Grau de Nanociència i Nanotecnologia

Pràctiques de Biologia Molecular

Curs 2021-2022
Índex
ÍNDEX ............................................................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.2
DISTRIBUCIÓ D’EXPERIMENTS A LES SESSIONS DE PRÀCTIQUES ............................................................ 3
PRÀCTICA 1 ............................................................................................................................................ 4
UTILITZACIÓ DE LA TÈCNICA DE LA PCR PER L’ANÀLISI DEL POLIMORFISME DEL GEN CCR5 ..................... 4
Extracció de DNA genòmic de mucosa bucal ...................................................................................... 7
Preparació de les reaccions de PCR...................................................................................................... 8
Anàlisi dels amplicons obtinguts mitjançant electroforesis en gel d’agarosa ................................... 10
PRÀCTICA 2 .......................................................................................................................................... 13
IDENTIFICACIÓ GENOTÍPICA I FENOTÍPICA D’UN PLASMIDI ................................................................... 13
Preparació de cèl·lules competents i transformació .......................................................................... 14
Transformació de cèl·lules competents ............................................................................................. 19
Miniprep de DNA plasmídic ............................................................................................................... 20
Digestió amb enzims de restricció ..................................................................................................... 21
Anàlisi espectrofotomètrica del DNA ................................................................................................. 23
INFORMACIÓ ANNEXA ...................................................................................................................... 26

2
Distribució d’experiments a les sessions de pràctiques

Sessió 1.
Pràctica 1: Utilització de la tècnica de la PCR per l’anàlisi del polimorfisme del gen
CCR5.
Extracció de DNA genòmic de mucosa bucal
Preparació de les reaccions de PCR

Pràctica 2: Identificació genotípica i fenotípica d’un plasmidi

Preparació de competents i transformació
Sembra en medi selectiu i en medi líquid
Preparació d’un gel d’agarosa

Sessió 2.
Pràctica 1:
Anàlisi dels amplicons obtinguts mitjançant electroforesi en gel d’agarosa
Interpretació dels resultats

Pràctica 2:
Lectura dels transformants
Purificació de DNA plasmídic
Digestió amb enzims de restricció
Preparació d’un gel d’agarosa

Sessió 3.
Pràctica 2:
Carregar les mostres digerides en un gel d’agarosa
Anàlisi de la digestió mitjançant electroforesi en gel d’agarosa
Anàlisi espectrofotomètric del DNA plasmídic
Interpretació dels resultats
TEST FINAL

3
PRÀCTICA 1
DETERMINACIÓ DEL POLIMORFISME DEL GEN CCR5 MITJANÇANT LA REACCIÓ EN
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).

UTILITZACIÓ DE LA TÈCNICA DE LA PCR PER L’ANÀLISI DEL POLIMORFISME DEL

GEN CCR5

Kary B. Mullis va ser el nord-americà que va idear la tècnica de la PCR (Premi Nobel
de Química el 1993). Aquesta tècnica consisteix en la síntesi enzimàtica d’una
seqüència de DNA per part d’una polimerasa i a partir de dos oligonucleòtids que
hibriden amb cadenes oposades i en sentit contrari, i que delimiten la seqüència a
amplificar (Fig 1). Aquests oligonucleòtids s’anomenen encebadors o “primers”. La
reacció consisteix en la repetició d’un cicle tantes vegades com es vulgui. Un cicle està
format per tres etapes a diferents temperatures:

1. Desnaturalització (90-95 ºC): les cadenes de DNA motlle es separen.

2. Hibridació o unió dels encebadors (40-65 ºC): els encebadors s’uneixen a la regió
complementària de la seqüència a amplificar.
3. Polimerització o síntesi (72 ºC): la polimerasa allarga les cadenes dels encebadors.

Per a cada cicle el nombre de molècules de DNA es duplica, de manera que

l’amplificació és exponencial. Teòricament, el nombre de molècules finals serà el
nombre d’inicials multiplicat per 2n, essent n el nombre de cicles. Així, una sola
molècula de DNA podria passa a 3.5 milions de molècules en només 25 cicles. El
producte d’una reacció de PCR normalment es visualitza mitjançant electroforesi en
gel d’agarosa, però també es pot purificar per HPLC o per altres tècniques. Els
productes es poden utilitzar després en tècniques clàssiques de DNA recombinant.

4
Figura 1: Breu esquema representatiu de les diferents etapes de la tècnica de la PCR. Els
encebadors es mostren en color verd.

Habitualment es fan servir DNA polimerases molt termostables. La “Taq polimerasa”,

extret de Thermus aquaticus, és una DNA polimerasa termoestable, que pot resistir
temperatures de 95 ºC durant força temps (de 30 min a 1 h). Els cicles de temperatura
es realitzen en màquines anomenades “termocicladors” que són instruments que
aconsegueixen pujar i baixar la temperatura de forma molt ràpida i programable. Això
ha permès automatitzar la tècnica de la PCR.
Els encebadors o “primers” són un dels punts més crítics per a que una reacció de PCR
funcioni bé. En el disseny d’aquests oligonucleòtids s’han de tenir en compte factors
com: la longitud (20-30 nucleòtids), el % de GC, la presència d’estructures secundàries
amb ell mateix, la complementarietat entre ells (dimerització de primers), etc. Tots

5
aquests factors són molt importants per a determinar l’especificitat de la recció. De
fet, segons com siguin el encebadors, es podran dur a terme unes condicions
d’hibridació més severes aconseguint productes més purs.
El tampó de la reacció és també un paràmetre força important per a determinar l’èxit
de la reacció. En particular, la concentració de MgCl2 (0.5 mM a 5 mM) té un efecte
espectacular en l’especificitat i eficiència de l’amplificació. Aquest efecte és degut a
que el Mg2+ ajuda a estabilitzar el DNA de doble cadena. Generalment un excés de
MgCl2 comporta amplificacions no específiques i, en canvi, un defecte comporta una
disminució en el rendiment de la reacció.
Els paràmetres del cicle (temperatures, temps i nombre de cicles), sobretot la
temperatura de l’etapa d’hibridació, són variables a considerar en l’optimització de la
reacció.
La PCR no només és una tècnica molt potent sinó que també és molt versàtil. A nivell
de recerca, per exemple, s’utilitza com alternativa al clonatge en bacteris per a
detectar i quantificar l’expressió d’un gen, per a fer mutagènesi dirigida, per a
seqüenciar, per a fer estudis de polimorfismes gènics, per a sintetitzar sondes de DNA,
etc. Aquestes mateixes reaccions de la PCR es poden utilitzar a nivell de biologia clínica
(diagnosi de malalties víriques (retrovirus integrats al genoma del pacient), diagnosi
prenatal de malalties congènites, etc) o fins i tot com a tècnica forense.
És una tècnica molt potent que requereix de molt poc material d’àcid nuclèic de
partida, i que pot ser obtingut de fàcilment com a partir de una gota sang, mucosa
bucal, cabell...etc.
En aquesta pràctica determinareu quin és el vostre genotip pel gen CCR5 a partir de
DNA de mucosa bucal o cabell.
El receptor CCR5 s’expressa predominantment a cèl·lules T, macròfags, cèl·lules
dendrítiques i micròglia. Es creu que té un paper en les respostes inflamatòries en
resposta a infeccions, encara que el seu paper funcional a la funció immune normal no
està ben clar.
Aquest receptor té una variant genètica CCR5-Δ32 que consisteix en una deleció d’un
segment de 32 pb. Aquesta deleció està àmpliament distribuïda a la població Nord
Europea i els seus descendents (5-14%). Les persones que tenen aquesta deleció són

6
sanes. S’ha vist que la deleció del segment de 32 pb del receptor disminueix la
probabilitat d’infecció per HIV (soca R5) i la verola.

MATERIAL
-Bastonets amb cotó
-Bany termostatitzat (85ºC)
-Centrífuga eppendorf.
-Termociclador
-Tubs PCR
-Puntes de 2-200 μl
-Tubs eppendorf
-Chelex 10%
-Proteïnasa K (20 mg/ml)
-Taq polimerasa (1U/µl)
-dNTP mix 10 mM
-Encebador CCR5 directe, 5´TTCATTACACCTGCAGCTCT3´ (5 µM)
-Encebador CCR5 revers, 5´TCACAGCCCTGTGCCTCTTCT3´ (5 µM)

PROCEDIMENT

Extracció de DNA genòmic de mucosa bucal

1. Amb un bastonet raspar la mucosa bucal

2. Posar en un tub eppendorf 500 μl de Chelex 10%. Afegir 20 μl de proteïnasa K.
3. Posar l’extrem del bastonet, amb que s’ha raspat la mucosa, barrejar i deixar-lo
(amb el tub obert) 15 min al bany a 56ºC.
4. Incubar 10 min a 86ºC.
5. Treure el tub del bany, agitar el bastonet i treure’l.
6. Barrejar la mescla vigorosament amb el vòrtex.
7. Centrifugar 12000 x rpm, 1 min.
8. Agafar 100 μl de la part soluble vigilant de no arrossegar reïna Chelex. Reservar a
temperatura ambient fins que tinguem la màster mix de la PCR preparada

7
Preparació de les reaccions de PCR

Prepararem 2 reaccions, una per cadascuna de les mostres de

DNA obtingudes per grup (si sou tres persones modifiqueu les quantitats de “màster
mix”). La reacció control negatiu (sense DNA) i la reacció control positiu (amb DNA
prèviament obtingut) es faran per cada 5 grups.
1. Prepareu una “ màster mix “ per 2.5 reaccions:

Reactiu [stocks] [final] Reacció MASTER MIX

H20 27.5 68.75
Tampó polimerasa 10x 1x (2 mM de 5 12.5
MgCl2)
dNTPs 10 mM 200µM 1 2.5
Encebador CCR5 directe 5µM 1µM 5 12.5
Encebador CCR5 revers 5µM 1µM 5 12.5

2. Dipositeu 43.5 μl de la barreja “màster mix” a 2 tubs de PCR

3. Afegiu 4 μl de DNA extret de la vostra mucosa bucal al tub de PCR (dels 100 μl que
tenim reservats). En el cas dels controls, afegiu 4 µL d’aigua al tub control negatiu i 4 μl
de DNA control positiu al tub corresponent.
4. Afegiu 2.5 μl de Taq polimerasa a cada tub.
5. Apliqueu el programa següent

95ºC, 5 min
35 cicles de:
95ºC, 1 min
54 ºC, 1 min
72ºC, 15 seg
Per acabar amb:
72ºC, 1min
10ºC, indefinit.

8
L’amplificació de la regió del gen CCR5 normal dona una banda d’una mida de 182
pb aproximadament, i en el cas que contingui la deleció, té una mida de uns 150 pb
(Fig. 2).

Figura 2: Fragment de seqüenciar del gen CCR5. Ombrejada s’indica la seqüència de 32 nt

delecionada en l’al·lel CCR5-Δ32. El encebadors s’han dissenyat per hibridar en les regions
indicades amb fletxa.

9
Anàlisi dels amplicons obtinguts mitjançant electroforesis en gel d’agarosa
L’electroforesi permet separar molècules carregades per aplicació d’un camp elèctric.
L’agarosa s’obté d’una alga marina i és un polímer lineal de D-galactosa i 3,6 anhidro L-
galactosa, que forma un gel mitjançant la unió per ponts d’hidrogen entre les diferents
cadenes.
Els àcids nucleics, carregats negativament a pH neutre migren cap a l’ànode.
Segons la mida dels fragments d’àcids nucleics a separar s’utilitza un percentatge
diferent d’agarosa. En aquesta taula s’indica el percentatge d’agarosa que es recomana
utilitzar segons la mida dels fragments d’àcid desoxiribonucleic (DNA) a separar en
kilobases (kb):

% Agarosa rang dels fragments de DNA (kb)

(p/v)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-12
1.0 0.5-10
1.2 0.4-7
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
3.0 0.08-0.5

Els fragments de DNA més petits (10-500 bp) se separen millor en gels de
poliacrilamida. Els gels d’agarosa tenen menys capacitat de resolució però permeten
separar en un rang més ampli.
Els fragments lineals de DNA de doble cadena migren per la matriu del gel a una
velocitat inversament proporcional al logaritme del nombre de parells de bases. Les
molècules més grans, degut a la fricció i a la major dificultat que troben per passar pels
porus del gel, es mouen més lentament.
El DNA de doble cadena migra a una velocitat diferent segons la seva conformació:
DNA circular covalentment tancat (forma I); DNA circular obert (forma II) o DNA
linealitzat (forma III). L’ordre de migració d’aquestes tres formes varia segons el %
d’agarosa, la força iònica del tampó i la quantitat de bromur d’etidi.

10
Les bandes de DNA separades en el gel poden visualitzar-se per tinció amb bromur
d’etidi, un compost que quan s’intercala entre les bases de DNA emet fluorescència si
s’il·lumina amb llum ultraviolada. La presència de bromur d’etidi modifica
lleugerament la mobilitat del DNA- Alternativament es poden visualitzar per tinció amb
SYBR-safe, que també augmenta la seva emissió de llum de fluorescència en contacte
amb DNA, quan es exposat a llum del espectre ultraviolat proper, i que és menys
mutagènic que el Bromur d’etidi. Els fragments de DNA detectats poden recuperar-se
dels gels d’agarosa i utilitzar-se per tècniques de clonatge. Les bandes d’interès es
retallen del gel i es recupera el DNA mitjançant fusió de l’agarosa o electroelució.

MATERIAL
-Puntes de 2-200 μl
-Tubs eppendorf
-Agarosa
-Tampó TAE 50x
-Tampó de càrrega 10x
-Marcador de pes molecular : 100 pb DNA ladder, 1µg/µL (Biotools) veure Annex 1
-SYBR-safe
-Cubeta d’electroforesi
-Font d’electroforesi
-Microones

PROCEDIMENT
1. Preparar un gel d’agarosa al 2% en tampó TAE (1X) amb Red-safe (diluint-lo
1/20.000).
2. Prepareu les mostres amb tampó de càrrega: 45 μl de la PCR barrejats amb 5 μl de
tampó de càrrega (10X).
3. Carregar les mostres i el DNA patró de mida coneguda (100 pb DNA ladder) al gel,
submergit en tampó TAE (1X), i aplicar 100V durant aproximadament 1 h.
4. Visualitzar les bandes de DNA mitjançant excitació del SYBR-safe amb llum
ultravioleta-propera i adquisició d’imatge amb càmera digital.
5. Anàlisi dels resultats dels controls positius i negatius.
6. Comprovació de la mida de les bandes corresponents al fragment normal i al que
conté la deleció.
7. Interpretació del genotip de les persones del grup de pràctiques.

11
BIBLIOGRAFIA RELACIONADA:

-Aikhionbare, Felix O. a; Newman, Cheryl b; Womack, Chad ac; Roth, William W. a;

Stringer, H. Gene Jr d; Bond, Vincent C. a Characterization of a third CCR5 amplicon
from CCR5-[DELTA]32-heterozygous HIV-1-infected individuals AIDS. 13(12):1585,
August 20, 1999.

12
PRÀCTICA 2

IDENTIFICACIÓ GENOTÍPICA I FENOTÍPICA D’UN PLASMIDI

L’objectiu de la pràctica és introduir els conceptes essencials de la metodologia del
DNA recombinant (rDNA), un conjunt de tècniques i procediments per a l’aïllament,
caracterització, modificació, clonació i expressió de molècules d’àcid nucleic que
representa, des del 1972 amb els primers experiments de Paul Berg (premi Nobel
al 1980), l’aplicació tecnològica dels coneixements de la biologia molecular com a
disciplina que estudia l’estructura dels gens, la seva expressió i el control d’aquesta
expressió, és a dir la informació genètica.

Objectius
L’objectiu general d’aquesta pràctica és l’ identificació fenotípica i genotípica d’un
plasmidi problema mitjançant tècniques bàsiques de Biologia Molecular. S’utilitzaran
dos plasmidis, pGLO que expressa la proteïna fluorescent verda (GFP, de l’anglès,
Green Fluorescent Protein), procedent de medusa Aequorea victoria i el pUC19 que
expressa el fragment alfa de la β-galactosidasa. L’expressió de les proteïnes
codificades en les plasmidis permetrà l’ identificació fenotípica dels plasmidis i
observar el flux de la informació gènica DNA →RNA→Proteïna.
L’ identificació genotípica del plasmidi purificat es farà per digestió amb enzims de
restricció i electroforesi en gels d’agarosa. També es realitzarà l’anàlisi
espectrofomètric del DNA plasmídic obtingut que permetrà l’avaluació de la
concentració i la puresa de la preparació.

13
Preparació de cèl·lules competents i transformació
La "transformació" s'ha definit com el canvi heretable en les propietats d'una
soca bacteriana (receptora) per part del DNA d'una altra (soca donant): la cèl·lula
receptora que expressa el caràcter genètic de la donant s'anomena
"transformant". La transformació és un fenomen natural que no està restringit a
l'àmbit del laboratori. Des del seu descobriment en Pneumococcus, la
transformació genètica s'ha observat en diversos gèneres bacterians com
Streptococcus, Bacillus, Haemophilus i Acinetobacter. En aquests sistemes de
transformació naturals, els bacteris entren generalment en un estat de creixement
conegut com "competència". La competència es defineix com l'habilitat d'una soca
receptora de transportar DNA nu (DNA exogen) des del medi de cultiu cap a
l'interior de la cèl·lula. Les cèl·lules competents "naturals" són capaces d'incorporar
el DNA en una forma que resisteix l'acció de nucleases endògenes. Escherichia coli
no posseeix un mecanisme natural de transformació però al 1970 Mandel i Higa
van trobar que l'estat de competència es podia induir artificialment exposant les
cèl·lules a una dissolució hipotònica (50-100 mM) de clorur càlcic (formació
d’esferoplasts) i que una elevació sobtada i momentània de la temperatura (xoc
tèrmic) produïa l’entrada del DNA exogen en les cèl·lules tractades. Els protocols
de preparació de cèl·lules competents i transformació per a diferents
microorganismes o soques bacterianes poden variar en relació als reactius
químics i condicions físiques emprades però, en general, tots ells comparteixen
dues característiques: la desestabilització de la membrana cel·lular de la soca
receptora i la precipitació del DNA transformant en complexos resistents a l'acció
de nucleases. Diversos factors influencien l'eficiència de transformació: entre altres,
l’espècie i la concentració del catió divalent utilitzat, la forma (CCC, OC, linear), massa
molecular i concentració del DNA, i l’estat genètic de la cèl·lula receptora (p.e.,
mutants amb embolcall cel·lular alterat o que no posseeixen sistemes de
modificació-restricció de DNA donen eficiències de transformació més elevades).
La figura 3 mostra un esquema del procediment de transformació de cèl·lules
d’E. coli per tractament amb clorur càlcic i xoc tèrmic.

14
Figura 3. Transformació de Escherichia coli

Els plasmidis que emprarem en la pràctica són el pGLO i el pUC19 (Figura 4). Tots dos
plasmidis porten un gen que codifica la β-lactamasa, enzim de localització
periplasmàtica que hidrolitza l’ampicil·lina i, per tant, confereix a la soca portadora
resistència a aquest antibiòtic. Per això, aquest antibiòtic s’utilitzarà per seleccionar les
cèl·lules transformades. Parts alíquotes de les cèl·lules transformades s'inocularan en
plaques de medi no selectiu (medi LB) i medi selectiu (LB + ampicil·lina). La diferència
en el creixement a les plaques de medi selectiu i no selectiu donarà una idea gràfica
de l'eficiència de transformació. S’inclourà un control negatiu, que es farà en paral·lel
transformant una alíquota de cèl·lules competents amb tampó Tris-EDTA (TE), és a

15
dir sense DNA. L'absència de colònies a la placa de medi LB +ampicil·lina
corresponent al control negatiu mostrarà també de manera gràfica que els
transformants resistents a ampicil·lina (presumptes transformants) provenen de
cèl·lules competents que han incorporat algú dels plasmidis. La mescla de
transformació es sembrarà també en plaques de LB+ampicil·lina+arabinosa i plaques
de LB+ampicil·lina+IPTG + X-gal. En aquests medis i en funció del plasmidi incorporat
, les colònies transformades presentaran un fenotip clarament distingible (selecció
fenotípica) que permetrà deduir quin dels dos plasmidis contenen. Dues colònies
transformades amb el mateix plasmidi problema es faran créixer també en medi
líquid i a partir d'aquests cultius s'obtindrà el DNA plasmídic (minipreparació de DNA
plasmídic). El DNA obtingut es digerirà amb enzims de restricció i les mostres
digerides s'analitzaran mitjançant electroforesi en gel d'agarosa i tinció amb SYBr
safe. Aquest procediment permetrà establir una correlació directa entre el
fenotip observat a les plaques i el genotip determinat pel plasmidi (pUC19 o
pGLO) incorporat durant la transformació.
El plasmidi pGLO conté el gen de la GFP i el gen araC que codifica per la proteïna AraC.
Aquest plasmidi conté també un promotor induïble pel sucre arabinosa que controla
l’expressió del gen GFP. El gen de la GFP s’expressa a les cèl·lules transformades
afegint arabinosa al medi de cultiu (l’arabinosa s’acomplexa amb la proteïna produïda
pel gen araC i a llavors aquesta proteïna acomplexada facilita la unió de la RNA
polimerasa al promotor que controla l’expressió de la GFP. Per altre banda, el plasmidi
pUC19 conté el fragment alfa de la β-galactosidasa (lacZ’) sota el control del promotor
lac induïble per IPTG. Quan el fragment alfa de la β-galactosidasa s’expressa en
cèl·lules que creixen en un medi amb IPTG i X-gal, aquest fragment degrada el X-gal
produint un producte insoluble de color blau.

16
A)

B)

Figura 4: Plasmidis emprats en la pràctica A) Mapa del pGLO. B) Mapa del pUC19

17
El mètode original de Mandel i Higa va ser posteriorment millorat per Cohen i col.
(1972, 1974) i, juntament amb la construcció, introducció i manteniment estable i
funcional de plasmidis híbrids o quimèrics en E. coli , es pot considerar la base de
l'enginyeria genètica. El protocol de preparació i transformació de cèl·lules
competents descrit a continuació és una adaptació dels mètodes originals que
dóna bones eficiències de transformació (de l'ordre de 105-106 transformants per
µg de DNA) amb plasmidis petits (3,0 a 16 kb) i soques de E. coli utilitzades
habitualment en experiments de DNA recombinant (p.e., HB101, MC1061, TG1,
XL1-Blue, DH5α).

MATERIAL
- Medi de cultiu Luria Bertani (LB)
-Plaques de Medi LB sòlid (2 LB, 2 LB/amp, 1 LB/amp/IPTG/X-gal, 1 LB/amp/ara). El
medi LB sòlid és igual que el LB líquid i porta a més bacto-agar (15 g/l). Després
d’esterilitzar amb autoclau (20 min a 121 °C) s'afegeixen els antibiòtics (ampicil·lina i
altres suplements (arabinosa, IPTG i X-gal) a partir de solucions stock a les
concentracions finals següents:
Ampicil·lina 50 µg/ml (stock: 25 mg/ml, conservar a -20 °C)
IPTG 24 µg/ml (stock: 200 mg/ml, -20 °C)
X-Gal 40 µg/ml (stock: 20 mg/ml en dimetilformamida, -20 °C)
L-arabinosa 6 mg/ml (s’afegeix directament en pols al medi)
-Plasmidis problema (pUC19, pGLO) dissolts en tampó TE a 30 ng/µl.
- Al.líquotes cèl.lules competents DH5α
-Bany d'aigua a 42°C.
-Estufa a 37°C.
-Bany de gel.
-Centrífuga per tubs Eppendorf.
- Pipetes automàtiques de 20, 200 i 1000 µl.
-Tubs eppendorf, puntes de pipeta (grogues i blaves) i escuradents esterilitzats amb
autoclau.
-Nanses de Drigalsky.

Tot el material sòlid (puntes de pipeta, “loops” i altres) que hagi estat en contacte
amb els bacteris i/o amb el plasmidi pGLO ha de dipositar-se en recipients amb
bossa de plàstic per ser autoclavats posteriorment. El material líquid que entri en
contacte amb els bacteris i/o plasmidi ha de posar-se dins d’un recipient amb 10% de
lleixiu.

18
Transformació de cèl·lules competents
Nota: les cèl·lules competents són fràgils i cal tractar-les amb cura.

PROCEDIMENT
1. Afegir 10 µl del plasmidi problema (A o B) un dels tubs amb 0.15 ml de cèl·lules
competents [retolar amb "+"] i 10 µl de d’aigua autoclavada a l'altre tub [retolar amb
"-"; control negatiu].
2. Barrejar i deixar 10-15 min en gel.
3. Donar un xoc tèrmic transferint ràpidament els tubs a 42° c durant 120 s sense
agitació.
4. Transferir immediatament els tubs a un bany de gel durant 1-2 min
5. Afegir a cadascun 0.9 ml de medi LB.
6. Incubar durant 45 min a 37° c (no cal agitació). [aquesta incubació és
necessària per a L'expressió del gen de resistència a l’ampicil·lina i la recuperació de
les cèl·lules]
7. Centrifugar les cèl·lules 3 minuts a 6000xg. El·liminar 500 µl del sobrenedant i
resuspendre molt suament el pellet en volum que de medi que ha quedat en
l’eppendorf.
8. Inocular 100 µl de la suspensió de cèl·lules transformades (tub "+") en cadascuna de
les plaques:
-LB+ amp
-LB+ amp+IPTG+X-gal
- LB+ amp+ara
- LB
9. Inocular 100 µl del control negatiu (tub "-") en plaques de LB+amp.
[retolar oportunament les plaques; estendre el líquid damunt Del medi amb l'ajut
d'una nansa de Drigalsky];
10. deixar absorbir el líquid a temperatura ambient, invertir les plaques i incubar
durant la nit (12-16 h) en estufa a 37° C.
11. Apilar les plaques i ajuntar-les amb cinta adhesiva. Marcar les plaques, al fons de la
pila, amb el nom del grup. Col·locar les plaques, cap per avall, a l’incubador a 37 ºC fins
l’endemà.

19
11. Analitzar els resultats obtinguts:
i. Controls: viabilitat, contaminació
ii. Identificació fenotípica per la inducció de l’expressió de la GFP o
el fragment alfa de la β-galactosidasa
iii. Càlcul de la freqüència de transformació expressada en nombre
de colònies per µg de plasmidi
iv. Avalueu el valor obtingut

Miniprep de DNA plasmídic

En els darrers anys s'han desenvolupat diversos procediments que de forma
simple, ràpida i reproduïble permeten l'aïllament del DNA plasmídic. En general,
tots els mètodes s'aprofiten de la grandària relativament petita i de la configuració
circular covalentment tancada (CCC DNA) de les molècules de DNA plasmídic.
Tanmateix, tots els mètodes requereixen una lisi "suau" de les cèl·lules bacterianes
de manera que el DNA plasmídic es preservi intacte i pugui separar-se del DNA
cromosòmic. En aquesta pràctica, l'obtenció de DNA plasmídic es farà segons el
mètode de la lisi alcalina en petita escala descrit per Sambrook, Fritsch i Maniatis
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual. CSH, 1989). El mètode, original de Birnboim
i Doly (1979), és ràpid, reproduïble i, a part d'espècies entèriques com E. coli, ha estat
utilitzat amb èxit en diversos gèneres bacterians. El rendiment de la preparació pot
variar de plasmidi a plasmidi i de soca a soca (i d'alumne a alumne!); en el cas de
plasmidis de replicació relaxada i alt nombre de còpies per cèl·lula, com el pUC118, pot
arribar a ser de 3-5 µg per ml de cultiu. S'inclourà un pas de desproteinització amb
fenol per assegurar que el DNA obtingut sigui digerible per enzims de restricció.

20
Cada vegada amb està més estès l’ús dels Kits comercials per a l’extracció de DNA
plasmídics. Aquests Kits estan basats en el mètode de la lisi alcalina són ràpids a la
vegada que proporcionen un bon rendiment, deixen el DNA net i lliure d’RNA.

MATERIAL
- Cultiu de nit en medi líquid LB+ampicil·lina (50 µg/ml).
- Kit de miniprep NZYTech (Veure Annex 2)
- Tampó TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0), esterilitzat amb autoclau (20 min a
121 °C). Pot contenir RNAsa A a la concentració final de 20 µg/ml.
- Incubador-agitador a 37 °C.
- Centrífuga per a tubs Eppendorf.
- Agitador-mesclador "vòrtex".
- Pipetes automàtiques de 20, 200 i 1000 µl.
- Tubs estèrils (p.e., de 10 ml) per als cultius líquids.
- Tubs eppendorf, puntes de pipeta (grogues i blaves) i escuradents esterilitzats amb
autoclau.
- Guants de làtex.
- Bany de gel.

PROCEDIMENT
S'escolliran a l'atzar 2 colònies de la placa transformada amb el mateix plasmidi
problema que heu fet servir per la transformació (A o B) i s'inocularà cadascuna en 3
ml de medi líquid LB + ampicil·lina (50 µg/ml). Per a la inoculació del cultiu líquid,
s'utilitzaran escuradents. Aquests cultius s'incubaran tota la nit a 37° C amb
agitació forta (p.e., 250-300 rpm) i seran el material de partida per a la
preparació de DNA plasmídic.

1. Seguir Protocol Annex 2

Digestió amb enzims de restricció

Les endonucleases de restricció són enzims que tallen ambdues cadenes del DNA
en punts interns de la molècula després de reconèixer-hi seqüències
nucleotídiques específiques. S'han descrit tres tipus d'enzims de restricció:
- de Tipus I, reconeixen una seqüència específica però tallen el DNA a l'atzar a
certa distància del seti de reconeixement; necessiten com a cofactors per a la seva
activitat ATP, Mg2+ i S-adenosilmetionina .

21
- de Tipus II, reconeixen una seqüència específica (seqüències palindròmiques sovint
de 4 a 6 parells de bases) i tallen el DNA per un punt també específic que
generalment es troba dins de la seqüència reconeguda; només necessiten Mg2+.
- de Tipus III, tallen el DNA a 24-26 bases de l'extrem 3' del seti de
reconeixement i necessiten ATP i Mg2+.
A causa de la seva especificitat, els enzims de restricció de Tipus II han esdevingut
eines importants per a l'anàlisi, mapat i clonatge del DNA. La seva nomenclatura
segueix habitualment aquesta regla: tres lletres en cursiva per a designar
l'organisme productor (la primera el gènere i les dues següents l'espècie), un número
i/o lletra per a indicar la soca i, per últim, un número en romà per al sistema de
restricció concret quan l'organisme productor en presenta més d'un. Els
enzims que reconeixen la mateixa seqüència s'anomenen "isosquizòmers".
En aquesta pràctica s'utilitzaran els enzims de restricció EcoRI i Sca I que tallen
els plasmidis pGLO i pUC19 per un sol punt; per tant, la digestió doble donarà lloc a 2
fragments. L'anàlisi de les digestions es farà per electroforesi en gel d'agarosa i tinció
amb SYBr safe. En el quadre següent s'indica l'origen, la seqüència reconeguda i el punt
de tall dels enzims de restricció utilitzats:

Enzim Origen Seqüència de tall

▼
EcoR I Escherichia coli G AATT C
C TTAA▲G
▼
Sca I Streptomyces caespitosus AGT ACT
TCA▲TGA

MATERIAL
- Minipreps de DNA.
- Enzims de restricció EcoRI i ScaI i tampons de digestió x10, conservats a –20° C.
- H2O destil·lada esterilitzada amb autoclau (20 min a 121 °C).
- Tampó d'aplicació x10 [per a 10 ml: 2 g Ficoll 400, 4 ml EDTA 0.25 M (pH 8.0),1 ml SDS
al 10%, 25 mg Blau de bromofenol, 25 mg Xilè cianol, H2O fins a 10 ml].
- Centrífuga per a tubs Eppendorf.
- Bany d'aigua a 37° C i bany de gel.
- Pipeta automàtiques de 20 µl.
- Tubs eppendorf i puntes de pipeta grogues esterilitzats amb autoclau.

22
PROCEDIMENT
1. En un tub eppendorf estèril preparar la reacció següent (afegir els components en
l’ordre indicat):
Tampó de digestió x10 2 µl
Miniprep DNA (en TE) 16 µl
Enzim EcoRI 1 µl
Enzim ScaI 1 µl
ALERTES!!
a) CANVIAR la punta de pipeta en afegir cadascun dels components de la reacció.
b) SOSTENIR els tubs d'enzim per la part superior del tub per a no "escalfar" l'enzim.
Els enzims de restricció són molt làbils en absència del substrat (DNA); es conserven a
–20° C i quan surten del congelador s'han de posar immediatament en gel.
c) La dissolució stock d'enzim conté glicerol al 50%. ASSEGURAR-SE de no agafar més
de 1 µl de cada enzim ja que un excés de glicerol (>5%) pot inhibir o alterar la seva
activitat.
2. Incubar tota la nit a 37° C;
3. Aturar la reacció afegint-hi 3µl de tampó d'aplicació x10, donar un pols de
centrífuga i conservar fins la seva anàlisi per electroforesi en gel d’agarosa al 0,8%.
Els fragments (en parells de bases -pb-) que cal esperar de cada plasmidi són:
-pGLO: 4492 i 879 pb
-pUC19: 1781 i 905 pb
Com a marcador de pes molecular s’utilitzarà el ladder de 1kb (veure Annex 1).

Anàlisi espectrofotomètrica del DNA

Es realitzarà una anàlisi espectrofotomètrica del DNA genòmic obtenint l'espectre
d'absorció entre 320 i 220 nm. Les mesures d'absorbància a 260, 280 i 230 nm són
útils per a quantificar preparacions d'àcids nucleics i determinar-ne la qualitat
(puresa). Per a una solució de DNA de doble cadena (dsDNA), 1 unitat de A260
equival a una concentració de 50 µg/ml. Per DNA de cadena senzilla (ssDNA), 1
unitat de A260 equival a 33-34 µg/ml. En mostres pures de DNA la relació A260/ A280

23
és d'aprox. 1.8; valors superiors indiquen presència de RNA i valors inferiors
indiquen contaminació de fenol i/o proteïna.

MATERIAL
- Tampó TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0), esterilitzat amb autoclau (20 min a
121 °C).
- Espectrofotòmetre UV i cubetes per a llegir a la regió UV (quars o plàstic especial).

PROCEDIMENT
1. Preparar 0.5 ml d'una dilució (p.e., 1/20) de DNA en tampó TE [Abans d'agafar
l'alíquota per preparar les dilucions, barrejar bé la pipeta].
2. Dispensar la dilució en una cubeta d’espectrofotòmetre i obtenir els valors
d'absorbància (A) a 260 i 280 nm fent el zero de l'aparell amb tampó TE a cada
longitud d'ona (nm).

RESULTATS:
- Quantificació de la preparació de DNA:
• CONCENTRACIÓ:
50 µg/ml
[DNA] = UA260 x -------------- x factor dilució
1 UA260
• QUANTITAT:
[DNA] µg/ml x ml vol final preparació
- Estimació de la qualitat de la preparació de DNA:
• calcular les relacions UA260/ UA280

BIBLIOGRAFIA
- Ausubel, F.M. et al. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley &
Sons, N.Y.
- Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7, 1513-1523.
- Davis, L. G., Dibner, M. D. & Battey, J. F. (1986). Basic Methods in Molecular Biology.
Elsevier, N.Y.

24
- Pérez-Pons, J.A. & Querol, E. (1996). A laboratory class experiment illustrating
basic principles of DNA cloning and molecular biology techniques. Biochem.
Education 24, 54-56.
- Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y.

ANNEX 1
MARCADORS DE PES MOLECULAR DE DNA

25
26
ANNEX 2 (Protocol Nzytec MiniPrep)

1. Dispensar 1.5 ml del cultiu de nit en un tub eppendorf.

- Centrifugar 30 s a 12000 x rpm.
- Decantar el sobrenedant, afegir al tub la resta del cultiu i repetir el pas 2.
- Eliminar totalment el sobrenedant amb una pipeta

Col·locar la columna en un eppendorf estèril net i afegir amb cura 30 uL d’aigua Milli-Q
estèril en el centre del filtre de la columna. Incubar 1 minut a temperatura ambient.
Centrifugar a velocitat màxima 1 minut.
El DNA queda en els 30 uL recollits i es pot llençar la columna.

27