Electroforesi de protenes en gel de poliacrilamida.

SDS-PAGE.
1. OBJECTIUS
- Conixer la tcnica delectroforesi de protenes.
- Aprendre a preparar gels delectroforesi.
- Aprendre a calcular la quantitat de protena a carregar.
- Visualitzar el gel delectroforesi amb blau de Comassie.

2. FONAMENT TERIC. ELECTROFORESI DE PROTEINES. SDS-PAGE.

El 1937 Tiselius va introduir en el camp de la bioqumica la tcnica electrofortica, des de llavors fins ara
sha anat incrementant el poder de resoluci daquesta. Els mtodes de separaci electrofortica es basen
en laplicaci dun camp elctric a travs dun suport insoluble i pors per que s permeable a una
dissoluci tamponada.
Lelectroforesi en gels de poliacrilamida (PAGE) s una tcnica emprada per a separar i visualitzar
protenes i tamb DNA i RNA de baix pes molecular. Shapiro, Viuela i Maizel al 1967 van demostrar que el
pes molecular de moltes protenes es pot determinar per la mesura de la seva mobilitat en un gel de
poliacrilamida que cont com a detergent aninic dodecilsulfat de sodi (SDS).
Les cadenes polipeptdiques de les protenes perden l'estructura quan s'escalfen durant 5 minuts a 100 C,
a pH neutre, en 1%SDS i 0,1 M de mercaptoetanol. Els ponts disulfur es trenquen per l'acci d'un agent
reductor com el mercaptoetanol que s'unir a les cistenes, i els complexes formats per les subunitats de
protena i el SDS adquireixen una configuraci de bast. Les protenes sotmeses a aquest tractament es
comporten com si tinguessin una forma semblant i una relaci crrega-massa idntica. Aix s degut a que
la quantitat de SDS unida a la protena per unitat de pes s constant (1,4 g de SDS /g de protena). La
crrega ve doncs determinada pel SDS ms que per la crrega intrnseca de la protena. Ja que els
complexes SDS-protena tindran la mateixa relaci crrega-massa, la mobilitat electrofortica de cada
protena vindr determinada pel nmero d'enllaos peptdics de la molcula; s a dir la mobilitat ser
proporcional al pes molecular. El gel actua com un tams a travs del qual han de passar les molcules, les
ms petites trobaran ms fcilment el cam pels porus del gel: la mobilitat s ms gran a mida que
disminueix el pes molecular de les protenes
Segons el marge de pesos moleculars a estudiar cal utilitzar gels de malla diferent. En els gels de
poliacrilamida la variaci del grau d'entrecreuament es pot aconseguir fent variar la concentraci inicial
d'acrilamida. Aqu es mostren les concentracions d'acrilamida (%) a emprar en funci dels pesos moleculars
(expressats en kilodalton -kDa-): % Acrilamida Pm protena kDa .
La lisozima, tamb anomenada muramidasa, s un enzim de 14,4 kilodalton que danya les cllules
bacterianes catalitzant la hidrlisi de les unions beta 1,4 entre els residus d'cid N-acetilmurmic i N-acetilD-glucosamina en un peptidoglic
7,5 30-150 kDa
10 15-80
15 < 15
Els gels de SDS-poliacrilamida normalment es fan polimeritzar en dues parts. El gel superior o stacking gel
i el gel inferior o gel de separaci. El gel superior cont una proporci d'acrilamida ms baixa que el gel de
separaci i es prepara amb un tamp a fora inica tamb ms baixa i a diferent pH. La grandria de malla
ms gran en el gel superior fa que les molcules trobin menys impediment, i d'altra banda una fora inica
inferior implica ms resistncia elctrica i per tant un camp elctric (V/cm) ms elevat com a conseqncia
les molcules es mouran ms rpidament que en gel de separaci. La migraci rpida a travs del gel
superior originar una acumulaci de material en la intersecci entre el gel superior i el de separaci de
manera que les diferent protenes que composen la mostra entraran successivament en el gel de separaci
concentrades en un espai molt petit, el que dna lloc a bandes molt fines, incrementant-ne la resoluci.

Un cop preparats el gels per part de lalumnat conv que adquireixin destresa en la crrega de mostra en els
pouets. Per tant es poden fer assajos de crrega de 25 L de tamp daplicaci de les mostres abans de
carregar les protenes de deb.
En els gels de poliacrilamida correrem una barreja de protenes pretenyides de pes molecular conegut que
ens serviran de referncia de lestat de lelectroforesi, aix com les 6 diferents mostres analitzades pel
mtode de Bradford en la prctica anterior (5 de lisozima i 1 dovoalbumina). Per a calcular la quantitat de
protena a carregar, cal comptar un mnim de 0,5 g de protena purificada i 1 g de barreja de protenes.
Un cop corregut el gel es visualitzen les protenes amb la dissoluci de tinci amb Coomassie.

3. REACTIUS - MATERIALS EPIs

Font dalimentaci.
Cubetes delectroforesi.
Guies per a la preparaci dels gels.
Pintes
Micropipetes i puntes.
Eppendorfs
Bany termosttico a 100C
Tubs Falcon 50 ml
Safates plstic per a la tinci del gel.
Matrassos aforats
Soluci dacrilamida bisacrilamida al 40%
Tris 1,5 M (pH 8,8)
Tris 0,5 M (pH 6,8)

Soluci al 10% de SDS

Persulfat damoni
TEMED
Tamp deluci. (tris, glicina, SDS)
Tamp de crrega (tris, SDS, blau de
bromofenol)
2-mercaptoetanol
Soluci de tinci (Blau de Comassie,
metanol, cid actic)
Soluci de destenyit (metanol, cid actic)
Aigua per injectables.
Barreja protenes pretenyides (BioRad)
n-butanol

Lacrilamida s neurotxica, la soluci al 40% disminueix en gran mesura els perills, per conv sempre
treballar amb guants. Un cop polimeritzada no presenta cap perill.
Cal treballar en vitrina quan es manipuli el mercaptoetanol, s txic i no molt agradable al olfacte.

4. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL
Preparaci de les dissolucions:
1.- Tamp deluci TE 10x pH. 8,3 (1 litre) Sha de fer 1x 100mL/1L. 10x ja feta
Tris base 30,3 g
Glicina 144,2 g
SDS 10 g
Enrasar amb aigua Millipore (o destillada fins arribar a 1 litre). No cal ajustar el pH. En el
moment del seu s es prepara la soluci 1x i el pH ja estar ajustat.
2.- Soluci de tinci (500mL). Preparar en vitrina gasos.
1,25 g de blau brillant de Coomassie R-250 en balana granataria
225 ml de metanol en proveta
50 ml dcid actic (concentrat acetic glacial pursim pm=60,05g)
Enrasar a 500 ml amb aigua Millipore o destillada.
3.- Soluci de destenyit. (0,5 litres). Preparar en vitrina de gasos.
150 ml de metanol
50 ml dactic.
Enrasar a 500 ml amb aigua Millipore o destillada
4.- Tris 1,5 M pH 8,8 (100 ml)
18,15 g de Tris
80 ml daigua destillada
Ajustar el pH fins a 8,8 amb HCl 6N. Aforar a 100 ml amb aigua destillada.
5.- Tris 0,5 M pH 6,8 (100 ml)
6,0 g de Tris
80 ml daigua destillada

Ajustar el pH fins a 6,8 amb HCl 6N. Aforar a 100 ml amb aigua destillada.
6.- SDS al 10% (25 ml) (ja preparat)
7.- Blau de bromofenol al 1% (50 ml). (Compte: Guants!!) (ja preparat)
En etanol
8.- Tamp de crrega. (10 ml) Es pot preparar en tub Falco de plstic
Tris HCl 0,5 M pH 6,8 1 ml (ja preparat)
Glicerina 2 ml
SDS al 10% 2 ml
Blau de bromofenol al 1% 0,4 ml (amb micropipeta)
H2O destillada 5,6 ml
En el moment de fer servir, prendre 1 ml de la soluci i afegir 20 L de 2-mercaptoetanol
(vitrina)
9.- Persulfat damoni al 10% (APS) (10 ml) en aigua.
Preparar en el moment de fer servir
Preparaci del gel dacrilamida.
Preparar les guies per a la preparaci dels gels. Assegurar que els vidres estiguin ben nets. Si cal rentar
amb etanol. Posar-hi la pinta i fer-hi una marca en el vidre aproximadament 1 cm per sota la pinta. Retirar la
pinta. Preparar els gels de separaci i el stacking gel o gel dapilament.
1.- Gel de separaci. (Per a un gel al 10%)

H2O
Acrilamida al 40%
Tris 1,5 M (pH 8,8)
10% SDS
Temed
10% APS

10 ml (1 gel)

20 ml (2 gels)

30 ml(3 gels) es fa aquest ltim

4,82 ml
2,48
2,5 ml
0,1 ml
10 L
0,1 ml

9,6 ml
4,95
5 ml
0,2 ml
20 L
0,2 ml

11,42mL
7,43 mL
7,5 mL
0,3 mL
30 L
0,3 mL

Afegir el TEMED i especialment lAPS al final. Immediatament agitar i afegir amb lajut duna pipeta
Pasteur la soluci entre els vidres fins a la marca que havem fet abans. Deixar la resta en el tub Falcon com
control de la polimeritzaci de lacrilamida.
Afegir butanol amb molta cura per cada un dels extrems de manera que es formi una pellcula de 2 mm
(loxigen atmosfric inhibeix la polimeritzaci). Deixar polimeritzar el gel uns 15 o 20 minuts. Quan el gel
polimeritza la interfase gel butanol queda ben definida. Un cop polimeritzat es decanta el butanol i
sassequen les gotes que queden amb paper de filtre, passar aigua destillada i assecar b.
2.- Gel dapilament. Stacking gel.

H2O
Acrilamida al 40%
Tris 0,5 M (pH 6,8)
10% SDS
Temed
10% APS

5 ml (1 gel) Aquest

10 ml (2 gels)

3,6 ml
0,62
0,63 ml
75 L
7,5 L
75 L

7,2 ml
1,24
1,26 ml
0,15 ml
15 L
0,15 ml

Afegir el TEMED i especialment lAPS al final. Immediatament agitar i afegir amb lajut duna pipeta
Pasteur. Es colloca la pinta per a formar les butxaques i es deixa polimeritzar uns altres 20minuts.
Un cop polimeritzat el gel, retirar la pinta cap amunt, anant amb compte. Conv rentar els pouets amb aigua
amb una xeringa i una agulla. Assaig de deposici de les mostres.

Un o dos dels gels preparats el farem servir perqu lalumnat vaig adquirint destresa. Es pren 1 ml del
tamp de crrega (sense mercaptoetanol que fa molt mala olor) i es diposita en un Eppendorf. Cada
alumne dipositar amb micropipeta 20 L de tamp en un pouet. s molt important que no hi hagi
contaminacions creuades i que la mostra dun pouet no vagi a un altre. Crrega de les mostres i posta en
marxa de lelectroforesi.
Posar un bany daigua a escalfar a 100C
A partir dels resultats de la prctica anterior, calculeu el volum necessari per tenir 1 g de protena del cru
de lisozima i dels tubs 1 i 2, i 0,5 g dels tubs 3 i 4 i de ovoalbmina. Es poden carregar com a mxim 25
(30 en mans expertes) L per pouet,

Protena

Cru
lisozima

Tub 1
lisozima

Tub 2
lisozima

Tub 3
lisozima

Tub 4
lisozima

Concentraci
g/mL

Volum a
carregar

7 L

7 L

7 L

14 L

14 L

Ovoalbmina

Acabar de preparar el tamp de crrega. En vitrina afegir 20 L de mercaptoetanol a 1 ml de tamp de

carrega dipositat en un Eppendorf. Agitar amb Vortex. Preparar les mostres. Dipositar en Eppendorfs els
volums de mostra que necessitem en cada cas. Afegir 7 L del tamp de crrega. Amb una agulla fer un
forat a lEppendorf a la part superior (sin esclatar). Agitar amb Vortex i deixar-ho 3 minuts a 100C per
desnaturalitzar la protena.
Es colloca el gel en les cubetes delectroforesi. Somple el dipsit interior amb tamp deluci TE 1X (100
ml de tamp 10x amb 900 ml daigua destillada) per comprovar que no te prdues i desprs el dipsit
exterior.
Es retira la pinta i es carreguen les mostres. En el primer pouet 20 L de la soluci barreja de protenes
pretenyides. En els segents les mostres. Molta cura en evitar contaminacions creuades. Cal anotar
clarament que shi ha dipositat en cada pouet.
Es connecta lnode (born vermell) de la font dalimentaci a la cubeta interior i el ctode (born negre) al
dipsit inferior. Es fan crrer les mostres, inicialment a un voltatge de 100 volts, per passar quan comencin
a crrer a 120-130 volts. Aturar lelectroforesi quan el blau de bromofenol sacosti a lextrem inferior del gel
(45 minuts aprox). Apagar font dalimentaci.
Tinci de lelectroforesi.
Desconnectada la font dalimentaci, es treu el tamp de la cubeta i es desmunta el sandvitx, separant amb
molta cura les plaques de vidre del gel amb una esptula de plstic. Es pot retallar la part corresponent al
gel dapilament, per aleshores s necessari marcar clarament la disposici de les mostres fent un petit tall
a lextrem superior dret. El gel es tenyeix deixant-lo durant 1 hora submergit en la dissoluci de tinci.
Selimina desprs el colorant amb la soluci de destenyit (cal canviar-la diversos cops). El resultat final es
pot fotografiar.
5. GESTI DELS RESIDUS
Els tampons deluci es poden reutilitzar, es dipositen en una ampolla etiquetada com a tamp
brut i es pot usar per al dipsit inferior (no per la cubeta interior) .
Les solucions de tinci i destenyit emprades aniran es dipositaran per a la seva gesti
(dissolucions aquoses orgniques)

6. RESULTATS
A partir dels valors dels pesos moleculars de lescala de protenes fer una estimaci del pes molecular de la
lisozima i de lovoalbumina.

Lactoferrina 97,4 KDa

Albmina 66,2 KDa
Casena 45 KDa
Ovoalbmina 35 KDa
Casena 31 KDa
Lactoglobulina 21,5 KDa
Lisozima 14,4 KDa

Quines protenes es reconeixen en el cru de lisozima i en el tub 1 i 2?

Cru:

Albmina 66,2 KDa

Ovoalbmina 35 KDa
Lisozima 14,4 KDa

Tub 1:

Tubs 2

Albmina 66,2 KDa

Ovoalbmina 35 KDa

Albmina 66,2 KDa

Ovoalbmina 35 KDa

El nostre gel:

7. CONCLUSIONS.
Comenta les teves conclusions en relaci als objectius de la prctica i altres coneixements que hagis pogut
adquirir.
Haurem dhaver posat mes protenes ja que no sha marcat del tot definit.
Podem observar presencia de ovoalbmina i lisozima a part daltres protenes de lou.
En el cru i el primer tub observem la lisozima. En els dos segents ja no apareix. Pel que hem aconseguit
que quedi retinguda en la columna en la prctica anterior.

8. QUESTIONS.

- Qu s una protena desnaturalitzada?

Es diu que una protena est desnaturalitzada quan la seva estructura tridimensional (espacial) es veu
alterada per algun motiu (calor, agents qumics, etc.).
Una protena desnaturalitzada t propietats diferents de la mateixa protena en estat natiu. Ho veiem quan
escalfem l'ou: la clara, que era lquida i transparent, es torna slida i blanca a causa de la desnaturalitzaci
de l'ovoalbmina

- Quines protenes migren abans en lelectroforesi?

Les de menor massa.

Les majors son retardades i es mouen ms lentament a travs del gel.

- Si volgussim fer crrer protenes grans (per exemple 100 kDa) quines variacions haurem de fer en el gel
de separaci?
La mida del porus pot ser ajustat per optimitzar la separaci de la mostra d'inters. Aix, gels amb un
percentatge alt d'acrilamida (10-15% T) sn ptims per a la separaci de protenes de mida petita (menors
de 50KDa), mentre que gels de percentatges menors (<10% T) sn els indicats per a la separaci de
protenes grans. Generalment la relaci utilitzada entre acrilamida i bisacrilamida s 37,5:1.
Anoteu frases R i S a la llibreta i a linforme.

BISACRILAMIDA

TRIS

SDS

PERSULFAT DAMONI

TEMED

GLICINA

BLAU DE BROMOFENOL

2-MERCAPTOETANOL

BLAU DE COMASSIE

METANOL

CID ACTIC

METANOL

N-BUTANOL

9. BIBLIOGRAFIA
Internet
Ensayos Biotecnologicos. A. Rubio i altres. Pag 181-185 (2010)
Curs Formaci Assaigs Biotecnolgic. Departament de Bioqumica i Departament Gentica i Microbiologia
UAB (2009)