UF1 BIOLOGIA MOLECULAR

PCR
1. PROCÉS DE LA PCR
- Es basa en el mecanisme de replicació “in vivo” de l’ADN.
- Consisteix en 20 a 35 canvis repetits de temperatura anomenats cicles.
- Cada cicle sol consistir en 2-3 passos a diferents temperatures.
- L’ ADN que conté la regió d'ADN per amplificar (un gen anomenat TPA Alu de l’ ADN de
la saliva) s’anomena ADN motlle o diana (“target”)

2. Mix PCR
- 4 –desoxinucleòtids trifosfats (dNTP): substrat per la polimerització del nou ADN.
- Primers: 2 encebadors oligonucleòtids (seqüències d' entre 18 i 22 nucleòtids),
cadascun dels quals és complementari a un dels dos filaments del gen ATP de l’ADN
(s’uneixen a l’extrem 3’)
- Magnesi: cofactor per la polimerasa
- Solució amortidora que manté el pH adequat pel funcionament de la Taq polimerasa.
- Colorant vermell: per poder fer l’electroforesi sense haver d'utilitzar tampó de càrrega
- Taq polimerasa: copia l’ADN motlle afegint els nucleòtids

3. LES FASES QUE CONSTA

Inicialització
Aquest pas consisteix en escalfar la reacció fins a una temperatura de 94-96°C (1-9 minuts).
Això només és necessari per l‘activació de l’ADN polimerasa.
1. Desnaturalització
En primer lloc es desnaturalitza l'ADN (se separen els dos filaments que el componen).
Escalfament de la mostra a 94-95ºC

2. Aparellament/unió de l'encebador
A continuació es produeix l’ hibridació de l'encebador, és a dir, cada encebador és acoblat a la
seva seqüència complementària de l'ADN motlle. Temperatura a 50-65°C durant 20-40 segons
(segons el cas). Els encebadors actuen com a límits de la regió de la molècula per amplificar

3. Extensió/elongació de la cadena
L'ADN polimerasa pren l'ADN motlle per sintetitzar la cadena complementària (nou ADN) i
partint de l'encebador com a suport inicial.
Per realitzar aquest procés cal que la mostra estigui a una temperatura de 75–80°C.
La polimerasa sintetitza una nova cadena d'ADN complementària a la cadena motlle afegint els
dNTP (desoxiribonucleòtids trifosfat) complementaris en direcció 5' → 3',
4. Elongació final
Etapa única que es duu a terme a una temperatura de 70-74°C durant 5-15 minuts després de
l'últim cicle de la PCR. Assegura que qualsevol ADN de la cadena simple restant sigui totalment
ampliada.
Després de cada cicle, les cadenes d´ADN acabades de sintetitzar poden servir d’ ADN motlle
pel següent cicle.

5. Conservació
Es duu a terme a 4-15°C durant temps indefinit per conservar la reacció a curt termini

4. PCR QUANTITATIU (O REAL TIME PCR)

S’incorporen a la PCR uns fluorocroms que indiquen la quantitat de producte que s’està
copiant.
Dos tipus de fluorocroms possibles:
- Sybr Green: només s’intercala si hi ha doble cadena
- Marcatge amb sondes Taqman (preu bastant més alt). Són dues sondes específiques
que s’acoblen a la seqüència amb dos cromòfors.

Reporter que emet fluorescència, i Quencher: que l’absorbeix si està lligat al Reporter. Si la
sonda està unida, no s’observa fluorescència. Conforme va creixent la cadena, arriba a trencar
la molècula de Taqman i s’observa fluorescència.

Com que en cada cicle es dobla la fluorescència s’obté una gràfica com aquesta: