Seminari 2.

Seqüenciació

Una seqüenciació ens permet determinar l’ordre precís dels nucleòtids en un fragment de DNA o en el
genoma.

● D’aquesta forma podem obtenir les pautes de lectura oberta, els promotors i les seqüències terminals.
● Per a poder determinar aquesta ordenació, les molècules de DNA de cadena senzilla presenten
diferenciacions d’un únic nucleòtid.

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
● Per aconseguir aquesta separació, es fa a través d’electroforesis
en gels de poliacrilamida.
● En les bandes obtingudes en aquests gels, només ens indiquen la
grandària de la molècula que hem separat i no pas la identitat del
nucleòtid terminal.
● Aquests es fan córrer en gels/carrils individuals i es visualitzen les
bandes per determinat l’ordre dels diferents nucleòtids.

1. OBTENCIÓ DELS FRAGMENTS DE DNA

Hi han dues metodologies per a poder fer aquesta separació:

a. MÈTODE DE MAXAM GILBERT DEGRADACIÓ

Aquest mètode de seqüenciació es basa en la modificació química del DNA i posterior escissió en bases
específiques → genera fragments on tots acaben amb aquella base específica

La cadena de DNA presenta un fosfat a cada banda en posició 5’, de tal forma que puc escindir aquests fòsfors i
marcar els extrems amb fòsfor radioactiu. Si a partir d’aquí comences el procés de desnaturalització i
degradació, obtindria informació de les dues bandes de la cadena.

Per tant, per a que sigui més fàcil el procés i l’obtenció de la seqüència, un dels extrems és escindit amb una
endonucleasa per tal d’eliminar la marca radioactiva.

En aquest moment, el que farem és una desnaturalització de la

cadena marcada, i es farà un tractament químic que genera
trencament en una petita porció d’un o dos dels quatre
nucleòtids:

● G Dimetil Sulat per a les Guanines.

● A + G Àcid fòrmic per els residus d’Adenina i
Guanina.
● T + C Hidrazina per els residus de Tirosina i
Citosina.
● C: Hidrazina-NaCl per els residus de Citosina.

D’aquesta forma es genera una sèrie de fragments marcats a partir de l’extrem marcat radioactivament i el
primer lloc de tall de cada molècula. Aquests fragments es separen a través d’una electroforesi en gel, separant
els productes de les quatre reaccions en quatre carrils diferents. Segons el seu recorregut amb els diferents
tractaments, podem determinar el nucleòtid en la cadena.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8905350

Descarga carpetas completas de una vez con el Plan PRO y PRO+

 Aquesta metodologia no es fa servir actualment per a una sèrie de desavantatges que presenta:
● Necessitem que el DNA estigui marcat.
● Necessitem una gran quantitat de DNA purificat per les modificacions que necessitem generar.
● Hi han molts passos intermedis de purificació en el procés.
● Lectures relativament curtes. Els tractaments químics són difícils de regular, de forma que generarà
trossos curts.
● No es pot automatitzar el sistema.
● Hi han proteïnes que bloquegen zones, determinant que no es produeixi la degradació en aquest. Això
genera zones buides en que no podem determinar la seqüència.

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
b. MÈTODE DE SANGER SINTESI

A diferència del mètode de Maxam-Gilbert, aquest mètode no es fa per degradació sinó per síntesi.

Aquest es produeix per una DNA polimerasa la qual fa copies de la molècula de DNA que es vol seqüenciar.
1 Per a començar aquest procés, es produeix un primer que s’anella amb la cadena motlle de DNA i serveix
com a encebador per la nova cadena de síntesi.
2 La síntesi de la nova cadena, la qual necessita 4 deoxiribonucleics trifosfatats ( dNTPs ) com a
substrats, succeiria fins que centenars dels nucleòtids s’haguessis polimeritzat. Però això no és així en
un mètode de Sanger, ja que una petita quantitat dels nucleòtids són dideoxinucleòtids (ddNTP que es
troben marcats amb diferents marcadors de fluorescència.

- La polimerasa no discrimina entre en deoxi- i dideoxinucleòtids, però una vegada s’ha incorporat un
dideoxinucleòtid es produeix un bloqueig de l’elongació ja que aquestes molècules presenten una en
posició 3’ un hidrogen en comptes d’un grup hidroxil ( necessari per a fer l’unió amb el fosfat en
posició 5’ del següent nucleòtid ).
- Com que es presenten més quantitats de deoxi- que dideoxi-, obtindrem noves molècules de diferents
mides i en el final un dideoxinucleòtid que ens indicarà la identitat ( A, C, T, G ).

3 A partir d’una cadena doble de DNA, es produeix una desnaturalització i una hibridació amb un
encebador ( es pot marcar també ) per tal de que la polimerasa pugui actuar.

4 Es dividiran en 4 tubs, en que tots ells es presentaran excessos de deoxinucleòtids, però en cada un
d’ells es presentaran diferents anàlegs.

5 En cada tub aconseguirem que la finalització de la

seqüència sigui sempre amb el mateix anàleg i, en un gel
d’electroforesi amb autoradiografia, el que farem és
obtenir les diferents longituds de les seqüències i el seu
últim nucleòtid marcat amb fluorescència.

* La discriminació és limitada, de forma que necessitem anar

canviant els encebadors per a poder anar llegint les seqüències
del DNA.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8905350

Descarga carpetas completas de una vez con el Plan PRO y PRO+

 Per tant, per a dur a terme aquest mètode necessitarem:

● DNA motlle.
● Encebadors. Aquests poden ser de dos tipus:
- Universals. És un primer que és complementari a una part del vector de
DNA que es troba immediatament adjacent al punt en que el nou DNA es
lliga.
- Específics o interns. Ens serveix per a la clonació de zones
determinades.

● Deoxinucleòtids trifosfatats ( dNTPs ).

● Dideoxinucleòtids trifosfatats ( ddNTPs ).
● Polimerases. Qualsevol polimerasa és capaç d’estendre un primer que s’anellat a una cadena motlle de
DNA, però no totes les polimerases es poden usar en la seqüenciació.

Això es deu a que moltes polimerases presenten varies activitats enzimàtiques, entre elles la capacitat de
degradar el DNA que han sintetitzat ( proofreading ). L’activitat que més determina la seqüenciació és la
exonucleasa 3’ → 5’ ja que aquesta evita la terminació de l’elongació a través de l’eliminació dels
dideoxinucleòtids just en el moment que s’han incorporat.

Per tant, les polimerases més adequades per aquesta activitat són:
- Fragment Klenow. A més de l’absència de l’activitat exonucleasa 5’ → 3’, presenta una mutació que
elimina també l’activitat exonucleasa 3’—>5’. Aquesta presenta poca processivitat ( 250 pb ) generant
fragments de DNA relativament petits.
- Sequenasa. És una Taq polimerasa amb una gran processivitat i sense activitat exonucleasa,
permeten fer seqüències de fins a 750 pb. ACTUAL.

Els avantatges d’aquest mètode són:

● Es necessita poca purificació del DNA.
● No es necessita el tractament amb endonucleases
● No es necessita un marcatge previ del DNA motlle.
● Es pot automatitzar. Un dels èxits es que es va poder marcar el dideoxinucleòtids amb diferents
marcadors.

2. SEQÜENCIACIÓ AUTOMÀTICA

Actualment es marquen els dideoxinucleòtids amb diferents fluorcroms, determinant una identitat
diferenciada segons la fluorescència que emeten.
- Això ens permet que, segons l’encebador, obtinguem diferents seqüències marcades i que per
electroforesi en un sistema de capil·lar ( ens permeten identificar fins a 1500 nucleòtids ) puguem
identificar el nucleòtid.
- A través d’un ordinador que presenta un detector, es fa passar el gel a través d’un làser que generarà
fluorescència per excitació dels fluorocroms. Les fluorescències es mesuren amb el detector,
permetent la identificació de l’anàleg.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8905350

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 3. SEQÜENCIACIÓ DE GENOMES

El DNA es pot seqüenciar per diferents raons, però una de les principals és obtenir informació del genoma.
Aquesta informació es pot obtenir per diferents estratègies.

a. SEQÜENCIACIÓ A L’ATZAR (shotgun sequencing)

Aquesta parteix d’un genoma que es trenca en petits fragments i es clonen per a generar cadenes motlle que
ens permetin la seqüenciació ràpida. El DNA sotmès al tractament es fracciona o separa per electroforesi en

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
gels d’agarosa i es purifiquen els fragments de DNA amb la mesura desitjada.
- Després de la clonació, es feia seqüenciació per mètode de Sanger on les seqüències amb una mida
determinada s’incorporen en una base de dades informàtica.
- En aquest, es buscava solapament de seqüències per determinar seqüències contigües o contings.
- No s’obtenen normalment la llargada total del genoma i òbviament la seqüència no estarà completa fins
que els contings estiguin posicionats correctament i els gaps entre ells s’uneixin.
- Una estratègia per a tancar els gaps individualment es basa en l’anàlisis d’hibridació en una llibreria
clonada a través de vectors λ. La llibreria λ es prova amb diferents sondes en que les seves seqüències
corresponen amb el final de cada conting.
- Si les dues sondes hibriden en el mateix clon, indiquen que els dos es troben de forma adjacent en el
genoma i d’aquesta forma podem tancar el gap.

El problema d’aquesta seqüenciació és que es fan lectures curtes, i això dificulta l’acoblament dels fragments.
A més, en un genoma, hi han seqüències que es repeteixen al llarg d’aquest, de tal forma que quan intentem
veure si un fragment és adjacent en veritat estarem veient que són complementaris.

b. SEQÜENCIACIÓ JERÀRQUICA

Aquesta seqüenciació necessita una fase de pre-seqüenciació en que el genoma es trenca en grans
fragments i aquests es clonen en vectors de gran capacitat com són els BAC (Vectors derivats de bacylovirus)
( es genera una genoteca ).

Els clons que contenen fragments solapats de DNA s’identifiquen,

permetent generar una sèrie contigua. Cada peça de DNA es fragmenta
en trossos més petits, es seqüencien i s’acoblen per el mètode a l’atzar.

Les seqüències de cada fregament clonat es poden endreçar en sèries

de clons per a poder generar una seqüència genòmica solapada, de tal
forma que el problema de les seqüències repetitives sorgeixen només si
dues o més copies de la mateixa repetició es presenten en el mateix
fragment clonat.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8905350

Descarga carpetas completas de una vez con el Plan PRO y PRO+

 El problema amb aquesta seqüenciació és la identificació els clons que contenen inserts solapats. Hi han
diferents metodologies per determinar els clons contigus:

● Seqüenciació dels extrems dels clons

● Intersperced repeat element PCR IRE PCR : Si el clon dos es contiguo he de trobar un que sigui de la
mateixa mida que el primer.
● Chromosome walking. Es selecciona un clon de la llibreria, es marca, i s’usa com una prova d’hibridació
per la resta de clons de la llibreria. Els clons que hibriden són aquells que es solapen amb la seqüència

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
prova. Ara un dels clons es presenta etiquetat i es segueix amb una segona prova d’hibridació. De forma
gradual, el conting del clon es genera. Cada clon gran que tenim, el seqüenciem en fragments petits.
● Clone fingerprints. Aquestes tècniques es basen en la identificació de característiques de les
seqüències que es comparteixen per els clons. Si els dos clons contenen aquesta característica,
clarament han d’estar solapades.
● Una característica d’una seqüència d’aquest tipus s’anomena seqüència targged site ( STS ): jo tinc el
gen que m’interessa i utilitzo l’encebador al clon 1 i clon 2 i si serveix és perquè és el mateix.

Sequenciacions massives:
- No es necessiten fer llibreries
- Se’ls hi enganxen uns adaptadors que els immobilitzen, no clonen.
- N’hi ha de diversos tipus:

PCR en emulsió
- Piroseqüenciació
- Seqüenciació per lligació

PCR en fase sòlida (Bridge PCR

4. PIROSEQÜENCIACIÓ

És una tecnologia que permet determinar una seqüència de DNA a gran escala, aplicable a genomes complets,
a través de luminescència.
A diferència del mètode de Sanger, aquest es basa en la detecció de l’alliberació de pirofosfat en el moment que
s’incorporen els nucleòtids. És a dir, es van afegint els nucleòtids i si aquests corresponen a la reacció que ha de
catalitzar la polimerasa, es produeix l’elongació i l’alliberament d’aquest pirofosfat.
Aquest pirofosfat ( PPi ) és transformat a ATP per una ATP sulfurilasa i s’incorporarà a la luciferina, generant un
complex base d’actuació de la luciferasa. Aquesta luciferasa convertirà la luciferina en oxoluciferina i a més es
generarà una senyal lluminosa.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8905350

Descarga carpetas completas de una vez con el Plan PRO y PRO+

 Aquest també es basa en un mètode de síntesi, de tal forma que haurem de seguir passos per tal de generar
una cadena complementària que ens doni informació sobre la seqüenciació:

I. Preparació de la genoteca. Es fragmenta el DNA genòmic per nebulització i es marquen els extrems dels
fragments amb dos tipus d’adaptadors anomenats A ( s’uneix a l’esfera d’agarosa ) i B ( complementari al
primer per a l’amplificació ).

II. PCR en emulsió. Es barrejen els fragments de la genoteca amb les esferes d’agarosa les quals presenten
uns oligonucleòtids complementaris a un dels adaptadors, de tal forma que cada una de les esferes

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
només aculli a un sol fragment de la genoteca. Després s’afegeix un emulsionant que conté aigua i oli
amb tots els reactius de la PCR. En aquesta, cada esfera queda aïllada en una gota aquosa envoltada
d’oli i, per tant, separada de la resta d’esferes. Cada gota es converteix en un microreactor on es produirà
una amplificació. És a dir, en cada gota augmenta exponencialment el nombre de fragments de DNA (
clons ) que, a la vegada, s’uneixen als oligonucleòtids que recobreixen l’esfera. Finalment cada esfera
d’agarosa es presenta recoberta per milers de fragments de DNA. Aquestes esferes es dipositen en una
placa que conté pouets amb un diàmetre just per a que només càpiga una esfera ( no s’ocupen sempre
tots ). Una vegada fet, s’afegeixen unes esferes més petites en que s’han incorporat enzims per la
piroseqüenciació: sulfurilasa i luciferasa.

III. Piroseqüenciació. El sistema de flux fa passar de forma seqüencial cada un dels quatre nucleòtids a
través de la placa que conté els pouets sempre amb el mateix ordre TACG . S’afegeix la polimerasa i
d’aquesta forma s’aconsegueix una seqüenciació massiva en paral·lel. Cada vegada que un dels pouets
incorpora un nucleòtid, es genera una senyal quimioluminiscent que es capta per una càmera digital i que
és proporcional al nombre de nucleòtids que s’incorporen en cada pouet. ( a cadascuna de les esferes
només li entra un..?)

IV. Anàlisi d’imatges. S’analitzen les imatges quimioluminiscents de cada pouet i es determina la seqüencia
en cada un dels fragments. A partir d’aquesta col·lecció de seqüències, es reconstrueix la seqüència
genòmica original per mètodes computacionals.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8905350

Descarga carpetas completas de una vez con el Plan PRO y PRO+