de DNA. En síntesi
la tècnica consisteix a extreure l'RNA de les cèl·lules pertinents i la seva posterior
separació per grandària mitjançant electroforesi en gel. Les molècules de RNA son
transferides i unides al filtre, igual que en el Southern blot. Després de la hibridació amb
una sonda marcada (i posterior a la detecció segons el mètode de marcatge utilitzat), les
bandes en el gel indiquen la ubicació dels tipus de RNA que siguin complementaris a la
sonda. Si es tenen marcadors de RNA de mida adequada, es pot conèixer la mida dels
RNA que s’han identificat. Així, la tècnica permet conèixer la mida precisa d'un mRNA,
després de la unió transcripcional. A més, serveix per identificar diferents tipus de mRNA
codificats per un mateix gen i per determinar la quantitat i el teixit específic (o tipus de
cèl·lules) en què es troba un mRNA específic. Així, serà possible determinar els nivells
d'activitat gènica, per exemple durant el desenvolupament, o bé en diferents teixits (o
tipus cel·lulars) durant un període definit de la vida, o després d'haver estat sotmès als
organismes a diferents estímuls fisiològics.

3.3.2.3 HIBRIDACIÓ IN SITU

Quan les sondes no s'utilitzen sobre àcids nucleics retinguts en una membrana per
transferència, sinó que es posen directament en contacte amb preparats citològics o
histològics, ens trobem davant el que es coneix com hibridació in situ. Aquesta modalitat
permet localitzar de forma molt precisa, a nivell de la cèl·lula o dels seus components, les
seqüències específiques complementàries de la sonda emprada.
La seva utilitat resideix en la capacitat de poder demostrar mitjançant la utilització d'una
sonda (formada per una seqüència d'ADN prèviament coneguda) marcada amb un isòtop
radioactiu o altra manera, la presència d’una determinada seqüència d'ADN o ARN
complementària, en la mostra a estudiar.
Aquesta tècnica és molt útil, per exemple, per identificar la seqüència de nucleòtids, en
determinades malalties d'origen genètic.

3.3.2.3.1 FISH
Dins de les tècniques d’hibridació in situ trobem la tècnica FISH (Fluorescent in situ
hybridization) . La FISH és una tecnologia recent que utilitza sondes de DNA marcades
amb un fluoròfor per detectar o confirmar anomalies gèniques o cromosòmiques que
generalment estan més enllà de la capacitat de resolució de la citogenètica de rutina. En
primer lloc, la mostra de DNA (cromosomes metafàsics o nuclis en interfase) es
desnaturalitza, procés que separa els filaments complementaris de l'estructura en doble
hèlix del DNA. A la mostra desnaturalitzada se li afegeix llavors la sonda d'interès,
marcada amb un fluoròfor, que s'associarà al DNA de la mostra en el lloc diana, en el
procés anomenat hibridació, on es torna a formar una doble hèlix. El senyal emesa per la
sonda s'observa mitjançant un microscopi de fluorescència i així la mostra de DNA es pot
classificar segons la presència o absència del senyal.

145
 Exemples de FISH d’interfase
(traduït de Interfase FISH Examples, Cytogenetics Information Site)

Aquest és un exemple de la prova d’aneuploïdia, on s'han combinat nuclis en interfase

procedents de cèl·lules de fluid amniòtic amb sondes de DNA dissenyades per als
cromosomes 13, 18, 21, X i Y. El nucli de l'esquerra s'ha hibridat amb sondes per als
cromosomes 13 (verd) i 21 (vermell). El nucli de la dreta s'ha hibridat amb sondes per als
cromosomes 18 (blau clar), X (verd) i Y (vermell). Com que hi ha dos senyals
corresponents a les sondes de 13, 18 i 21, i un sol senyal de cromosomes X i Y, aquest
fetus és un home, normal pel que fa a la prova d'aneuploïdia.

Aquesta altra prova d'aneuploïdia mostra un fetus femení amb trisomia 21. El nucli de
l'esquerra s'ha hibridat amb sondes dissenyades per als cromosomes 13 (verd) i 21
(vermell), i té clarament tres senyals vermelles. El nucli de la dreta s'ha hibridat amb
sondes dissenyades per als cromosomes 18 (blau clar), X (verd) i Y (vermell). Ja que
mostra dos senyals verds i cap vermella, és femení.

146