Separació de proteïnes per electroforesis en SDS

PRINCIPIS TEÒRICS

Al 1937 Tiselius va introduir en el camp de la bioquímica la tècnica electroforètica, des de

llavors fins ara s'ha anat incrementant el poder de resolució d'aquesta. Els mètodes de
separació electroforètica es basen en l'aplicació d'un camp elèctric a través d'un suport
insoluble i porós però que és permeable a una dissolució tamponada.

En aquesta pràctica es realitzarà una electroforesi en condicions desnaturalitzants, en

presència de dodecil sulfat sòdic (SDS), emprant com a suport la poliacrilamida.

L'electroforesi en gels de poliacrilamida (PAGE) és una tècnica emprada per a separar i

visualitzar proteïnes i també DNA i RNA de baix pes molecular. Els gels d´agarosa són
utilitzats normalment per a la separació de molècules grans de DNA o RNA.

Mecanisme de polimerització

Els gels es formen per polimerització dels monomers d'acrilamida CH 2=CH-CO-NH2 en

llargues cadenes de poliacrilamida i l'entrecreuament de les cadenes amb un reactiu
bifuncional com la N,N'-metilen-bis-acrilamida CH 2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2,
l'estructura general de la xarxa es pot visualitzar en l'esquema següent:

1
La reacció de polimerització és iniciada pel TEMED (tetrametiletilendiamida) i el persulfat
amònic; aquest últim dóna lloc a un radical lliure de persulfat que a la vegada activa el
TEMED. El TEMED actua com un transportador d'electrons que activa el monòmer
d'acrilamida, aportant un electró desaparellat que converteix el monòmer d'acrilamida en
un radical lliure. El monòmer d'acrilamida activat reaccionarà amb un altre monòmer no
activat originant-se la reacció de polimerització. Qualsevol compost que actuï com a
trampa de radicals lliures inhibirà la polimerització, aquest és el cas de l'oxigen
atmosfèric.

Electroforesis en gels de poliacrilamida en presència de SDS (SDS-PAGE)

Shapiro, Viñuela i Maizel al 1967 van demostrar que la Mr (massa molecular relativa) de
moltes proteïnes es pot determinar mesurant la seva mobilitat en un gel de poliacrilamida
que conté com a detergent dodecilsulfat de sodi (SDS).

Les cadenes polipeptídiques de les proteïnes perden l'estructura quan s'escalfen durant 5
minuts a 100 °C, a pH neutre, en 1% SDS i 0.1 M mercaptoetanol. Els ponts disulfur es
trenquen per l'acció d'un agent reductor com el mercaptoetanol i els complexes formats
per les subunitats de proteïna i el SDS adquireixen una forma de “bastó”.

Les proteïnes sotmeses a aquest tractament es comporten com si tinguessin una forma
semblant i una relació càrrega-massa idèntica. Això és degut a que la quantitat de SDS
unit a la proteïna per unitat de pes és constant (1.4 g de SDS /g de proteïna). La càrrega
ve doncs determinada pel SDS més que per la càrrega intrínseca de cada aminoàcid. Les
molècules de detergent s'uneixen a la proteïna per la seva part hidrofòbica, mentre que el
grup àcid del SDS queda cap a l'exterior, el que destrueix la conformació nativa de la
proteïna i li confereix una càrrega superficial negativa uniforme. Ja que els complexes
SDS-proteïna tindran la mateixa relació càrrega-massa, la mobilitat electroforètica de
cada proteïna vindrà determinada pel seu pes molecular. El gel actua com un garbell a
través del qual han de passar les molècules, les més petites trobaran més fàcilment el
camí pels porus del gel: la mobilitat és més gran a mida que disminueix el pes molecular
de les proteïnes.

2
Segons el marge de Mr a estudiar cal utilitzar gels de malla diferent. En els gels de
poliacrilamida la variació del grau d'entrecreuament es pot aconseguir fent variar la
concentració inicial d'acrilamida. Aquí es mostren alguns exemples de les concentracions
d'acrilamida (%) a emprar en funció dels pesos moleculars (expressats en kilodalton -
kDa-) de les proteïnes que es volen separar:

% kDa

7.5 30-150

10 15-80

15 <15

Els gels de SDS-poliacrilamida normalment es fan polimeritzar en dues parts. El gel

superior o “stacking gel” i el gel inferior o gel de separació. El gel superior conté una
proporció d'acrilamida més baixa que el gel de separació i es prepara amb un tampó a
força iònica també més baixa i a diferent pH. La grandària de malla més gran en el gel
superior fa que les molècules trobin menys impediment, i d'altra banda una força iònica
inferior implica més resistència elèctrica i per tant un camp elèctric (V/cm) més elevat,
com a conseqüència les molècules es mouran més ràpidament que en el gel de
separació. La migració ràpida a través del gel superior originarà una acumulació de
material en la intersecció entre el gel superior i el de separació de manera que les
diferent proteïnes que composen la mostra entraran successivament en el gel de
separació concentrades en un espai molt petit, el que dóna lloc a bandes molt fines,
incrementant-ne la resolució. A l’enllaç següent hi ha informació rellevant sobre la
electroforesis de proteïnes: http://www.howbiotech.com/the-principle-and-procedure-of-
polyacrylamide-gel-electrophoresis-sds-page/

Materials

-cubeta d'electroforesis (kit Mini-Protean II o III)

-plaques de vidre
-separadors (0,75 o 1,5 mm de gruix)
-pinta (0,75 o 1,5 mm de gruix i 10 butxaques)
-pipetes automàtiques
-font d'alimentació
-pipetes de vidre i propipetes
-bany termostàtic a 100 °C (per a preparar les mostres)
3
 -cubetes de plàstic per a tenyir i destenyir els gels
-tubs tipus “Falcon” de 50 mL
Reactius

-acrilamida
-bisacrilamida
-TEMED
-peroxodisulfat amònic
-Tris (Tris-hidroximetil-aminometà).
-SDS (dodecilsulfat sòdic)
-glicina
-ß-mercaptoetanol
-blau de bromfenol
-marcadors de pes molecular
-àcid acètic
-Coomasie brilliant blue
-metanol
-alíquotes de llet de vaca sencera, semidesnatada i desnatada (diluïdes 10X del
preparat original).
-alíquota de preparat de soja (diluïda 10X de la mostra original).
-dissolució de β-caseïna a 0,3 mG/mL

Dissolucions necessàries per a preparar el gel:

Dissolució A (acrilamida al 30% i bisacrilamida al 0,8% (37,5:1)

La acrilamida no polimeritzada és neurotòxica i, per tant, han de portar-se guants
quan es manipuli

Dissolució B (tampó del gel de separació) (4X)

Aquesta dissolució és Tris/HCl 1,5 M a pH 8,8 amb 0,4% de SDS

Dissolució C (tampó del gel superior, “stacking gel”) (4X)

Aquesta dissolució és Tris/HCl 0,5 M a pH 6,8 amb 0,4% de SDS

Dissolució D:
-peroxodisulfat amònic 10%.

Tampó d'electroforesi (running buffer) [x5]

4
 Tris 0,25 M, glicina 1,92 M, 1% SDS, el pH queda a 8,3-8,5

Tampó d'aplicació de mostres (“loading buffer”) [x6]

0,35 M Tris a pH 6,8 amb 30% glicerol, 10% SDS
3 mM DTT ( o 2 mM ß-mercaptoetanol) i 0,02% de blau de bromofenol

Dissolució de tinció amb Coomasie:

àcid acètic al 10%, etanol al 25% (o metanol al 50%) i
Coomasie Brilliant Blue R-250 al 0,1%

Dissolució decolorant:
Àcid acètic al 7% i etanol al 30% (o metanol al 5%)

Part A.- Preparació del gel de poliacrilamida-SDS

METODOLOGIA

Preparació de les plaques (miniProtean III):

Les plaques de vidre es renten amb sabó, i després amb etanol i es deixen
assecar a l'estufa.

Fer un "sandwich" amb les dues plaques de vidre: sobre una superfície plana i
neta es col·loca la placa de vidre llarga, a continuació s'hi posen damunt dels extrems els
dos separadors de plàstic del mateix gruix de manera que sobresurtin uns 5 mm per la
part superior de la placa i, finalment, a sobre s’hi col·loca la placa de vidre curta.

5
Preparació del gel

1.- Preparació del gel de separació: Posar tots els components que s'indiquen en un
tub tipus “Falcon” de 50 mL, excepte el TEMED i el persulfat amònic, que s'afegiran en el
darrer moment. L'acrilamida sense polimeritzar és altament tòxica:

òbviament no pipetejar res amb la boca, fer servir una pipeta

automàtica. Emprar sempre guants quan es manipulin dissolucions en
les que hi hagi acrilamida.

Sempre s’utilitza aigua destil·lada desionitzada.

Dissolució d'acrilamida al 12% pel gel de separació (per dos gels, i per tant suficient per a
dos grups):

-6 ml dissolució A
-3,75 ml dissolució B
-5,25 ml d'aigua destil·lada desionitzada
El TEMED i la dissolució D (persulfat amònic) s’afegiran just abans de vessar la
dissolució en el suport del gel:

-12 µl TEMED
-60 µl dissolució D
2.- Introduir la pinta entre les dues plaques de vidre i fer una marca amb un rotulador un
cm per sota de les dents de la pinta. Aquesta marca ens indica el límit superior del gel
inferior. Retirar la pinta.

3.- Amb l'ajut d'una pipeta Pasteur introduir entre les plaques de vidre la dissolució fins a
la marca de retolador.

4.- Afegir una mica de butanol o isopropanol amb molta cura per cada un dels extrems de
manera que es formi una pel·lícula d'aproximadament 2 mm (l'oxigen atmosfèric inhibeix
la polimerització i així la polimerització del front superior serà uniforme).

5.- Deixar polimeritzar uns 20 minuts, fins observar que la interfase butanol-
poliacrilamida està ben definida i que els extrems es corben cap avall (el gel es contrau
en polimeritzar). Quan la mica de barreja que queda al tub “Falcon” de 50 mL estigui
polimeritzada, també ho estaran els gels dintre de les plaques de vidre.

6.- Un cop polimeritzat es decanta el butanol i s'assequen les gotes que queden amb
paper de filtre, passar aigua destil·lada desionitzada i assecar bé.

6
7- Preparació del gel superior (“stacking gel”).

Dissolució d'acrilamida al 3.75 % (per dos plaques i suficient per dos grups). Aquesta
dissolució es prepara dintre d’un tub roscat tipus Falcon de 15 mL.

-0,65 ml dissolució A
-1,25 ml dissolució C
-3,05 ml d'aigua destil·lada desionitzada
Just abans de vessar la dissolució en el suport del gel afegir:

-7,5 µl TEMED
-30 µl dissolució D
8.- La dissolució s'aboca sobre el gel de separació. Es col·loca la pinta per a formar les
butxaques i es deixa polimeritzar.

9.- Un cop polimeritzat el gel ha de guardar-se a 4 ºC fins l’endemà quan s’ha de córrer.

La figura de l’esquerra mostra l’aspecte que ha de tenir un gel d’electroforesis: es

veuen el gel de separació (marcat amb D) i el “stacking-gel”, que és el gel superior
(marcat A). La de la dreta mostra el gel dintre de la cubeta d’electroforesis i la
forma de carregar les mostres amb l’ajut d’una micropipeta. La direcció de
migració de les mostres (carregades negativament), càtode  ànode, també està
indicada.

7
Part B.- Preparació de les mostres i electroforesis

Preparació i aplicació de les mostres

S’aplicaran a l’electroforesi la barreja d’estàndards de proteïnes de Mr coneguda,

mostres dels tres tipus de llet i del preparat de soja, així com de la β-caseïna pura.

Les mostres per a aplicar a l’electroforesi es preparen barrejant-les amb tampó

d’aplicació de mostres (“loading buffer”, que està concentrat 6X):

20 µl (mostra+H2O) + 4 µl de tampó d’aplicació de mostres 6X

La barreja de proteïnes estàndard (en què les proteïnes estan pre-tenyides) conté
proteïnes que tenen les masses moleculars indicades a la figura:

8
Posar els 5 tubs eppendorf (que contindran els 24 µL de cadascuna de les tres mostres
de llet, del preparat de soja i la mostra de β-caseïna) a 100° C durant 3 min (max. 5 min).
Donat que han de carregar-se 15 µL a les butxaques del gel, és convenient preparar un
volum superior per compensar les pèrdues durant les manipulacions a les que són
sotmeses les mostres, com l’escalfament a 100°C.

El/la professor* us dirà quant heu de carregar de cada mostra.

Límit de detecció per a visualitzar les proteïnes en una tinció amb Coomasie:0.3-0.5µg.
L’aplicació de les mostres al gel ha de fer-se quan el gel ja estigui muntat a la cubeta
d’electroforesi amb el tampó posat.

Es pot carregar un gel per cada dos grups de pràctiques.

Electroforesis

-Un cop estan preparades les mostres i el gel polimeritzat, aquest es canvia del suport de
polimerització i es fixa al suport on es farà l'electroforesi.

-El gel amb els vidres es fixa a la cubeta d'electroforesi .

-S'omple el dipòsit interior amb el tampó d'elució per a comprovar que no té pèrdues i
després el dipòsit exterior i es retiren les pintes.

-S'apliquen les mostres, 5 μL dels estàndards pre-tenyits i els μL necessaris de la resta

de mostres a cada butxaca, amb l’ajut de puntes de pipeta (el/la professor* us dirà els µL
a carregar de cada mostra).

-Es connecta l'ànode (born vermell) de la font d'alimentació a la cubeta interior i el càtode
(born negre) al dipòsit exterior.

9
-Es regula el voltatge a 100 V fins que el front de l’electroforesi, que s'observa pel blau de
bromofenol, ha travessat el primer gel (“stacking gel”). A continuació el voltatge es puja
fins màxim 200 V fins que el marcador arriba a 1-2 cm de l'extrem inferior del gel (aprox.
1 h).

-Una vegada acabada l'electroforesi, es desconnecta la font d'alimentació, es treu el

tampó de la cubeta i es desmunta el "sandwich" (separant amb molta cura les plaques
amb una espàtula).

Abans de continuar el procés és necessari assenyalar una de les cantonades del gel amb
l’objectiu de saber la disposició de les mostres en el gel (per exemple, fent un petit tall en
l'extrem superior dret del gel).

-El gel que es tenyeix amb Coomasie es submergeix en la dissolució de tinció, es deixa
com a mínim 1 h (o 5-10 min amb el colorant Coomasie tipus Fastgel Blue R) i es
destenyeix amb la dissolució decolorant.

OBJECTIUS:

-Conèixer els principis de la separació de proteïnes en gels de poliacrilamida-SDS i saber

aplicar el procediment experimental.

-Aprendre el funcionament de les fonts d’electroforesis.

-Saber calcular les Mr de proteïnes problema i analitzar el grau de puresa d ‘una proteïna
determinada.

10