1

Veurem què son les tècniques d’hibridació i que n’hi ha de diferents tipus segons el
fonament del mètode que utilitzem.
A partir d’aquí, veurem que cada tècnica té uns avantatges respecte les altres i per
tant les aplicarem en funció del nostre objectiu.
Òbviament també haurem de saber interpretar cadascuna d’aquestes tècniques, ja
que en cadascuna es farà de forma diferent.

2
2’ per pensar en grup.
3’ per compartir idees amb la classe.

3
4
5
Denaturalització i renaturalizació: obertura i tancament de l’helix ADN.

S’utilitza la temperatura per obrir i tancar la molecula

També PH, ph acido desnaturaliza rompe puentes de hidrogeno, ph basico
renaturalización

6
7
8
Arn no necesita proces previ (desnaturalització) perq es una molecula
monocatenaris
adn doble cadena es desnaturalitza la cadena diana abans de fer hibridació

9
L’híbrid format entre SEQÜÈNCIA DIANA i SONDA, té les mateixes propietats que
una molècula bicentenària de DNA en quant a desnaturalització i renaturalització.

Com afecta el pH? Segurament un augment de pH implica un augment dels -OH,

que fan que es trenquin(debiliten) els ponts d’hidrogen.

DESNATURALITZACIÓ: És una propietat del DNA que consisteix en la separació de

les dues cadenes de la Doble hèlix, mitjançant el trencaments dels ponts H que hi ha
entre les bases nitrogenades complementàries.
La desnaturalització s’aconsegueix augmentant el pH o la temperatura de la mostra.
Això provoca el trencament dels enllaços.

RENATURALITZACIÓ: És el procés pel qual les dues cadenes d’una molècula de DNA,
que han estat separades per desnaturalització tèrmica, es poden tornar a unir.
Aquest procés s’aconsegueix baixant la temperatura lentament, fins a formar la
doble hèlix original. Perquè les dues cadenes s’uneixin s’han de trobar
aleatòriament. Per aquest motiu, quantes més cadenes simples tinguem, més
probabilitat de que 2 cadenes complementàries es trobin i la velocitat de
renaturalització també augmentarà.
Quan les dues cadenes es troben, la reassociació es dóna en dues fases:
1. NUCLEACIÓ: Fase lenta on les seqüències curtes de bases complementàries
s’uneixen formant ponts d’hidrogen.

10
2. TANCAMENT DE LA CREMALLERA: Fase ràpida on es produeix el tancament de
la cremallera i es forma la doble hèlix.
En el nostre cas d’hibridació, la doble hèlix es forma amb la seqüència diana i la
sonda marcada. També es pot fer amb molècules dobles de DNA sense hibridar.

10
La Tm és aquella en la que tenim el 50% de DNA desnaturalitzat.
La concentració de DNA en un estat o un altre ho medim a través de la concentració.
Medim amb l’espectro a 260nm i obtenim una corba de forma sigmoide que és la
corba de fusió. Veiem que al augmentar la T l’absorbància aumenta al augmentar
també la concentració de DNA (se separar i son dues cadenes enlloc d’una).

11
Factors que afecten a la desnaturalizació:
- Més longitud més temperatura de melting
- GC: més ponts hidorgen + necesitat de temperatura
Factors que influeixen a
- Concentració: moltes cadenes comp entre elles, més fàcil que s’ajunten.
- complexitat molècula: si te fragments dna repetits es més facil que hi hagin
xocs, que s'uneixin
(poc repetit: molt complexa, repetit moderat: complexitat mitja, molt
repetit: poc complexe)
La Tm d’un híbrid és la T a la que hi ha el 50% d’hibridació.
- FORÇA IÒNICA: Els Ac. nucleics tenen una càrrega negativa. Si hi ha ions
monovalents (+) al medi, aquests s’uneixen a la cadena, fent que no hi hagi
tanta repulsió entre càrregues. A més ca ons monovalents més Tm. → +
facil renaturalizació
- AGENTS DESNATURALITZANTS: Els agents desnaturalitzants com el DMSO o
la formamida desestabilitzen els ponts d’hidrogen. A més Ag desnaturalitzant
(Costarà més unir)menys Tm. → més facil desnaturalitzar
- % DE BN NO COMPLEMENTÀRIES: A més mismatch menys TM(para forzar la
unión de las bases hay que bajar Tm para forzar la unión). El mismatch té
més influència a més pe ta la sonda. → + facil renaturalització

15
- Les sondes de DNA són les més utilitzades, i les més fàcils d’obtenir en grans
quantitats. Actualment la majoria de sondes es comercialitzen com sondes de síntesi
química: son de mida petita i monocatenaries (no s’han de desnaturalitzar per
hibridar i la mida petita va bé per penetrar en hibridacions in-situ). Inconvenient:
baixa sensibilitat (pot incorporar poques molècules marcadores)

- Les de RNA son una mica estables, ja que l’hibrid DNA/RNA és lleugerament més
estable que el DNA/DNA. Inconvenient: son més sensibles a contaminacions, ja que
ARNases n’hi ha per tot arreu, l’estabilitat és més baixa i es pot degradar.

- Les sondes químiques sintètiques no tenen càrrega perquè no tenen grup fosfat
(la cadena és d’aminoetilglicina) i son estables perquè no es degraden.
Inconvenient: màxim 30 nucleotids, perquè son força més insolubles (sondes més
petites) que ADN o ARN (augmenta amb la mida).

Especificitat: Ex. Les ideals són sondes de més de 16 nucleòtids. Si són més petites
tenen una probabilitat molt elevada d’unir-se aleatòriament amb moltes
seqüències diana i dificultaria la detecció de la seqüència del nostre interès.

17
Macartge.
- Directe: és visaultiza directament
- Indirecte: he de fer un proces abans per poder visualtizar la molecula

18
Diferenciar els 3, després s’expliquen.

19
TECNICA DIRECTE
- Per detectar l’hibrid hem de fer una autoradiografia amb una pel·lícula de
raig X.
- 3H i 32P son els més utilitzats.
- Avantatge: és molt sensible.
- Inconvenient: Requereix infraestructures i instal·lacions adequades per
treballar amb radiació. S’ha de detectar amb autoradiografia
- La desintegració es dona de forma espontània
TECNICA DIRECTE
La fluorescència és la propietat d'una substància d'emetre llum quan és exposada a
radiacions del tipus ultraviolat, rajos catòdics o raigs X.
El fet de poder fer servir diferents sondes a marcades amb fluorocroms diferents fa
que puguem detectar diferents seqüencies diana a la vegada. Això és especialment
interessant per citogenètica.
Per fer la detecció es necessita un microscopi de fluorescència.

21
TECNICA INDIRECTE
Els haptens són molècules de mida petita que, igual que els fluorocroms, es poden
acoblar als nucleòtids sense alterar l’especificitat de la sonda. A diferència dels
fluorocroms, no poden ser detectats directament, sinó que calen mètodes indirectes
de revelat basats en l’afinitat química de les molècules o en mètodes immunologics.
Per millorar la sensibilitat es realitzen tècniques d’amplificació (fico més
anticossos)per augmentar la seva senyal. Per si sols no son visibles.

22
23
RECORDEU: NO VEUREM LES TÈCNIQUES EN MEDI LÍQUID. L’híbrid es forma en una
solució aquosa, normalment en una placa multipouets i després es fixa a la paret per
ser detectat. Són molt semblants als assaigs ELISA.

24
PREHIBRIDACIÓ: És la fase en que es preparen la mostra i el suport. En funció de
cada tècnica, es fan diferents passos que poden incloure digestions enzimàtiques,
electroforesis, transferències, bloqueig d’unions inespecífiques de la sonda.
HIBRIDACIÓ: Formació de l’híbrid entre la seqüència diana i la sonda marcada.
RENTAT POST HIBRIDACIÓ: Fase crítica. S’han de mantenir els híbrids que ens
interessen i eliminar els híbrids incorrecte/inespecifiques (no s’haurien d'haver
donat) que s’hagin pogut formar amb una seqüència diana similar a la que volem
trobar. Aquesta fase depèn de la especificitat de cada tècnica.
Per fer el rentat: Pujem la T, i en la solució tenim baixa concenctració salina i alta de
formamida. Podem fer que el renttat sigui més o menys restrictiu si modifiquem
aquestes concentracions.
Es fa realitzant rentats amb tampons que han de complir condicions de rigorositat.
DETECCIÓ DE L’HÍBRID: Detectem l’híbrid gràcies al marcatge de la sonda que pot
ser:
• RADIOACTIU: Marcatge emprat en tècniques amb suport sòlid.
• FLUOROCROM: Marcatge emprat en tècniques in situ (FISH) i suport sòlid
(microarrays).
• HAPTÈ: Marcatge emprat en tècniques amb suport sòlid e in situ. Es fan servir
anticossos antihaptè marcats amb fluorocroms o enzims que donen color.

25
 La diferència entres els de l’esquerra i els microarrays és, a part de que els primers
es valen de marcadors radioactius i el segon de fluorescents, que en els primers es
fixa la seqüència diana al suport i després s’incuba amb la sonda per formar l’hibrid i
el microarrays és al revés.

26
Tècnica d’hibridació simple que utilitza membranes de nitrocel·lulosa o nailon com a
suport sòlid i que permet detectar seqüències d’àcids nucleics (ADN o ARN). És la
forma més simple d’hibridació.
Es pot fer per haptens també (com en el video: s’afegeix reactiu i s’observa la
reacció lumínica o colorimètrica. En radioactiu es posaria la mb prop d’una placa
fotogràfica en un procés d’autoradiografia.

27
Aplicacions del dot blot:
Rastreo o screening para detectar secuencias de interés en múltiples muestras
simultáneamente:
-Estudios de expresión génica (detección de ARN en poblacions cel·lulars en situació
basal, després de rebre estímuls, en cèl·lules tumorals,...)
-Detección de secuencias extrañas (detecció de virus, bacteris, paràsits,...)
-Determinación del sexo en especies sin diferencias fenotípicas.

si hi ha puntets és que la sondra ha hibridat

28
El Southern Blot és una tècnica d’hibridació que permet identificar fragments d’ADN
separats per electroforesis en gel i transferits a una membrana de nitrocel·lulosa o
nailon.
A diferencia del dot blot, permet detectar simultàniament diverses seqüències diana
de diferents mides (estan separades pel gel d’electroforèsis).
En un primer pas, es trosseja el DNA amb enzims de restricció per tal de separar els
fragments per grandaria. Després es realitza l’electroforesis, que pot incorporar
bromur d’etidi per fer una visualització del gel amb UV després del procés, per tal de
poder-lo comparar amb els resultats post hibridació.

Abans de fer la transferència a MB cal desnaturalitzar el DNA, aquest procés es fa

mitjançant la desnaturalització amb NaOH, la neutralització amb tampó pH neutre i
el rentat.

La transferència a la membrana de nitrocelulosa es fa per capilaritat segons la

imatge (ho veiem millor en la diapo següent). Després de la transferència hi haurà
un ancorantge del DNA amb temperatura (80ºC) o UV.

Abans d’hibridar es fa una prehibridació amb DNA d’esperma de salmó per bloquejar
la mb per tal d’evitar unions inespecífiques amb la mb. En la hibridació, pot ser que
utilitzem més d’una sonda. En aquest cas caldrà que les seves Tm siguin similars.

Després es duen a terme 2 o més rentats amb restictivitat creixent (segons ens

29
interessi).

Per fer el revelat fem autorradiografia. Fent la comparativa amb el gel

d’electroforèsis podem veure la mida del fragment que conté la sonda.

29
Moltes de les aplicacions del southern blot s’estan substituint per PCR, que és més
ràpid i sensible.
Aplicacions del Southern Blot:
-Elaboració d’empremtes genètiques.
-Estudi de mutacions estructurals (translocacions, delecions, insercions)
-Detecció de seqüències adquirides

30
El Northern Blot és una tècnica d’hibridació que permet detectar molècules d’ARN
separades per electroforesis en gel i transferides a una membrana de nitrocel·lulosa
o nailon.
A nivell de protocol, a diferencia del southern:
- No requereix digestion enzimàtica (al lisar les cèl·lules ja tenim una mescla
complexa de diferents ARNs)
- Electroforesis es realitza en condicions desnaturalitzants, ja que l’ARN
tendeix a formar estructures secundàries complexes (dificulten la migració).
- No cal desnaturalitzar abans de la transferència.
Aplicacions:
- Anàlisi d’expressió gènica.
- Detecció de mutacions.
- Estudis d’splicing

31
En els microarrys fixem les sondes i marquem les seqüències diana.
El microarray permet detectar quali i quantitativament milers de seqüències
simultàniament. (a més intensitat + quantitat)
Per fer la lectura es treballa amb tecnologia làser i programari d’anàlisi potent.

Per al marcatge de la mostra en els casos d’estudis d’expressió gènica es purifica

ARNm, se sintetitza ADNc sense marcar i es fa una transcripció amb nucleotids
marcats. Per estudis genòmics es marca el DNA.

Per fer la lectura: un laser de landa adequada pel fluorocrom i mesura intensitat
(quantifica) cada senyal.

32
Genòmica comparada (dreta)
- Estudi de delecions i duplicacions del material genètic.
- Punt vermell indica delecions
- Punt verd: duplicacions.
- Punt groc: tot ok.

Limitació: No detecta alteracions estructurals com translocacions o inversions.

Expressió genètica (ARN):

- Es pot fer en termes absoluts: mirar en un moment determinat què
s’expressa més o menys segons la intensitat.
- En termes comparatius: es posa DNA problema i referència i es compara com
abans. Per estudiar efectes de medicaments, per exemple.
- Punt vermell: expressió de gens reprimits.
- Punt verd: gens reprimits que s’expressen normalment.
- Punt groc: sense alteracions.
- Punt mig: sobreexpressió o infraexpressió.

33
Tenyim cromosomes.
Es fa directament sobre cèl·lules o teixits.
No s’ha de purificar ni extreure el DNA.
Sense marcadors radioactius.
Dona informació de cada cèl·lula.

34
35
Es basa en l’ús de sondes marcades amb fluorocroms, que són detectades
visualitzant les preparacions amb un microscopi de fluorescència amb filtres
adequats.

Es realitzen en laboratoris de citogenètica i hematologia sobre cromosomes en

metafase (FISH metafàsica) o sobre nuclis interfàsics nuus (FISH interfàsica), tot i
que, cada vegada més, es fa servir FISH directament sobre seccions de teixit
congelat. La seva principal aplicació és la detecció d’alteracions cromosòmiques ,
tant numèriques (monosomies, trisomies, poliploïdies) com estructurals
(translocacions, delecions, insercions, inversions i duplicacions).

Per mirar metafase s’utilitza colquicina (fàrmac que atura el cicle cel. en metafase).
Per mirar interfase es marquen els cromosomes, es veu una delecció (si esta marcat)

Es fa una contratinció per veure la resta de cromosomes

36
37
DIRECTE
Després de fer la hibridació es fa un rentat i una contratinció amb DAPI, marcar el
DNA doble cadena que quan s’exita a l’UV dona un color blau.
Quan mirem nuclis nus, s’han de veure uns 200 nuclis per donar el percentatge de
cèl·lules que presenten l’alteració que s’estudia.
INDIRECTE