Cicles de grau superior

Laboratori Clínic i Biomèdic

Mòdul MP3
Biologia molecular i citogenètica

UF2. Tècniques
Judit Moreno de biologia
Crespimolecular
Curs 2022-2022
jmoreno@institutbonanova.cat
1
 UF2. Tècniques de biologia molecular
Resultat d’aprenentatge Ponderació %
RA1. Caracteritza els processos a realitzar al laboratori de 5
biologia molecular, relacionant-los amb els materials i equips.

RA2. Aplica tècniques d'extracció d'àcids nucleics a mostres 20

biològiques, seleccionant el tipus de tècnica en funció de la
mostra a analitzar.
RA3. Aplica tècniques de PCR i electroforesi a l'estudi dels 35 (25 + 10)
àcids nucleics, seleccionant el tipus de tècnica en funció de
l'estudi a realitzar.
RA4. Determina mètodes de clonatge i seqüenciació d'àcids 40 (30 + 10)
nucleics, justificant els passos de cada procediment d'anàlisi.

RA 5 Interpreta informació professional en llengua anglesa - Activitats i

manuals tècnics, instruccions, catàlegs de productes i/o serveis, pràctiques
articles tècnics, informes, normativa, entre d'altres, aplicant-ho Dossier de Prueba evaluativa escrita
en les activitats professionals més habituals. practiques Actividades aula y/o laboratorio

2
 Resultat d’aprenentatge 4

Determina mètodes de clonatge i seqüenciació d'àcids nucleics, justificant els passos de cada procediment d'anàlisi.

Criteris d’avaluació
4.1 Descriu el procés de clonació d'àcids nucleics.
4.2 Caracteritza els enzims de restricció, els vectors i les cèl·lules hoste utilitzades en les tècniques de clonatge.
4.3 Utilitza programes bioinformàtics per obtenir informació sobre l'inserit que es vol clonar.

RA4
4.4 Detalla la selecció de les cèl·lules recombinants.
4.5 Defineix el fonament i les característiques dels mètodes de seqüenciació.
4.6 Descriu el processament de les mostres a seqüenciar.
4.7 Caracteritza els seqüenciadors automàtics i els programes informàtics utilitzats en les tècniques de seqüenciació.
4.8 Estableix els passos a seguir en la lectura i interpretació de les seqüències.
4.9 Descriu les aplicacions dels procediments de clonació i seqüenciació en el diagnòstic clínic i teràpia genètica.
4.10. Caracteritza les tècniques d’inhibició o activació de l’expressió gènica in vitro e in vivo
CONTINGUTS
4 Determinació de mètodes de clonatge i seqüenciació de l'ADN:
4.1 Clonatge: components, tipus de vectors, fases del procediment de clonació i detecció dels clons recombinants.
4.2 Models animals transgènics (knock out/knock in)
4.3 Llibreries genòmiques
4.4 Bioinformàtica: anàlisis de dades.
4.5 Mètodes de seqüenciació de l'ADN. Automatització.
4.6 Tècnica de MLPA.
4.7 Tècniques per introduir material genètic en l’interior de cèl·lules procariotes i eucariotes.
4.8 Aplicacions diagnòstiques, forenses i en recerca de les tècniques clonatge i seqüenciació
4.9. Tècniques d’inhibició o activació de l’expressió gènica in vitro e in vivo
Clonación
 Clonación
El concepto de clonación…
• La clonación de ADN es una técnica de biología
molecular que hace muchas copias idénticas de un
fragmento de ADN, como un gen.
• En un experimento típico de clonación, se inserta un
gen blanco en un fragmento circular de ADN
llamado plásmido.
• El plásmido se introduce en bacterias mediante un
proceso llamado transformación y las bacterias que
contengan el plásmido se seleccionan mediante
antibióticos.
• Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para
hacer más ADN plasmídico o, en algunos casos, se
induce la expresión del gen para hacer proteína.
 Clonación
Etapas:
- Preparación del DNA y del vector
- Inserción del fragmento de DNA que se
quiere amplificar en el vector
- Introducción del vector recombinante en
la célula huésped
- Selección y multiplicación en cultivo de
las células huésped que tienen el DNA
recombinante
- Recuperación del fragmento amplificado

La técnica del ADN recombinante (ADNr) es una técnica utilizada

ingeniería genética y que consiste en la creación in vitro de
moléculas de ADN artificiales en las que se combina material
genético de distintas especies
 Características de la Clonación

- Técnicamente compleja (manual y larga)

- Se obtienen muchas copias de ADN
- Podemos clonar secuencias de gran tamaño, según el vector
utilizado
- Librerías genómicas (clonar el DNA genómico entero
fragmentándolo)
- Permite expresión de genes (industria, producción de
hormonas, proteínas, organismos transgénicos...)
Objectivos de la Clonación
1.- AMPLIFICACIÓ PER A L’ESTUDI DE PROPIETATS FÍSIQUES

-Seqüenciació
-Estudi de l’estructura dels àcids nucleics
-Estudis d’homologia entre espècies
-Identificació de mutacions

2.-AMPLIFICACIÓ PER A L’ESTUDI DE PROPIETATS FUNCIONALS (EXPRESSIÓ)

-Estudi de la transcripció i de la traducció

-Estudi de la regulació: seqüències promotores
-Producció de la proteïna (normal o alterada) o de l’mRNA per tal d’identificar-la,
estudiar les propietats, estudiar la funció o també per generar proteïnes per a ús
industrial, terapèutic etc.
 Aplicaciones de la clonación molecular

• Investigación básica:
• Descifrar secuencias génicas completas (genoma humano)
• Estudios filogenéticos

• Investigación aplicada
• Clonación en vectores de expresión para producción industrial de proteínas:
• Medico-farmaceutica: Insulina, hormona del crecimiento, vacunas, reactivos
diagnóstico....
• Industria química: catalizadores, enzimas...
• Medioambiente: microorganismos capaces de metabolizar petróleo, tóxicos etc
• Transgénicos: Mejora genética. Resistencia a plagas, enfermedades, tóxicos, más
fértiles
• Ratones transgénicos (knock out)
• Terapia génica: transferir genes a células somáticas
 Proceso de la Clonación

1. Creación del vector recombinante

a) Preparación del DNA que se va a clonar
b) Preparación del vector de clonación
c) Inserción del DNA en el vector

2. Introducción del vector en la célula huésped

d) Transformación
e) Transfección
f) Transducción
g) Electroporación

3. Selección e identificación de clones recombinantes

h) Genes de resistencia a antibióticos
i) Cromogenia LacZ
j) Proteínas fluorescentes
k) Genes letales
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a clonar
b) Preparación del vector de clonación
c) Inserción del DNA en el vector

Un vector, es ADN que

puede replicarse de manera Un inserto es un fragmento de ADN que
autónoma e independiente queremos clonar  (ATG –TAA)
del genoma de la célula
hospedera.
1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a
clonar
b) Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a

Enzimas de restricción b)
clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector

• Reconocen secuencias cortas (4-8pb) bicatenarias (dianas de restricción)

• Tipo I: corta a aprox. 1000 pb anterior o posterior. Generan fragmentos distintos, No BM.

• Tipo II: cortan en la misma diana. Generan patrones específicos (tijeras moleculares)

• Tipo III: corta a aprox. 30 pb anterior o posterior. Generan fragmentos distintos, No BM.

• Nomenclatura: 3 letras indica bacteria (Genero Especie) / cepa. ECOR1

• Extremos romos o cohesivos
• Aplicaciones: DNA recombinante
• Una unidad de enzima es la cantidad necesaria para cortar 1 microgramo de DNA en una hora
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a

Enzimas de restricción b)
clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante

Enzimas de restricción
a) Preparación del DNA que se va a
clonar
b) Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante

Enzimas de restricción
a) Preparación del DNA que se va a
clonar
b) Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a

ENZIMS DE RESTRICCIÓ b)
clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a
clonar
b) Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a
ENZIMS DE RESTRICCIÓ b)
clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante

Enzimas de restricción
a) Preparación del DNA que se va a
clonar
b) Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 Mapas de restricción

• El mapa de restricción es el diagrama donde están

dibujados los distintos lugares de restricción (dianas) en
una molécula de DNA.

• Este mapa lo generamos como consecuencia de la

digestión de los genomas con una enzima de restricción
concreta y posterior electroforesis para calcular el tamaño
de cada uno de los fragmentos.
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a

Mapas de restricción b)
clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a
clonar
1. Creación del vector recombinante b) Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector

a) Preparación del DNA que se va a clonar:

• Enzima de restricción que genere extremos cohesivos

• La digestión genera muchos fragmentos de diferentes
tamaños (para librerías genómicas)

• Si interesa un gen en concreto primero se amplifica por PCR

(las polimerasas sin actividad correctora generan un extremo
cohesivo con una A no apareada que se puede insertar en un
vector T)
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a

1 Creación del vector recombinante b)

clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector

b) Preparación del vector de clonación:

• Vector circular, con diana de restricción única

(plásmidos). Digestión con enzima de restricción, el
vector se transforma en una molécula lineal con
extremos cohesivos.

• Vector circular con dos dianas de restricción. Se

obtienen dos moléculas lineales con extremos
cohesivos, de tamaños muy diferentes. Uno grande
con marcadores de selección e identificación y uno
pequeño que será sustituido por el gen de interés.
 1. Creación del vector recombinante
a) Preparación del DNA que se va a

1 Creación del vector recombinante b)

clonar
Preparación del vector de
clonación
c) Inserción del DNA en el vector

c) Inserción del DNA en el vector

• Se mezclan y se incuban en condiciones que

favorezcan que las moléculas se unan por los
extremos cohesivos por complementariedad de
bases.
• La ligasa sella la unión (ligación)
• Se obtiene una mezcla de moléculas una de las
cuales es el vector que queremos recombinante, y
muchas que no nos interesan....
• Todos se introducen en las células huésped y luego
se van eliminando y seleccionando.
 Proceso de la Clonación

1. Creación del vector recombinante

a) Preparación del DNA que se va a clonar
b) Preparación del vector de clonación
c) Inserción del DNA en el vector

2. Introducción del vector en la célula huésped

d) Transformación
e) Transfección
f) Transducción
g) Electroporación

3. Selección e identificación de clones recombinantes

h) Genes de resistencia a antibióticos
i) Cromogenia LacZ
j) Proteínas fluorescentes
k) Genes letales
 Vectores/Huésped
Vectores

• Plásmidos
Huésped:
• Bacteriofagos o fagos •Bacterias
• Cósmidos •Levaduras
• Cromosomas artificiales •Células
• BAC
• YAC
 VECTOR
Un vector es esencialmente una molécula transportadora de DNA.

Características que debe cumplir un vector:

• Debe tener un origen de replicación que asegure que se replicará dentro de la
bacteria.
• Se debe replicar independientemente del huésped.
• Debe tener diferentes lugares de corte por enzimas de restricción que
permitirán unir DNA externo.
• Debe tener algún marcador de selección (normalmente son genes de
resistencia a los antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no
tiene), para poder diferenciar las células que tendrán el vector de las que no lo
tienen.
• El vector debe ser fácil de recuperar.
VECTOR
 Plásmidos

• Moléculas circulares de ADN bicatenario de origen bacteriano

• Capacidad de replicación
• Plásmidos naturales modificados como vectores
• Diferentes tamaño de inserto que pueden transportar
• Diferente número de copias de plásmido por células al replicarse

• pBR322 transporta fragmentos de 3.5-5 Kb, 20 copias por

célula
• pUC18 transporta hasta 10KB y 500 copias por célula
 Plásmidos

Ori Ori
Plásmidos
DNA per
clonar
Vector
plasmídic
Digestió amb Digestió amb endonucleasa i
endonucleasa separació de fragments

DNA ligasa
Vector recombinant

Transformació de cèl.lules
de E. coli competents

Selecció de bacteris
que han incorporat
el plàsmid
Placa d’ agar amb medi LB +
ampicil.lina
Plásmidos

Activitat b-galactosidasa
(selecció per presència
D’insert)
Polylinker o
Regió de clonació

Gen de resistència a
Ampicil.lina (selecció per
Presència de plàsmid)
Bacteriófagos

• Fagos

• Virus que infectan bacterias

• Ciclo lítico (mata cel)

• Ciclo lisogénico (incorpora DNA en

la célula y lo replica)

• Fago λ (insertos de 20Kb)

Bacteriófagos
El cicle lisogènic-lític del bacteriòfag l

E. coli
Unió del fag,
Lisi I alliberament de penetració i
partícules víriques Alliberament del DNA

Circularització del
genoma del fag
(seqüències cos)
Inducció del Integració I replicació amb
cicle lític el genoma bacterià
Bacteriófagos
 Cósmidos

• Vectores híbridos del fago λ y un plásmido bacteriano:

• Secuencia cos del fago λ
• Ori , gen de resistencia a antibiótico y polylinker de un plásmido
• Admite insertos de 50Kb
• Permite empaquetar como un fago para infectar E.coli
pero se mantiene en la célula como plásmido.
Cósmidos
Cromosomas artificiales

• Vectores que pueden transportan fragmentos grandes, vectores de

alta capacidad
• Permite construir genotecas

• BACs: cromosomas artificiales bacterianos 300Kb

• YACs: cromosomas artificiales de levaduras 1Mb

 BACs

• Resistencia antibiótico y selección LacZ

• Estabilidad mediante ori.
• Una o dos copias por célula.
BACs
YACs
• Sistema más utilizado para clonar fragmentos muy grandes de DNA.
• Llevan los tres elementos esenciales de los cromosomas de las levaduras:

• Un centrómero, necesario para la separación de las cromátidas hermanas

durante la mitosis y de los cromosomas homólogos durante la primera
división meiótica.
• Dos telómeros, necesarios para la replicación completa de moléculas
lineales y para proteger los extremos de los cromosomas de la digestión
por las nucleasas.
• Un elemento de replicación autónoma (ARS) que funciona como origen de
replicación.

• Contiene también el ORI de E coli. Por tanto, se puede replicar en bacterias

y en levaduras.
YACs
 Huéspedes bacterianos/procariotas

• Bacterias  E. Coli K12, Bacillus subtilis y

Streptomyces sp

• Fácil manipulación
• Rápido crecimiento
• Introducimos Plásmidos, fagos y
cósmidos

http://www.infosalus.com/salud-investigacion/noticia-bacterias-parte-positiva-20160312082935.html
Huéspedes eucariotas
Levaduras:
• YACs
• Saccharomyces cerevisiae
• Cultivo sólido o líquido

Células vegetales o animales

• Organismos transgénicos
• Vectores víricos en animales
• Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens para vegetales (Tumour
inducing plasmid en inglés) recibe el nombre por su capacidad para
hacer que las bacterias que lo portan sean capaces de inducir tumores
en las raíces o en el tronco de determinadas especies vegetales)