53enfermetats Rares

Treball de Recerca 2n Batxillerat
ORGANISMES GENÈTICAMENT
MODIFICATS, LA CLAU PER A
LA INVESTIGACIÓ DE
MALALTIES RARES
Enginyeria genètica
Pseudònim: Sarmar
Autora: xxxx xxxxxx xxxxxx
Tutora del Treball: xxxx xxxxxxx
Tutor del projecte BATX2LAB: xxxxxx xxxxxx xxxxx
Curs: 2022/2023
INS xxxxxx xxxxxxxxx
Segon de Batxillerat x
0
Organismes Genèticament Modificats, la clau per a la investigació de malalties rares
AGRAÏMENTS
Abans de començar, m’agradaria aprofitar aquest espai per agrair immensament a totes
aquelles persones que han col·laborat i han fet possible la realització d’aquest Treball de
Recerca.
En primer lloc, voldria agrair el gran suport rebut per part de la meva tutora xxxx
xxxxxxx que m’ha acompanyat durant tot el procés d’elaboració, m’ha guiat i ajudat en
tot moment. Gràcies a la seva implicació, interès i disposició s’ha fet possible la
realització del treball de manera molt més senzilla.
A continuació, m’agradaria agrair la increïble oportunitat que em va oferir el programa

BATX2LAB impulsat per la Fundació Parc Científic de Barcelona, de realitzar el disseny
experimental als laboratoris de l’Institut de Biologia Molecular de Barcelona. En
especial, m’agradaria fer menció a l’investigador xxxxxx xxxxxxx xxxxxxx i agrair-li tota
l’orientació i ajuda que em va proporcionar a l'hora de guiar-me en l’elaboració de la part
pràctica i per donar-me l’oportunitat d’entrevistar-lo.
Finalment i no pas menys important, voldria donar les gràcies a la meva família i als
meus amics i en especial als meus pares, pel suport i l’ajuda oferts durant l’elaboració del
treball.
1
RESUMEN
El desarrollo de la ingeniería genética está generando un conocimiento cada vez más
amplio del funcionamiento de los seres vivos. Estas nuevas tecnologías están
construidas sobre conocimientos biológicos y agrupadas bajo el nombre genérico de
biotecnología.
El presente trabajo se desarrolla en dos partes, una de base teórica y una de práctica. La
primera pretende profundizar en los conceptos, las herramientas y las técnicas de la
ingeniería genética más recurrentes así cómo describir la relación entre los Organismos
Genéticamente Modificados y la investigación de enfermedades raras.
El bloque práctico está principalmente centrado en la obtención de un Organismo

Genéticamente Modificado a partir de la ejecución de diferentes técnicas de la
ingeniería genética. Así pues, el diseño experimental se basa en modificar
genéticamente una célula procariota, Escherichia coli, con el gen ATAD3A, que dará
lugar a la producción de una proteína recombinante para llevar a cabo una investigación
más eficiente de la enfermedad rara, el síndrome de Harel-Yoon.
Palabras clave: Biotecnología, ingeniería genética, OGM, enzimas de restricción, ADN

ligasa, plásmido, Colony PCR, ADN recombinante, ATAD3A, Harel-Yoon.
2
ABSTRACT
The development of genetic engineering is generating a wider knowledge of the
functioning of living beings. These new technologies are built on biological insights and
grouped under the generic name of biotechnology.
The present work is developed in two parts, one of theoretical base and one of practice.
The first aims to deepen into the concepts, the tools and the most recurrent genetic
engineering techniques as well as how to describe the relationship between Genetically
Modified Organisms and rare disease research.
The practical block is mainly focused on obtaining a Genetically Modified Organism

from the execution of different techniques of genetic engineering. This is why the
experimental design is based on genetically modifying a prokaryotic cell, Escherichia
coli, with the ATAD3A gene which will lead to the production of a recombinant protein
to carry out a more efficient investigation of the rare disease, Harel-Yoon syndrome.
Keywords: Biotechnology, genetic engineering, GMO, restriction enzymes, DNA ligase,

plasmid, Colony PCR, recombinant DNA, ATAD3A, Harel-Yoon.
3
ÍNDEX:
INTRODUCCIÓ……………………………………………………………………….……………………………………. 6
BLOC TEÒRIC
1. INTRODUCCIÓ A LA BIOTECNOLOGIA……………………………………………………………... 8
1.1. Definició del concepte………………………………………………………………………………….. 8
1.2. Breu perspectiva històrica..………………………………………………………………………….. 9
2. L’ENGINYERIA GENÈTICA………………………………………………………………………………… 10
2.1. Definició del concepte………………………………………………………………………………… 10
2.2. Principals eines i tècniques de l’enginyeria genètica………………………………….. 10
2.2.1. Eines……………………………………………………………………………………………... 10
2.2.2. Tècniques……………………………………………………………………………………… 17
3. ELS ORGANISMES GENÈTICAMENT MODIFICATS (OGM)………………………………. 21
3.1. Definició del concepte…………………….…………………………………………………………. 22
3.2. Processos bàsics per construir un OGM……………………………………………………. 22
3.3. Modificacions genètiques………………………………………………………………………….. 23
3.3.1. Obtenció de cèl·lules i organismes pluricel·lulars.………………………… 23
3.4. Objectius de generar organismes transgènics…………………………………………… 30
3.5. Les malalties rares i el paper dels OGM en la seva investigació…………………. 30
4. LA SÍNDROME D’HAREL-YOON I GEN ATAD3A……………………………………………….. 33
4.1. Definició de la Síndrome d’Harel-Yoon………………………………………………………. 33
4.2. Gen ATAD3A……………………………………………………………………………………………… 33
BLOC PRÀCTIC
5. INTRODUCCIÓ AL DISSENY EXPERIMENTAL…………………………………………………. 35
5.1. Procediment general i objectius…………………………………………………………………. 35
6. ESTRIS I APARELLS EMPRATS…………………………………………………………………………. 38
7. MATERIAL I MÈTODES……………………………………………………………………………………. 46
7.1. Reacció en cadena de la polimerasa (PCR)………………………………………………….. 46
7.2. Electroforesi en gel d’agarosa de la PCR…………………………………………………….. 50
7.3. Purificació d’ADN des de la solució (PCR clean-up)…………………………………….. 61
7.4. Doble digestió enzimàtica plasmidi……………………………………………………………. 65
7.5. Electroforesi en gel d’agarosa del plasmidi………………………………………………… 66
7.6. Doble digestió enzimàtica dels productes de la PCR………………………………….. 67
4
7.7. Purificació del plasmidi i productes de la PCR (“DNA extraction from agarose
gels”)……………………………………………………………………………………………………………………………. 71
7.8. Procés de lligació……………………………………………………………………………………….. 77
7.9. Transformació a E.Coli per xoc tèrmic……………………………………………………….. 78
7.10. Colony PCR……………………………………………………………………………………………….. 81
7.11. Electroforesi en gel d’agarosa de la Colony PCR…………………………………………. 84
8. ENTREVISTA RAMIRO ILLANES VICIOSO………………………………………………………... 85
9. CONCLUSIONS………………………………………………………………………………………………… 87
10. BIBLIOGRAFIA I WEBGRAFIA…………………………………………………………………………… 89
11. ANNEXOS………………………………………………………………………………………………………… 95
11.1. ANNEX 1: conceptes bàsics relatius a nivell de laboratori…………………………. 95
11.2. ANNEX 2: entrevista a Ramiro Illanes Vicioso, estudiant de doctorat en
biologia estructural…………………………………………………………………………………………………….. 96
11.3. ANNEX 3: Pòster Científic……………………………………………………………………….. 100
5
INTRODUCCIÓ
Des de ben petita m’ha fascinat el món de la ciència, en concret el de les Ciències de la
Salut. A secundària, quan vaig saber de l’existència del Treball de Recerca a batxillerat
vaig tenir clar que el volia orientar cap a la investigació. Ja en aquell moment
m’imaginava en un laboratori desenvolupant una part pràctica acompanyada de personal
d’investigació, sabia que seria una bona oportunitat per créixer, aprendre i adquirir més
eines per orientar el meu futur acadèmic.
Anys més tard he tingut l’oportunitat de participar en el programa BATX2LAB, impulsat

per la Fundació Parc Científic de Barcelona, amb el que he pogut desenvolupar la part
pràctica d’aquest treball com jo desitjava, en un laboratori d’investigació. De totes les
oportunitats de recerca que s’oferien vaig decidir decantar-me per l’enginyeria genètica,
un món completament nou per mi i del que em despertava molta curiositat el fet de
conèixer el funcionament dels Organismes Genèticament Modificats.
Encara que els Organismes Genèticament Modificats sempre han estat envoltats d’una
gran polèmica a nivell social, actualment utilitzem de forma rutinària diverses dotzenes
de fàrmacs produïts per Organismes Genèticament Modificats, com són la insulina per
al tractament de la diabetis o l’interferó per a la leucèmia. Les vacunes, com la que ens
protegeix del virus de l’hepatitis B també són fruit de l’enginyeria genètica.
Amb l’elaboració d’aquest treball s’hi marquen els següents objectius:
● Ampliar els meus coneixements sobre l’enginyeria genètica i els Organismes

Genèticament Modificats (que des d’ara anomenarem OGM, l’acrònim
d’Organisme Genèticament Modificat).
● Comprendre la relació que hi ha entre l’enginyeria genètica i la investigació de

determinades malalties rares.
● Investigar els beneficis i millores que els OGM poden aportar a la investigació de
determinades malalties rares.
6
● Treballar amb diferents tècniques de l’enginyeria genètica per obtenir un OGM.
● Utilitzar el mètode científic per a la redacció del disseny experimental.
Pel que fa a l’estructura, consta de dos grans blocs: un de teòric i un de pràctic.
La funció principal del primer bloc és aprofundir en conceptes vinculats a la

biotecnologia, a l’enginyeria genètica i als OGM per comprendre així la seva relació amb
la investigació i la cura de determinades malalties. També, s’examina la informació
d’articles científics i notícies relacionades amb les malalties rares i els OGM per fer una
petita diagnosi de l’estat actual en les investigacions.
D’altra banda, el segon bloc, de caire pràctic, pretén centrar-se en:
● L’obtenció d’un OGM a nivell de laboratori.

● Entrevistar a un expert investigador en la matèria: Ramiro Illanes Vicioso.
● Realitzar un Pòster Científic.
Per a la realització del treball s’ha fet ús d’articles científics, de llibres especialitzats en
la matèria d’estudi, d’internet com a eina de recerca d’informació, de programaris com el
Canva i el Paint per a l’elaboració del dibuix de la portada i del Gimp i Inkscape per a la
realització del pòster científic.
7
BLOC TEÒRIC
1. INTRODUCCIÓ A LA BIOTECNOLOGIA
1.1. Definició del concepte
Segons David Bueno i Torrens, doctor en biologia i investigador en la secció de genètica
biomèdica, la paraula biotecnologia es pot definir de diverses maneres, segons si la
considerem d’una forma àmplia o més restrictiva. En sentit ampli, el terme
biotecnologia es defineix senzillament com la utilització d’éssers vius per a obtenir
productes. Aquesta paraula la va introduir l’enginyer hongarès Karl Ereky a l’any 1917, per
descriure el procés integrat de producció de porcs a gran escala utilitzant com a aliment
arrels de bleda.
Generalment, la paraula biotecnologia s’utilitza de forma més restrictiva. En aquest

sentit, la biotecnologia es defineix com l’aplicació industrial d’organismes vius o de parts
d’organismes, i/o la utilització de tècniques biològiques per desenvolupar nous
productes, incloent-hi productes alimentaris, farmacològics i industrials.
Aquest treball es focalitza en la “Biotecnologia Vermella”, també anomenada

“Biotecnologia associada a la matèria de salut”. Aquesta s’aplica a la medicina i a la
farmacologia, àmbits on es produeixen substàncies terapèutiques (antibiòtics, insulina
humana, vacunes, etc.) a partir d’OGM.
Cal afegir que a més de l’àrea de la salut, les àrees d’aplicació de la biotecnologia són
molt diverses, des de la producció agroalimentària, fins a la industrial passant pel camp
de l’energia i el medi ambient entre d’altres. Seguidament se n’esmenten algunes:
○ Producció agroalimentària: Per a desenvolupar cultius i millorar collites i

aliments, a més d’aconseguir resistència a plagues i malalties.
○ Producció industrial: S'aplica a sectors com la cosmètica, l'alimentació, els

combustibles i les substàncies químiques. Ajuda a obtenir additius, saboritzants,
colorants i detergents entre d’altres.
8
1.2. Breu perspectiva històrica

Fa molt temps que els humans fem servir la biotecnologia. A tall d’exemple, sempre s’han
utilitzat éssers vius capaços de fermentar per a obtenir productes d’interès com el pa, el
formatge, la cervesa i un llarg etcètera. Els individus que s’empren per a aquests
processos fermentatius han sigut triats mitjançant tècniques de selecció artificial.
Un cop és descoberta l’estructura i el funcionament de l’ADN (Àcid Desoxiribonucleic),

neix el que anomenem biotecnologia moderna. Aquesta consisteix en la utilització de
tècniques de manipulació d’ADN (d’enginyeria genètica) per a l’obtenció d’individus que
donin lloc a productes d’interès, a la millora de la producció o altres serveis.
Avui dia la biotecnologia ens aporta innumerables beneficis, ja que cada procés juga un
paper important en la nostra vida quotidiana. Sense anar més lluny ha permès
incrementar:
● El balanç nutricional de certs aliments que consumim habitualment, fet que ha

revertit en una millora de la salut.
● La capacitat productiva de les terres.
● El descobriment de nous medicaments per al tractament de diverses malalties i

patologies.
● El desenvolupament de la bioremediació per al tractament de terres

contaminades.
● El desenvolupament de les biorefineries com un mitjà per crear nous tipus de

productes renovables.
● El desenvolupament de pràctiques per al reciclatge de residus.
9
2. L’ENGINYERIA GENÈTICA
2.1 Definició del concepte
A diferència de la biotecnologia que és l’aplicació de les ciències i de les tecnologies als
organismes vius i als seus components cel·lulars o moleculars, amb la finalitat de
conèixer-los més i de produir béns i serveis; l’enginyeria genètica és un conjunt de
tècniques i processos que permeten modificar els gens i la composició genètica dels
éssers vius.
Segons David Bueno, de moment podem avançar que noves combinacions de material
hereditari poden ser introduïdes en organismes capaços de propagar-les
continuadament i/o de fer-les funcionar, amb la qual cosa se n’alteren les
característiques biològiques. Són els Organismes Genèticament Modificats (OGM).
2.2. Principals eines i tècniques de l’enginyeria genètica
2.2.1. Eines
D’entre les eines per a poder manipular l’ADN i obtenir OGM hi trobem els enzims de
restricció, l’ADN lligasa i els vectors, que es defineixen en aquest apartat.
a) Enzims de restricció
Són enzims d’origen bacterià, descoberts a principis dels anys setanta, que reconeixen i
tallen regions específiques d’ADN deixant extrems cohesius i generant així seqüències
d’ADN anomenades “fragments de restricció”. En enginyeria genètica, aquests
fragments s’uneixen posteriorment a fragments d’orígens diferents, per així poder-se
formar un nou ADN, anomenat recombinant.
El descobriment dels enzims de restricció va facilitar l’estudi de l’ADN, ja que gràcies a

ells va ser possible seccionar molècules grans d’aquest àcid nucleic i separar-les en
fragments. Cadascun d’aquells fragments s'analitzava per separat i va ser possible
multiplicar-los a través de la tècnica de reacció en cadena de la polimerasa (PCR,
polymerase chain reaction), i fins i tot determinar la seqüència dels seus nucleòtids per
seqüenciació.
10
Tot i que hi ha centenars d’enzims de restricció diferents, tots funcionen essencialment

de la mateixa manera. Es classifiquen en funció de la seva seqüència de reconeixement,
com l’escindeixen, la seva composició i els requisits de substàncies (necessitats i tipus
de cofactors).
D’entre els enzims de restricció que segmenten els àcids nucleics es troben:
NOM: FUNCIÓ ESPECÍFICA:
Tallar els enllaços fosfodièster que

NUCLEASES: uneixen als nucleòtids en una cadena
d’àcids nucleics.
Tallar l’enllaç fosfodièster en nucleòtids

ENDONUCLEASES: localitzats a l’interior de la cadena de
l’àcid nucleic.
EXONUCLEASES: Tallar els enllaços dels nucleòtids que

estan als extrems.
Taula 1: Tipus d’enzims de restricció; Font: Elaboració pròpia
Els enzims de restricció es classifiquen en 4 grans categories:
● Enzims de tipus I: tallen l’ADN en llocs distants de la seqüència de

reconeixement.
● Enzims de tipus II: tallen l’ADN dins o prop de la seqüència de reconeixement.
● Enzims de tipus III: tallen l’ADN prop de les seqüències de reconeixement.
● Enzims de tipus IV: escinda l’ADN metilat. Aquestes no es consideren

pròpiament dins dels sistemes de restricció-modificació pel fet que no
reconeixen i tallen les seves seqüències específiques només quan es troben
metilades.
11
ENDONUCLEASES DE RESTRICCIÓ MÉS COMUNES
Enzim: Microorganisme del qual Seqüència de

s’ha aïllat: reconeixement:
EcoRI Escherichia coli. 5’ -GAATTC-3’

3’ -CTTAAG-5’
HindIII Haemophilus aegyptius. 5’ -AAGCTT-3’

3’ -TTCGAA-5’
BamHI Bacillus amyloliquefaciens. 5’ -GGATCC-3’

3’ -CCTAGG-5’
SmaI Serratia marcercens. 5’ -CCCGGG-3’

3’ -GGGCCC-5’
Taula 2: Endonucleases de restricció més comunes. Font: elaboració pròpia amb la informació
del llibre de text B2 Biologia Batxillerat Aula 3D.
Figura 1: EcoRI catalitza el tall d’un lloc de reconeixement palindròmic. El tall genera dos
fragments amb extrems 5’ cohesius. Font:
http://olimpiadadebiologia.cat/wp-content/uploads/2020/04/Genetica-Enzims-de-restricc
io-2014.pdf
Els talls que realitzen els enzims de restricció poden generar 2 tipus d’extrems: els
cohesius i els roms.
● Els extrems cohesius es generen perquè l’enzim talla en una cadena de l’ADN en
una posició i en l’altra en una posició diferent a una distància aproximada de 3 a 5
nucleòtids presentant un eix de simetria irregular. Els extrems generats són
12
monocatenaris, això facilita la seva interacció amb un altre extrem monocatenari

que sigui complementari a la seva seqüència.
Figura 2: Extrems cohesius produïts per enzims de restricció; Font: GoldBio

https://goldbio.com/articles/article/solucionar-problemas-clonacion-basada-enzimas-restri
ccion
● Els extrems roms es generen quan el tall de l’enzim es produeix de forma

simètrica a les dues cadenes.
13
Figura 3: Extrems roms produïts per enzims de restricció; Font: GoldBio

https://goldbio.com/articles/article/solucionar-problemas-clonacion-basada-enzimas-restri
ccion
b) ADN lligasa
Permet unir fragments d’ADN que han estat tallats per enzims de restricció. Bàsicament,
actua com una agulla de cosir i crea enllaços covalents per al tancament de les cadenes
de sucre-fosfat donant així, un ADN recombinant.
Mitjançant l'ús d'ATP com a font d'energia, la lligasa catalitza una reacció en què el grup
fosfat de l'extrem 5' d'una cadena d'ADN s'uneix al grup hidroxil de l'extrem 3' de l'altra
cadena. Aquesta reacció produeix un esquelet de sucre-fosfat intacte.
c) Vectors
D’acord amb els autors que han escrit “Biología Molecular, Fundamentos y aplicaciones
en las ciencias de la salud”, un vector es defineix com una molècula d’ADN de doble
cadena (dsDNA), amb capacitat d’albergar un fragment d’ADN exogen. Poden tenir a més
el doble objectiu de permetre la transmissió del gen d’interès d’un organisme a un altre.
14
D’acord amb el seu ús, els vectors es poden classificar en vectors de clonació i
d’expressió. Tot seguit ambdós es defineixen:
● Vectors de clonació: tenen com a finalitat l'emmagatzematge de seqüències i

l’obtenció de grans quantitats de l’ADN inserit o de la molècula recombinant.
Poden ser: plasmidis, bacteriòfags, fagemits, còsmids (barreja artificial del
plasmidi i bacteriòfag) i cromosomes artificials bacterians o de llevat.
Figura 4: Components del vector de clonació; Font:

https://bioquimicaexperimental.files.wordpress.com/2017/01/aislamiento-de-plc3a1smido.pd
f
● Vectors d’expressió: s’utilitzen per a produir una proteïna recombinant i

compten, a més dels elements esmentats del vector de clonació, un promotor i
un lloc IRES (lloc d’entrada interna al ribosoma), així com una seqüència de
poliadenilació. Poden ser: plasmidis o bacteriòfags.
15
Figura 5: Components del vector d’expressió; Font:

https://bioquimicaexperimental.files.wordpress.com/2017/01/aislamiento-
de-plc3a1smido.pdf
Donat que a la part pràctica del present treball s’hi utilitzen els plasmidis com a vectors
es veu necessària la seva definició. Un plasmidi bacterià és un petit ADN circular de
doble hèlix del qual hi pot haver uns quants exemplars (de 20 a 50) en un mateix bacteri.
De forma natural els bacteris poden transferir aquest material genètic a d’altres
mitjançant els mecanismes de parasexualitat. A l’enginyeria genètica els plasmidis es
poden inserir a cèl·lules (bacterianes o no) a partir de tècniques que incrementen la
permeabilitat de les membranes com l’addició de sals (clorur càlcic) o el xoc tèrmic.
Els bacteris o organismes receptors adquireixen les propietats dels gens que hi ha al
plasmidi bé sigui adquirit de forma natural (mecanismes de parasexualitat) o amb
tècniques artificialitzades d’enginyeria genètica.
16
Figura 6: Parasexualitat en bacteris: la transformació; Font: adn-dna

https://adn-dna.blogspot.com/2010/12/107-parasexualitat-en-bacteris-la.html
2.2.2. Tècniques
La meva intenció no és descriure amb detall totes les tècniques que s’utilitzen a
l’enginyeria genètica, ja que en són moltes i algunes certament complexes. En aquest
treball es pretén desenvolupar únicament les tècniques que es realitzen en el disseny
experimental del bloc pràctic:
● La reacció en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction).

● La tecnologia de l’ADN recombinant (S’inclou la lligació i la digestió enzimàtica).
● Transformació cel·lular.
● Clonació molecular.
● PCR d’una sola colònia (Colony PCR).
a) Reacció en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction)

És una tècnica de la biologia molecular que permet una ràpida replicació de l’ADN.
Mitjançant la PCR, una petita quantitat de material genètic pot ser amplificada milions
de vegades en poques hores, el que permet la detecció ràpida i fiable dels marcadors
genètics de malalties infeccioses, càncer i desordres genètics.
La idea bàsica de la tècnica és copiar un fragment d’ADN fent ús d’una polimerasa que
pot treballar a temperatures extremadament elevades, ja que prové del bacteri Thermus
aquaticus que viu a altes temperatures (79ºC a 85ºC), és més coneguda pel seu nom
17
comercial: taq polimerasa. L’elevada temperatura provoca la desnaturalització i

conseqüent separació dels filaments del DNA, fet que permet utilitzar-los com a motlle
per a la síntesi de noves còpies (replicació semiconservativa).
Per començar la síntesi, l’enzim necessita un encebador, és a dir, una petita quantitat de
nucleòtids que són complementaris als nucleòtids que formen els extrems de les
cadenes de la molècula que es vol amplificar.
Figura 7: Reacció en cadena de la polimerasa (PCR); Font:

https://www.youtube.com/watch?v=sveDsunhq6k
b) La tecnologia de l’ADN recombinant

Anomenem ADN recombinant als fragments d’ADN construïts artificialment que
contenen seqüències d’organismes diferents.
Aquesta tecnologia ens permet entre d’altres generar vectors recombinants, és a dir,
inserir el gen concret que ens interessa (transgèn) a l’interior d’un vector com pot ser un
plasmidi.
En molts OGM els plasmidis recombinants, com ja s’ha comentat, s’utilitzen com a eina
de transmissió i d’expressió genètica. A causa de la seva importància i al seu ús a la part
18
pràctica d’aquest treball es troba necessari exposar els passos d’obtenció d’un plasmidi
recombinant:
1) Les endonucleases reconeixen la seqüència diana en el plasmidi vector i a

l’inserit.
2) Digestió enzimàtica: es produeix el tall en el plasmidi i a l’inserit, el que causa

extrems cohesius complementaris entre si.
3) Lligació: l’inserit s’uneix al vector per complementarietat de bases, però per tal
de segellar aquesta unió i obtenir un ADN recombinant es fa servir un altre enzim
anomenat lligasa.
Figura 8: Producció d’un ADN recombinant; Font: Khan Academy

https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regul
ation/biotechnology/a/overview-dna-cloning
19
c) Transformació cel·lular
La transformació cel·lular és la introducció de l’ADN recombinant a l’interior de la
cèl·lula hoste (la receptora).
En tenim dos tipus:

● Natural: inclou les cèl·lules capaces d’introduir ADN exogen com demostra
Griffith en el seu experiment.
● Induïda: inclou la desestabilització de l’envoltant cel·lular i la formació de

protoplasts per xoc tèrmic, per electroporació, etc.
En la induïda la transformació per xoc tèrmic és la més recurrent. En aquest procés

s’utilitzen cèl·lules competents, les quals ajuden a fer que el gen d’interès pugui
ingressar a la cèl·lula hoste i així, completar-se el procés de transformació.
d) Clonació molecular
Aquesta tècnica es realitza després de la transformació cel·lular. Bàsicament, es clona (es
replica) la cèl·lula hoste per tal d’aprofitar la maquinària molecular de la cèl·lula.
Cal afegir que aquesta clonació pot permetre l’expressió de proteïnes d’interès en grans
quantitats, aquestes reben el nom de proteïnes recombinants perquè s’expressen en un
organisme del qual no li’n són pròpies. Són aquestes proteïnes les interessants a escala
de laboratori per fites com la investigació de malalties rares.
Per iniciar la clonació és necessari calcular la quantitat apropiada d’ADN inserit:
(ng vector) x (mida en kb de l’inserit) / (mida en kb del vector) = relació molar de

l’inserit i vector.
e) PCR d’una sola colònia (Colony PCR)

La Colony PCR s’utilitza per a examinar l’ADN de les colònies produïdes al laboratori (en
cas que l’OGM sigui un bacteri com en el cas que ens ocupa) i confirmar si les cèl·lules
20
bacterianes en les seves plaques s’han transformat amb el plasmidi portador del gen o
no. L’ADN motlle són les pròpies colònies que apareixen a la placa de petri.
En aquesta tècnica s’empren les pròpies cèl·lules, aquestes es col·loquen en la reacció de

PCR que al pas de 95ºC es destrueixen i alliberen tot el contingut cel·lular, entre ells
l’ADN. Els oligonucleòtids que s’hi afegeixen, en el suposat cas que hagi funcionat bé la
lligació, s’uneixen al gen d’interès i l’amplifiquen en trobar-se inserit al plasmidi.
Per saber quins bacteris, llevats o cèl·lules en cultiu han incorporat el gen d’interès,
aquest s’acompanya d’un altre gen que ens permet reconèixer i seleccionar les cèl·lules
en qüestió.
Aquesta tècnica s’aplica, com s’ha indicat, després de fer créixer colònies bacterianes en
medis nutritius com plaques de petri. Cal destacar que en el medi de cultiu també hi
afegim antibiòtic (Kanamicina) com a marcador pel qual només sobreviuen aquelles
cèl·lules que han incorporat el gen de resistència a l’antibiòtic (marcador).
La presència de colònies ens indica que el plasmidi s’insereix a la cèl·lula tancat, però
això no implica que estigui el gen, ja que la lligasa pot haver forçat la formació de l’enllaç
fosfodièster. En canvi, si no hi ha presència de colònies, podem concloure que el
plasmidi s'insereix a la cèl·lula obert.
3. ELS ORGANISMES GENÈTICAMENT MODIFICATS

(OGM)1
La utilització d’OGM no és pas una novetat del segle XXI. Ja des de 1982 molts diabètics
reben diàriament insulina humana, idèntica a la que faria el pàncrees, però que és
produïda en bacteris, concretament en unes soques específiques genèticament
modificades des de l’espècie Escherichia coli, uns bacteris intestinals.
1
La informació de l’apartat “ELS ORGANISMES GENÈTICAMENT MODIFICATS (OGM)” ha estat
extreta únicament i exclusivament del llibre Convivint amb transgènics de l’autor: David Bueno i
Torrens.
21
3.1. Definició del concepte

Arribats a aquest punt, un cop s’han definit les principals tècniques i eines de
l’enginyeria genètica que ens permeten obtenir OGM, ens centrem en aquests. Els OGM,
més coneguts popularment com a transgènics, són organismes als quals s’ha modificat
el seu contingut genètic mitjançant tècniques d’enginyeria genètica, ja sigui introduint
un gen forà (o més d’un) o bé suprimint o modificant la funcionalitat d’un gen propi, la
qual cosa altera alguna de les seves característiques biològiques.
3.2. Processos bàsics per construir un OGM

Per tal d’obtenir un OGM cal seguir uns determinats passos que s’exposen tot seguit:
1) Identificar el gen d’interès i la seqüència reguladora que en controli l’expressió de

forma precisa i acurada.
2) Tallar el gen i la seqüència reguladora mitjançant enzims de restricció i unir el

gen i la seqüència reguladora; generant així un ADN recombinant.
3) Obtenir un nombre suficient de còpies d’ADN recombinant per poder-les

manipular amb comoditat. Tenir en compte que una sola còpia d’un gen qualsevol
pesa menys de 10-19 grams.
A partir d’aquest moment, les tècniques que s’utilitzen depenen del tipus
d’organisme que s’ha de modificar (un microorganisme, una planta o un animal),
ateses les diferències morfològiques i fisiològiques d’aquests organismes.
4) Introduir l’ADN recombinant a la cèl·lula hoste, que esdevindrà directament un

OGM si es tracta d’un organisme unicel·lular (bacteris, llevats o cèl·lules de
mamífer en cultiu), o serà un pas intermedi en la construcció de l’OGM si prové
d’un organisme pluricel·lular, com un animal o una planta.
5) Finalment, comprovar que la cèl·lula hoste compta amb la característica desitjada

i obtenir un nombre significatiu d’OGM idèntic a partir de l’inicial, ja sigui
22
estimulant la seva reproducció si són unicel·lulars, ja sigui mitjançant

aparellaments selectius si són pluricel·lulars.
3.3. Modificacions genètiques

Els primers organismes als quals es va manipular el material genètic van ser bacteris, ja
que tenen una major simplicitat estructural, molecular i genètica la qual cosa facilita
molt la introducció, la recuperació i la manipulació dels gens.
Tots els éssers vius de l’escala evolutiva es poden modificar genèticament, des dels
bacteris als mamífers, passant pels fongs, els virus, els insectes, els peixos, les plantes,
etc. N’hi ha, però, que són més fàcils de manipular que d’altres.
En el punt anterior s’ha exposat de manera genèrica l’obtenció d’OGM, però com s’ha
esmentat hi ha algunes diferències en el procediment en funció del tipus d’organisme a
modificar. Pel fet que a la part pràctica s’utilitza com a cèl·lula hoste un bacteri, és a dir
un microorganisme, es parla de manera més detallada
l’obtenció de microorganismes genèticament modificats i a
continuació, es fa una pinzellada de l’obtenció de plantes i
animals genèticament modificats.
3.3.1. Obtenció de cèl·lules i organismes

pluricel·lulars
a) Obtenció de bacteris genèticament

modificats2
Els bacteris són els organismes que es cultiven de
manera més fàcil i econòmica en comparació
d’altres, per la qual cosa són els més emprats en
enginyeria genètica. Malauradament, atesa la seva
simplicitat funcional, no poden fer determinats
processos bioquímics de modificació de les
2
Figura 9: Introducció dels plasmidis dins dels bacteris; Font: “Convivint amb transgènics” D. Bueno
23
proteïnes, els quals poden ser necessaris per obtenir productes funcionals.
La idea bàsica és:

○ Construir l’ADN recombinant que ens interessa.
○ Incorporar l’ADN a un plasmidi i que aquest entri dins del bacteri.
En aquest cas concret, no cal ni tan sols que l’ADN recombinant s’incorpori al genoma
bacterià. Funcionarà exactament igual, i fins i tot millor, dins un plasmidi
extracromosòmic, atès que el genoma bacterià és molt compacte (té poques seqüències
no codificants) i la introducció d’un gen nou el podria desestabilitzar.
Per incorporar el plasmidi dins del bacteri hi ha diverses tècniques. La més senzilla
implica tractar als bacteris amb unes concentracions concretes de sals, barrejar-los amb
els plasmidis i sotmetre’ls a un xoc tèrmic, un canvi brusc de temperatura entre els 4ºC i
els 37ºC o 42ºC. La presència de sals i el xoc tèrmic estoven les parets protectores del
bacteri i faciliten el pas de l’ADN sense que aquest es trenqui i mori.
b) Obtenció de llevats genèticament modificats

El procediment per introduir l’ADN recombinant a les cèl·lules del llevat és molt
semblant al descrit en bacteris. En el cas dels llevats, l’ADN recombinant pot anar
incorporat dins d’un plasmidi apte per llevats, o es pot integrar dins del genoma
del llevat.
24
Figura 10: Exemple d’integració del plasmidi bacterià al genoma d’un llevat. Font: “Convivint
amb transgènics” David Bueno i Torrens.
c) Obtenció de cèl·lules de mamífer en cultiu genèticament modificades

Les cèl·lules de mamífer mantingudes en cultiu continuen sent en molts casos les
més idònies per a la producció de proteïnes humanes biològicament actives, atès
que reprodueixen amb total fidelitat les modificacions necessàries per
aconseguir proteïnes funcionals.
Hi ha tres maneres bàsiques d’introduir el gen d’interès dins les cèl·lules de mamífer en
cultiu:
○ Per precipitació: posar l’ADN recombinant en el medi de cultiu i fer que precipiti
sobre les cèl·lules mitjançant l’addició de calci, el qual obre canals a la membrana,
fet que facilita l’entrada de l’ADN precipitat.
○ Per camp elèctric: posar els vectors dins del medi de cultiu i posar les cèl·lules a
l’interior d’un camp elèctric. En el moment que es produeix una descàrrega
elèctrica, l’ADN amb una lleugera càrrega negativa intrínseca, es mou ràpidament
25
cap al pol positiu i impacta sobre les cèl·lules que es troben a mig camí, fets que
s’obren alguns canals a la membrana cel·lular.
○ Per liposomes: s’engloba el vector dins de bombolles de lípids, i quan una

d’aquestes bombolles entra en contacte amb una membrana cel·lular els lípids es
fusionen, i l’ADN recombinant contingut dins els liposomes queda a l’interior de
la cèl·lula.
L’últim pas per a les tres maneres bàsiques d’introduir el gen d’interès és que l’ADN
s’integri al genoma.
Figura 11: Introducció d’ADN recombinant en cèl·lules en cultiu; Font: “Convivint amb
transgènics” David Bueno i Torrens.
26
d) Obtenció de plantes genèticament modificades

Hi ha dues maneres bàsiques d’obtenir plantes transgèniques en funció de com
s'introdueix el transgèn dins les cèl·lules parenquimàtiques.
● Amb una pistola gènica: la pistola gènica dispara un gran nombre d‘aquestes
microesferes metàl·liques sobre una quantitat elevada de cèl·lules
parenquimàtiques en cultiu, de manera que moltes d’aquestes cèl·lules reben un
impacte. Llavors les microesferes penetren dins les cèl·lules, es desprenen els
transgens i aquests s’incorporen al genoma de la planta.
Posteriorment, cal seleccionar les cèl·lules que han incorporat el transgèn.
● Amb bacteris naturals del sòl: es modifica el plasmidi Ti d’Agrobacterium

tumefaciens per tal que no produeixi el gall (tumors vegetals) però que, en canvi,
pugui hostatjar l’ADN recombinant. Posem el gen d’interès en el plasmidi Ti,
introduïm el plasmidi dins del bacteri i ho afegim en el medi de cultiu on tenim
les cèl·lules parenquimàtiques de la planta, i la resta funciona sola. El bacteri
infecta les cèl·lules introduint-los el plasmidi Ti i aquest fa que l’ADN
recombinant quedi incorporat al genoma de la cèl·lula.
La resta del procediment és anàleg a l’explicat amb el mètode de la pistola gènica.
27
Figura 12: Diverses maneres d’obtenir plantes

transgèniques; Font: Llibre “Convivint amb transgènics”
David Bueno i Torrens.
e) Obtenció d’animals genèticament modificats

És la més complexa de totes a causa de la major complexitat estructural i
funcional d’aquests organismes.
S’utilitzen dues tècniques diferents:
● Just després de la fecundació: consisteix a microinjectar (injectar una solució
amb una microxeringa controlada per un micromanipulador) l’ADN recombinant

en un oòcit acabat de fecundar. Per introduir l’ADN recombinant es realitza una
fecundació in vitro i, abans que s’ajuntin els dos pronuclis, es microinjecta el gen
d’interès dins d’un d’ells. Quan es fusionen en moltes ocasions el DNA
recombinant queda incorporat al genoma, fet que produeix un zigot transgènic.
Es deixa que aquest es desenvolupi en el laboratori durant un parell de dies, i
28
s’implanta a l’úter d’una mare substituta (adoptiva), dins de la qual es

desenvoluparà. Quan neixi, serà directament un animal transgènic.
● En cèl·lules mares embrionàries: s’obtenen cèl·lules mare d’embrions de l’espècie

que es vol modificar i se’ls microinjecta el gen d’interès. Després de mantenir-les
en cultiu per comprovar que efectivament l’han incorporat al seu genoma, es
transplanten a un embrió que estigui en el mateix estadi de desenvolupament
que l’embrió originari, és a dir, que també estigui format per cèl·lules mare
embrionàries. Les cèl·lules mare embrionàries modificades es barregen
espontàniament dins l’embrió, i totes contribueixen a formar les cèl·lules i els
teixits de l’adult. Quan neix l’animal, aquest no és completament transgènic, sinó
que és una barreja de cèl·lules modificades i de cèl·lules no modificades. Llavors
mitjançant aparellaments successius, s’obté una soca transgènica d’aquests
animals.
Figura 13: Diverses maneres d’obtenir animals transgènics; Font: Llibre “Convivint amb
transgènics”, David Bueno i Torrens.
29
3.4. Objectius de generar organismes transgènics

Actualment, es generen organismes transgènics per a múltiples finalitats, entre les quals
les més destacades són:
● Aprofundir en el coneixement de la tecnologia de les modificacions genètiques.
● Desxifrar les instruccions del genoma, el conjunt de gens de cada organisme.
● Estudiar el control genètic dels sistemes fisiològics.
● Construir models d’animals de malalties genètiques que afecten les persones per
tal d’estudiar-ne l’origen i desenvolupament i poder assajar noves teràpies i
fàrmacs.
● Millorar, des del punt de vista de productivitat humana, la producció industrial,

agrícola i ramadera.
● Produir nous productes d’origen animal, entre els quals nous fàrmacs per tractar
malalties humanes, o òrgans animals aptes per a trasplantaments a humans.
3.5. Les malalties rares i el paper dels OGM en la seva investigació

Seguidament, es mostren a tall d’exemple algunes investigacions i teràpies vinculades a
l’enginyeria genètica i a la salut per reforçar el paper cabdal que aquesta té sobre la
salut.
● El peix zebra (Danio rerio) modificat genèticament

El dia 10/05/2022 es pública a la revista Molecular Psychiatry, un article d’un nou estudi
de seqüenciació massiva sobre les bases genètiques de l’autisme en què s'identifica una
mutació en el gen YWHAZ en dos germans afectats i fan servir com a model el peix
zebra (Danio rerio), un bon model per estudiar alteracions de comportament
relacionades amb l’autisme o altres trastorns psiquiàtrics, ja que el comportament social
i la interacció amb el grup són claus en aquesta espècie. Disposen d’una línia
30
transgènica de peix zebra en què totes les neurones expressen un marcador que es
torna fluorescent només quan la neurona s’activa. D’aquesta manera, es pot detectar
quan s’activen cadascuna de les neurones de tot el cervell i comparar què succeeix en
els animals amb deficiències en el gen YWHAZ i en els que són grup control.
Ester Antón-Galindo, primera autora de l’article juntament amb Elisa Dalla Vecchia
(Universitat de Leicester), comenten que els estudis previs en models animals han
demostrat que l’activitat neuronal col·lectiva espontània és essencial durant el
desenvolupament, ja que està implicada en els processos de configuració de les futures
xarxes neuronals.
● Limfòcits modificades genèticament

És necessari aclarir que aquest punt s’inclou exclusivament com a exemple de
l’enginyeria genètica i salut perquè els limfòcits no són pròpiament organismes.
La teràpia amb limfòcits modificats genèticament mostra resultats prometedors en un

model de lupus eritematós en ratolí. El tractament dissenyat per eliminar els limfòcits B
i minimitzar l'acció del sistema immunitari contra l'organisme, pot ser la base per al
tractament de pacients amb la malaltia. L'estudi mostra que els limfòcits genèticament
modificats poden utilitzar-se no només al tractament del càncer, sinó també en altres
patologies. Els investigadors conclouen que la utilització de limfòcits T modificats per
reconèixer el receptor CD19 a la membrana de limfòcits B és una estratègia viable per al
tractament del lupus que hauria de ser avaluada en pacients.
● Ratolins modificats genèticament

Investigadors de la Universitat d'Oviedo i de l'Institut Salk de Califòrnia han publicat a la
revista Nature Medicine dos estudis independents que assagen en ratolins una teràpia
basada en l'edició gènica per al tractament de la síndrome d'envelliment accelerat
d’Hutchinson-Gilford. Encara que recentment s'han desenvolupat alguns tractaments
per a aquesta síndrome amb resultats positius, el nou tractament proposat es
consideraria el primer amb efectes permanents, en actuar directament sobre el gen
mutat.
31
● Pollastres transgènics
L’ús de pollastres transgènics ja havia estat aprovat a la Unió Europea, però el 8 de
desembre de 2015, la FDA (U.S. Food and Drug Administration) autoritza l'ús d'aquests
per combatre un exemple més de les malalties rares.
Les mutacions al gen LIPA o LAL provoquen un dèficit en la proteïna encarregada de
processar i emmagatzemar els àcids grassos, de manera que s’acumulen en el fetge,
l’intestí o altres òrgans. Per a combatre aquest greu trastorn, que pot incitar la mort dels
pacients infantils, científics dels Estats Units van desenvolupar pollastres transgènics
per donar lloc al fàrmac Kanuma. Gràcies a aquests éssers vius és possible obtenir la
sebalipassa alfa, un enzim d'origen humà recombinant que pot soliviantar la patologia.
D'aquesta manera, l'aprovació dels pollastres transgènics contra les malalties rares
donarà lloc per primera vegada amb un fàrmac per al tractament de la deficiència de la
lipasa àcida lisosòmica.
● Cabres transgèniques
El 6 de febrer del 2009, la FDA va aprovar una proteïna recombinant (ATryn,
antitrombina) produïda a la llet de cabres transgèniques. L'antitrombina recombinant
està indicada per prevenir l'aparició de possibles coàguls (trombes i embòlies) en
operacions quirúrgiques o parts de pacients afectats per la deficiència congènita en
antitrombina de tipus III (AT3D), malaltia relativament rara associada a mutacions al gen
SERPIC1 i que codifica per a un potent inhibidor de factors de coagulació sanguínia, com
la trombina. L'absència d'aquest inhibidor provoca la freqüent aparició de coàguls,
trombosi i embòlies als pacients afectats.
● Ratolins transgènics
Utilitzant ratolins modificats genèticament (transgènics) s'ha aconseguit reproduir i
estudiar amb detall la majoria d'alteracions pigmentàries i visuals associades a
l'albinisme.
Al laboratori del Centre Nacional de Biotecnologia (CNB), del Consell Superior
d'Investigacions Científiques (CSIC) a Madrid, que també forma part del Centre de
Recerca Biomèdica en Xarxa en Malalties Rares (CIBERER), de l'Institut de Salut Carles
III (ISCIII), s’han utilitzat ratolins transgènics amb el gen de la tirosinasa (en els quals
s’introdueix una còpia funcional del gen de la tirosinasa que causa l'albinisme OCA1 als
32
ratolins albins), han pogut demostrar que el dèficit de fotoreceptors bastons de les
seves retines es pot corregir en restaurar la pigmentació dels ratolins. A més, han pogut
demostrar que les connexions anòmales entre retina i el cervell es poden corregir en
recuperar la pigmentació en ratolins transgènics.
Efectivament, amb aquestes investigacions han aconseguit la “cura” de l'albinisme en
ratolins, el qual és el primer pas per poder, en un futur pròxim, traslladar aquests
avenços realitzats al laboratori amb models animals a persones amb albinisme.
4. LA SÍNDROME D’HAREL-YOON I GEN ATAD3A

Alguns OGM s’utilitzen per produir proteïnes d’interès (o proteïnes recombinades) les
quals serveixen per a l’estudi de determinades malalties rares, com és el cas de la
síndrome d’Harel-Yoon causada per una mutació heterozigota en el gen ATAD3A.
Concretament, la recerca s’enfoca en aquesta malaltia, ja que és la proteïna d’estudi en
la que se centra el personal d’investigació amb qui vaig fer l’estada i és el gen concret
amb el qual modifico E.Coli.
A continuació es parla de la síndrome d’Harel-Yoon, en ser una malaltia rara la qual

s’estan duent a terme investigacions actualment s’ha procurat fer una recerca
d’informació existent que ens pugui aportar almenys un coneixement bàsic d’aquesta.
4.1. Definició de la Síndrome d’Harel-Yoon

La síndrome d'Harel-Yoon (HAYOS) és un trastorn sindròmic del neurodesenvolupament
(desenvolupament neurològic) descrit recentment, caracteritzat per un retard del
desenvolupament psicomotor, discapacitat intel·lectual, hipotonia troncal, espasticitat i
neuropatia perifèrica i altres característiques més variables, com ara l’atròfia òptica. Els
estudis de laboratori en alguns pacients mostren proves de disfunció mitocondrial.
4.2. Gen ATAD3A

Els investigadors de la Facultat de Medicina Baylor (Houston, TX, EUA) han descobert
que el mal funcionament de les variants del gen ATAD3A, que codifica per a la proteïna
3A (ATAD3A), una proteïna de la membrana mitocondrial codificada al nucli, implicada
33
en la dinàmica mitocondrial, l’organització de nucleoides, la traducció de proteïnes, el

creixement cel·lular i el metabolisme del colesterol, causa un grup relacionat de
síndromes neurològiques, classificades com a trastorns d’origen desconegut.
Els estudis en humans només van revelar que les noves variants ATAD3A estaven
associades amb síndromes neurològiques, no que els caussessin. Per tant, els científics
van començar una col·laboració amb el coautor, Hugo Bellen, professor de l’Institut
Mèdic Howard Hughes a Baylor, per combinar els estudis en éssers humans amb estudis
a la mosca de la fruita Drosophila melanogaster com a model experimental amb l’objectiu
d’ajudar a determinar els efectes de les variants genètiques.
El primer autor Wan Hee Yoon, investigador postdoctoral al laboratori de Bellen, va

desenvolupar un model de malaltia ATAD3A a D. melanogaster. Com a resultat va trobar
que l’expressió de la proteïna variant va causar una disminució dramàtica en el nombre
de mitocondris, així com un augment en la mitofàgia.
El Dr. Yoon comenta que les dades col·lectives indiquen que les mutacions a ATAD3A
poden causar un fenotip aberrant als mitocondris i que les mosques estan realment
malaltes. La combinació dels resultats dels estudis humans i amb els de la mosca
augmenta la confiança que les síndromes neurològiques observades en els pacients de
l’estudi es poden atribuir almenys en part a les variants d’ATAD3A que no funcionen
correctament.
34
BLOC PRÀCTIC
5. INTRODUCCIÓ AL DISSENY EXPERIMENTAL
Per tal de poder assolir els objectius plantejats en aquesta recerca, la meva part pràctica
forma part d’una de les estades al Parc Científic de Barcelona. Concretament, es van
realitzar en un laboratori de Biologia Estructural, localitzat a l’Edifici Hèlix. Aquest
edifici es distribueix en 3 plantes diferents. La principal línia de recerca, la qual se
centren, és investigar la biologia estructural de proteïnes essencials per a la viabilitat
dels mitocondris i dels patògens. Aquesta pràctica ha sigut tutoritzada per xxxxxx
xxxxxxx xxxxxxx, estudiant de doctorat, que em va acompanyar en tot el procés i
execució del disseny experimental.
La realització del disseny experimental es va desenvolupar durant el mes d’agost cursant

una mitjana d'entre 6-7 hores diàries durant una setmana aproximadament.
L’objectiu de la part pràctica desenvolupada és generar un OGM al qual se li insereix el

gen ATAD3A, que codifica per la proteïna d’interès a investigar, i està vinculada a la
síndrome d’Harel-Yoon. Així doncs, es modifica genèticament el bacteri Escherichia Coli
(E.Coli) i es comprova, en la part final, que el gen d’interès s’ha inserit de manera
correcta.
Respecte a la línia d’investigació, l’objectiu és seleccionar la colònia d’E.Coli que genera

més quantitat de proteïna codificada pel gen d’interès per tal de fer-ne entre d’altres la
seva cristal·lització, saber-ne més sobre la proteïna en qüestió i avançar així en la
recerca. Per qüestió de límit de temps d’estada permesa i del llarg temps que suposa a
nivell de laboratori, no es va realitzar l’obtenció de proteïnes ni la seva purificació.
5.1. Procediment general i objectius

Abans de començar l’explicació de manera detallada dels procediments que he dut a
terme al laboratori veig necessària una petita explicació global d’aquests i dels seus
objectius:
35
1) Reacció en cadena de la polimerasa (PCR): aconseguir una gran quantitat de

còpies del gen d'interès (que es troba en un vector de propagació) a partir de
quantitats petites.
2) Electroforesi en gel d’agarosa de la PCR: separar molècules, entre les quals es

troben els àcids nucleics (ADN i ARN), segons la mobilitat d'aquestes en un camp
elèctric a través d'una matriu porosa, que finalment les separa per mides
moleculars i càrrega elèctrica.
Necessita un seguit de passos previs els quals s’anomenen a continuació.
1. Preparació Buffer TAE 5X.

2. Preparació del gel d’agarosa.
3. Carregar les mostres al gel d’agarosa.
4. Realitzar el desplaçament de la mostra al voltatge pertinent.
5. Tinció del gel d’agarosa, amb l’objectiu de visualitzar els fragments d'ADN i ARN i
determinar el contingut d'àcids nucleics d'una mostra, tenint una estimació de la
concentració i el grau d'enteresa.
6. Revelació del gel d’agarosa. Es fa ús d’un escàner de fluorescència.
3) Purificació d'ADN des de la solució (PCR clean-up): implica la separació de l'ADN

dels components de la reacció in vitro, o dels fragments de gel d'agarosa.
4) Doble digestió enzimàtica del plasmidi: els enzims de restricció tenen llocs de
reconeixement específic, els quals tallen el nostre vector d'expressió (plasmidi) i
es queda obert per tal que pugui unir-se el nostre gen d'interès (ATAD3A).
5) Electroforesi en gel d’agarosa del plasmidi: els passos previs són els mateixos a
la primera electroforesi realitzada, no es torna a preparar el Buffer TAE 5X
perquè tenim la quantitat suficient.
6) Doble digestió enzimàtica dels productes de la PCR: es talla el nostre gen

d’interès (ATAD3A) amb els mateixos enzims de restricció que han tallat el vector
d’expressió per tal de generar una complementarietat de bases.
36
7) Purificació del plasmidi i productes de la PCR: s’ha fet ús del protocol “DNA
extraction from agarose gels”. Com a resultat de la purificació obtindrem tant el
plasmidi com els productes de PCR digerits.
8) Procés de lligació: com el gen d’interès i el vector d’expressió han sigut tallats
amb els mateixos enzims de restricció, suposem que els extrems enganxosos són
cohesius i, per tant l’enzim que s’afegeix al tub de reacció anomenat T4 DNA
lligasa provoca el segellament de tots dos.
9) Transformació a E. Coli per xoc tèrmic: introduir l’ADN recombinant format a la

cèl·lula de E.Coli.
Es plaquegen en plaques de petri de medi LB amb l'antibiòtic kanamicina (es
troba el gen marcador).
10) Colony PCR: observar si el plasmidi s’ha inserit obert o tancat a la cèl·lula E.Coli.
11) Electroforesi en gel d’agarosa de la Colony PCR: de totes aquelles colònies que
han aparegut sobre la placa de petri amb l’antibiòtic LB Kanamicina confirmar la
presència del gen a l’interior del plasmidi d’aquests.
37
6. ESTRIS I APARELLS EMPRATS

NOM: DESCRIPCIÓ: IL·LUSTRACIÓ:
Emprat per absorbir i

transferir petits volums de
líquids.
Micropipetes emprades:
Micropipetes manuals. ● P1000 (100-1000 µl)
● P200 (20-200 µl)
● P20 (2-20 µl)
● P2 (0,2-2 µl)
Es col·loquen a la part
inferior del pipetejador, és
Puntes de pipeta. on es troba el líquid abans
de deixar-lo anar al
recipient.
Gradeta per a tubs Té com a finalitat

Eppendorf. mantenir-hi drets els tubs
Eppendorf.
Petit contenidor cilíndric

de plàstic, amb un fons
cònic i típicament una tapa
unida al cos del tub per
Tubs Eppendorf de evitar el seu despreniment.
diferents mesures. Són emprats a la
centrifugació i com a
simples vials contenidors
de substàncies químiques.
38
Instrument per a contenir

líquids. Té forma cilíndrica,
amb un fons pla; se’n
Vas de precipitats plàstic. poden trobar de capacitats
diverses, des d’un mil·lilitre
fins a diversos litres.
Recipient cilíndric, acabat

amb un bec que s’empra
Flascó rentador per netejar vidre de
laboratori i altres equips.
S’utilitza per trencar,

raspar, recollir i transferir
productes químics sòlids,
en pols o grànuls o altres
Espàtula materials dels matrassos o
flascons
d’emmagatzematge a altres
contenidors.
S’utilitza per mesurar el

Pipetes graduades de vidre volum fix o variable del
líquid que aboca.
39
Permeten manejar amb

Pipetejador automàtic. precisió i rigor el
transvasament de líquids
d’uns recipients a uns
altres.
Petit imant que serveix per

a barrejar substàncies amb
Agitador magnètic. l’ajuda de l’agitador
magnètic.
Instrument format per un

tub estret de vidre o de
Comptagotes de plàstic. plàstic amb un mànec de
goma que serveix per fer
caure un líquid gota a gota.
Estri que té la forma d’un

Embut de plàstic. con buit invertit, amb un
tub d'escolament en el
vèrtex.
40
Instrument volumètric,
que permet mesurar
Proveta volums superiors i més
ràpidament que les
pipetes, encara que amb
menor precisió.
Recipient de vidre cònic

amb un coll cilíndric i pla
Matràs d’Erlenmeyer per la base, que s’utilitza
per a manipular líquids
més aviat volàtils.
Utilitzat per a la tinció del

Tupper de plàstic. gel d’agarosa.
Dissenyada per a una

purificació ràpida d'àcids
nucleics. Membrana de
Columnes de filtració sílice que pot seleccionar
de manera reversible i
unir-se eficaçment als
àcids nucleics.
41
Instrument utilitzat en el
cultiu de microorganismes
per transvasar un inòcul
Nansa de sembra pres de la solució mare a
un nou medi de cultiu.
Recipient cilíndric poc

profund amb tapa ajustada
Placa de petri que està dissenyat
específicament per al seu
ús en microbiologia o
cultiu cel·lular.
Eina utilitzada per retallar

Cutter la banda del plasmidi.
Protegeixen els ulls de

Ulleres de protecció l'impacte de partícules i de
la llum visible i no visible.
S’utilitza per escalfar

substàncies.
Encenedor de bomba És metàl·lic, funciona amb
una bomba de gas i té un
cremador amb una clau
per graduar el pas del gas.
Taula 3: Estris de laboratori emprats; Font: Elaboració pròpia.
42
NOM: DESCRIPCIÓ: IL·LUSTRACIÓ:
Aparell utilitzat per

mesurar, en funció de la
longitud d’ona, la relació
Biodrop o nanodrop entre valors d’una mateixa
magnitud fotomètrica
relatius a dos feixos de
radiacions.
Ens permet realitzar els

cicles de temperatures
Termociclador necessaris per a
l’amplificació de diversos
fils d’ADN a la tècnica de la
PCR.
Instrument electrònic de
mesura que s’utilitza per
pH-metre digital determinar el pH (acidesa
o basicitat) d’un líquid
Instrument de mesura que

Balança electrònica serveix per a avaluar el pes
o la massa.
43
Equip per escalfar mostres

en diferents contenidors o
Termobloc tubs sense utilitzar líquids.
Tipus de centrifuga
especial que compleix la
funció de centrifugar
Microcentrífuga mostres que estan a petits
tubs capil·lars, per tal de
separar els components
d'aquestes mostres en
dues fases.
Màquina que posa en

rotació una mostra per
Centrifugadora separar per la força
centrifugadora els seus
components o fases, en
funció de la seva densitat.
Dipòsit amb dos

compartiments que
Cubeta d’electroforesi contenen el tampó
delectroforesi, entre els
quals es col·loca el gel.
44
Instrument de mesura del

Voltímetre voltatge entre dos punts
d’un circuit elèctric.
Electrodomèstic destinat a
cuinar o escalfar aliments
que actua escalfant l’aigua
que contenen o els líquids
Microones que s’afegeixen. Funciona
mitjançant la generació
d’ones de ràdio d’alta
freqüència.
L’objectiu d’aquest escàner

Escàner de fluorescència és mostrar si la PCR ha
funcionat correctament o
no.
S’utilitza per assecar i

Estufa esterilitzar recipients de
vidre i metall al laboratori.
Taula 4: Aparells de laboratori; Font: Elaboració pròpia.
45
Prèviament d’iniciar el desenvolupament experimental detallat, cal esmentar que a

l’Annex 1 s’hi inclouen alguns conceptes bàsics relatius als procediments emprats.
7. MATERIAL I MÈTODES
7.1 Reacció en cadena de la polimerasa (PCR)
MATERIAL I UNITATS
1 Micropipeta manual P200 (20-200 µl). 2 Gradetes per a tubs Eppendorf.

1 Micropipeta manual P20 (2-20 µl). 1 Tub Eppendorf.
1 Micropipeta manual P2 (0,2-2 µl). 3 Tubs Eppendorf de PCR.
Diverses puntes de pipeta. 1 Termociclador.
a) Protocol de preparació mostres PCR

En ser volums molt petits els que s’han d’utilitzar, es realitza una Master Mix (MM). Per
dur a terme les mesures més adients, cal sumar una mostra de més per assegurar
l’exactitud de la preparació de la Master Mix i per poder tenir, en cas d’equivocació,
dissolució de reserva.
46
Reactius Quantitat x1 Quantitat x4

mostra (µl) mostres (µl)
Buffer de la polimerasa. 5 µl 20 µl
Sal de sulfat de magnesi 3 µl 12 µl

(MgSO4)
Forward 1 µl 4 µl
Encebadors
Master Mix Reverse 0,6 µl 2,4 µl
(MM)
Template. 0,5 µl 2 µl
Nucleòtids. 0,5 µl 2 µl
Enzim polimerasa. 0,3 µl 1,2 µl
Aigua mQ fins a 50 µl fins a 200 µl

(39,1 µl) (156,4 µl)
TOTAL 50 µl 200 µl
Taula 5: Reactius i quantitats per realitzar mostres per a PCR; Font: Elaboració pròpia.
b) Preparació i repartició de la Master Mix en les mostres

1) Regular la micropipeta P200 (20-200 µl) a 156,4 µl per tal d’afegir l’aigua mQ.
2) Regular la micropipeta P20 (2-20 µl) segons el reactiu que es vol afegir. Afegir el
Buffer de la polimerasa i la sal de sulfat de magnesi (MgSO4).
3) Regular la micropipeta P2 (0,2-2 µl) segons el reactiu que es vol afegir. Afegir els
encebadors forward i reverse, el template, els nucleòtids i l’enzim polimerasa.
47
RECOMANACIONS
❖ En funció del reactiu que s’afegeix, si és viscós o no, cal pipetejar-ho una mica
abans amb ajuda de la micropipeta.
❖ Els reactius afegits a la dissolució per fer la Master Mix, s’han de col·locar
separats dels que encara no s’han afegit, perquè en ser tubs molt semblants es
pot tornar a afegir repetidament algun dels reactius.
❖ Afegir al final els enzims perquè són molt sensibles i no es poden estar
extraient i retornant al congelador contínuament.
Per no contaminar la resta de reactius de la Master Mix és imprescindible canviar de

punta cada vegada que es vulgui pipetejar o afegir un nou reactiu.
La repartició de la MM en diferents tubs Eppendorf de PCR depèn de les diferents

mostres que es volen analitzar o estudiar.
1) Repartir la mescla en 3 tubs Eppendorf de PCR.
A cada mostra s’afegeixen 50 µl amb ajuda de la micropipeta P200 (20-200 µl).
Figura 14: Repartint la mescla de la MM a cada tub Eppendorf

de PCR; Font: Elaboració pròpia.
48
c) Cicle PCR
Distribuir al Termociclador els 3 tubs Eppendorf de PCR amb la mostra de la MM a tres
temperatures distintes.
MOSTRA: TEMPERATURA (ºC):
S1 Fila A = 60ºC
S2 Fila C = 58ºC
S3 Fila D = 56,2ºC
Taula 6: Temperatura a la qual se situa cada mostra al Termociclador; Font: Elaboració pròpia.
Figura 15: Col·locant els tubs Eppendorf al Termociclador,

programa de la PCR; Font: Elaboració pròpia.
➔ El temps total que es triga a fer una PCR en aquest disseny experimental és d’ 1
hora i 45’.
49
PASSOS: TEMPERATURA TEMPS:

(ºC):
1a Desnaturalització 95ºC 2’
2a 95ºC 30’’
Desnaturalització
35 cicles
Hibridació 50-60ºC 30’’
Elongació 72ºC 35’’
Extensió 72ºC 4’
Taula 7: Protocol de PCR en Termociclador en 35 cicles; Font: Elaboració pròpia.
7.2. Electroforesi en gel d'agarosa de la PCR

Aquesta tècnica consta d’uns passos previs, els quals s’anomenen en ordre a
continuació:
a) Preparació Buffer TAE al 5X

Tampó TAE (Tris-acetato-EDTA) s'utilitza per a l’electroforesi en gel i es pot fer servir
per a accelerar el procés, ja que l'ADN lineal de doble fil s’executa ràpidament.
MATERIAL I UNITATS
2 Vasos de precipitats plàstics. 1 Comptagotes de plàstic.

1 Flascó rentador. 1 Embut de plàstic.
2 Agitadors magnètics. 1 Proveta de plàstic 1000 mL
1 Espàtula. 1 Balança electrònica.
2 Pipetes graduades de vidre. 1 pH-metre.
1 Pipetejador automàtic.
50
1) Realitzar la mescla de tots els reactius que s’esmenten a la taula següent:
Reactius: Quantitat:
Tris Base 24,20 g
Buffer TAE 5X EDTA 10 mL
Àcid acètic 5,70 mL
Aigua (fins a 1000 mL)
TOTAL 1000 mL
Taula 8: Reactius i quantitats per realitzar Buffer TAE 5X; Font: Elaboració pròpia.
2) Mesurar la quantitat de pH amb el pH-metre.

S’ha obtingut un pH d’aproximadament 8,23. Amb ajuda d’àcid disminuïm el pH
fins a obtenir un pH de 8,1.
Tenim una concentració de Buffer TAE 5X, però amb una dilució 1:5 de la solució mare
de TAE amb H₂O produeix una solució de treball 1X. Per tant, s’han de preparar 200 mL
de Buffer TAE 5X i 800 mL de H₂O per obtenir 1000 mL totals.
Més endavant es torna a efectuar una electroforesi, per fer ús de nou d’aquest Buffer
TAE 1X és important conservar-lo a temperatura ambient.
b) Preparació del gel d’agarosa
MATERIAL I UNITATS
1 Espàtula. 1 Cubeta d’electroforesi.

1 Matràs d’Erlenmeyer. 1 Microones.
1 Proveta de vidre. 1 Balança electrònica.
El gel d’agarosa ha de tenir una concentració d'1% (1 g d’agarosa/100 mL de Buffer TAE

1X).
51
Buffer TAE 1X 90 mL
GEL D’AGAROSA A l’1%
Agarosa 0,90 g
Bromur d’Etidi (BrEt) 1 µl
Taula 9: Reactius i quantitats per realitzar gel d’agarosa a l’1%; Font: Elaboració pròpia.
1) En un matràs d’Erlenmeyer mesurar amb ajuda d’una balança electrònica 0,90 g

d’agarosa en pols i, en una proveta 90 mL de Buffer TAE 1X.
Figura 16 : Mesurant Buffer TAE 1X en Figura 17: Mesurant agarosa en pols
una proveta; Font: Elaboració pròpia. en un matràs d’Erlenmeyer; Font:

Elaboració pròpia.
2) Abocar els 90 mL de Buffer TAE 1X en el matràs d’Erlenmeyer, el qual ja conté

l’agarosa en pols.
52
Figura 18: Abocant els 90 mL de Buffer

TAE 1X en el matràs d’Erlenmeyer;
Font: Elaboració pròpia.
3) Escalfar la mescla del matràs d’Erlenmeyer al microones en cicles de 20’’ fins a

aconseguir una mescla homogènia.
Figura 19: Col·locant al microones el matràs

d’Erlenmeyer amb la mescla; Font:
4) Un cop desfeta la mescla al matràs d’Erlenmeyer, submergir-lo amb molta cura

sota la pica per tal de temperar-lo.
53
Figura 20: Submergint el matràs

d’Erlenmeyer sota la pica; Font:
5) Abocar al motlle de l’electroforesi sota la mescla d’agarosa preparada amb

anterioritat fins a sobrepassar la pinta.
Figura 21: Abocant la mescla d’agarosa al

motlle de l’electroforesi; Font: Elaboració
pròpia.
6) Deixar refredar a temperatura ambient fins a la solidificació del gel d’agarosa.

7) Retirar la pinta amb precaució per no perjudicar el gel d’agarosa.
8) Col·locar el gel d’agarosa en una cubeta d’electroforesi (camp magnètic amb pols
positiu i negatiu).
54
Figura 22: Gel d’agarosa col·locat en una

cubeta d’electroforesi; Font: Elaboració pròpia.
9) Afegir Buffer TAE 1X fins que s’ompli completament la cubeta d’electroforesi per
tal d’hidratar el gel d’agarosa.
Figura 23: Afegint Buffer TAE 1X a la

cubeta d’electroforesi amb el gel
d’agarosa gelificat; Font: Elaboració
pròpia.
c) Carregar les mostres al gel d’agarosa
MATERIAL I UNITATS
6 tubs Eppendorf de PCR. 1 Micropipeta manual P2 (0,2-2 µl).
2 Gradetes de tubs Eppendorf. 1 Micropipeta manual P20 (2-20 µl).
Diverses puntes de pipeta. 1 Cubeta d’electroforesi.
55
Colorant 6X 1 µl
Mostra S1 5 µl
Mostra S2 5 µl
Mostra S3 5 µl
Referència 5 µl
TOTAL 6 µl
Taula 10: Reactius i quantitats amb els quals es carreguen les mostres al gel d’agarosa; Font:
1) Afegir 1 µl de colorant 6X a cadascuna de les mostres i de la referència.
Figura 24: Afegint 1 µl de colorant

6X a cadascuna de les mostres; Font:
Per no malgastar un excés de puntes es recomana afegir primer el colorant 6X.
56
2) Prendre la mostra amb ajuda de la micropipeta i, suaument introduir la punta al

gel d’agarosa gelificat. Seguidament, descarregar lentament la mostra mentre
s’ascendeix la micropipeta per tal d’ocupar tot l’espai.
Figura 25: Descarregant lentament la

mostra al gel d’agarosa gelificat; Font:
Elaboració pròpia. Figures 26: Resultat final de carregar les mostres
al gel d’agarosa gelificat; Font: Elaboració pròpia.
d) Realitzar el desplaçament de la mostra al voltatge pertinent
MATERIAL I UNITATS
1 Cubeta d’electroforesi.
1 Voltímetre.
1) Col·locar el gel d’agarosa gelificat en una cambra amb dos extrems dels quals un
es connecta a l'elèctrode positiu i l’altre al negatiu.
57
Figura 27: Gel d’agarosa gelificat col·locat a una cubeta

d’electroforesi i connectada al voltímetre; Font:
La solució salina amb la qual s’emplena el gel cobrint els pous fa que es pugui
transmetre el corrent al gel, d’aquesta manera l’ADN pot desplaçar-se perquè aquest fa
que els grups fosfat de l’esquelet de sucre-fosfat atorguin una càrrega negativa a les
molècules d’ADN, amb la qual aquestes comencen a moure’s entre els porus del gel cap
al pol positiu.
A mesura que corre el gel, els fragments més curts viatgen a més velocitat que els
fragments més llargs. Finalment, els fragments més curts estaran propers al pol positiu,
mentre que els fragments més llargs estaran propers als pous de sortida.
e) Tinció del gel d’agarosa
MATERIAL I UNITATS
1 Micropipeta manual P20 (2-20 µl). 1 Tupper de plàstic.

Varies puntes de pipeta. 1 Proveta de plàstic.
1) Col·locar el gel d’agarosa en una cubeta de plàstic amb el mateix Buffer TAE 1X i
afegir colorant SYBR.
58
➔ La tinció del gel d’agarosa en aquest disseny experimental té una durada

d’aproximadament 1 hora i 30’.
Figura 28: Resultat de la tinció del gel d’agarosa;

f) Revelació del gel d’agarosa
MATERIAL I UNITATS:
1 Escàner de fluorescència.
La revelació del gel d’agarosa s’ha dut a terme en una sala restringida on s’ha fet ús d’un
escàner de fluorescència. Aquest equip està format per una quadrícula de lletres i
números on es col·loca el gel d’agarosa per tal d’examinar-lo.
Per fer ús d’aquest escàner és necessari d’escriure el tipus de fluoròfor i la font de llum
que el mou a una determinada longitud d'ona, aquesta serà la longitud d'ona que excita
el fluoròfor, seguidament cauen els electrons i es genera una radiació d’emissió que és
recollida.
59
Figura 29: Gel d’agarosa col·locat a

l’escàner de fluorescència; Font: Elaboració
pròpia.
Si tot surt bé, obtindrem nombroses còpies del gen que ens interessa, és a dir, bandes
de l’ADN on es troba concentrat el fluoròfor.
g) Observacions del resultat de l’electroforesi

○ La zona que es veu més fosca són els encebadors.
○ La banda és el gen que s’ha amplificat durant la PCR.
○ La zona que està fosca d’una manera més tènue són els oligonucleòtids.
○ A la mostra, la banda no ha sortit massa tènue perquè en el moment de
carregar-la al gel d’agarosa, no he pogut veure bé un dels buits on es col·loca i en
intentar carregar un lloc que no és concretament el buit, el resultat d’aquesta no
surt del tot correcte.
En principi, la PCR ha funcionat correctament, ja que a la revelació del gel d’agarosa no

s’observa res més que posseeixi un color més fosc. En cas que haguessin sortit més
bandes serien els subproductes. Finalment, s’ha pogut comprovar que a l’hora de
pipetejar i fer la barreja s’ha realitzat correctament.
60
A partir d’aquest punt, les quantitats que apareixen a continuació s’han fet per duplicat
donada la complexitat experimental per tal de seguir el protocol de l’investigador i fer
una comparativa del procediment i garantir que els resultats obtinguts són fidels.
7.3. Purificació d'ADN des de la solució (PCR clean-up)

MATERIAL I UNITATS
1 Micropipeta manual P20 (2-20 µl). 2 Gradetes de tubs Eppendorf.

1 Micropipeta manual P200 (20-200 µl). 2 Columnes de filtració.
Diverses puntes de pipeta. 1 Termobloc.
4 Tubs Eppendorf. 1 Centrifugadora.
La purificació d’ADN es realitza a partir de la solució, la qual és semblant a la de

proteïnes, però a petita escala. En el supòsit cas que s’obtenen volums molt petits és
necessari ajustar el volum de la reacció de PCR a 50 o 100 µl.
a) Procés de centrifugació
1) Barrejar un volum de mostra de PCR amb dos volums de Buffer NTI.
Com suposem que el nostre volum de PCR és de 50 µl, cal afegir 100 µl de Buffer NTI als
tubs Eppendorf i seguidament a les columnes.
Color groc = indicador del pH.

Si varia el color de la solució vol dir que aquesta no està en bones condicions.
2) Centrifugar durant 30’’ a 11.000 helths i abocar el líquid que travessa la resina de
totes dues columnes.
La solució travessa la resina, però les molècules d'ADN es queden retingudes en aquesta.
61
Abans d’utilitzar una centrífuga, hem d’assegurar que la mostra que es col·loca es
troba equilibrada amb una altra. Les diferències de pes poden desequilibrar el rotor
quan gira a gran velocitat ocasionant danys a la centrífuga i possible trencament dels
tubs de mostra.
3) Afegir 700 µl d'alcohol.
INFORMACIÓ DE L’ALCOHOL (C₂H₆O):

● És molt volàtil, ja que quan queda una quantitat petita de volum tendeix a
enganxar-se per les parets i és necessari agitar-lo abans.
● S’encarrega de fer que l'ADN precipiti i quedi més aferrat a la resina.
● S’encarrega d’arrossegar totes les restes de compostos orgànics que queden
després de la centrifugació.
Així doncs, bàsicament té una doble funció:

➔ Precipitar l'ADN.
➔ Eliminar contaminants de la solució prèvia.
4) Centrifugar durant 30’’ a 11.000 helths i abocar el líquid que queda posteriorment
de la centrifugació.
5) Afegir 700 µl d’alcohol per eliminar les restes de l'anterior solució.
6) Centrifugar durant 30’’ a 11.000 helths i abocar el líquid que queda després de la
centrifugació.
7) Centrifugar durant 1’ sense afegir res més, per tal d’eliminar l'excés d'alcohol que
queda a les columnes.
8) Incubar al termobloc l’aigua que s’ha utilitzat per a la PCR, 2 tubs Eppendorf buits
i les columnes deixant-les obertes durant 5’ a 70ºC per assegurar que no queda
res d'alcohol.
62
9) Afegir 50 µl d'aigua a cada columna i tancar-la per tal de garantir que no surti
l’aigua.
10) Passar les columnes als tubs Eppendorf buits que s’havien col·locat al termobloc.
11) Incubar al termobloc a 70ºC durant 2’.
12) Centrifugar durant 1’.

Com a resultat obtenim l’ADN.
b) Mesurar la quantitat d’ADN
MATERIAL I UNITATS
1 Gradeta de tubs Eppendorf. 1 Micropipeta manual P20 (2-20 µl).

Diverses puntes de pipeta. 1 Biodrop o nanodrop.
La quantitat d’ADN es mesura en un Biodrop o nanodrop. Per utilitzar aquest instrument

de laboratori és necessari netejar abans amb ajuda d’aigua, paper i una micropipeta
manual.
Figura 30: Netejant el lloc on es

col·loca la mostra; Font: Elaboració
pròpia.
63
1) Primerament, mesurar la referència i després cadascuna de les mostres.
Segons la referència, la concentració en 1 µl és de 45 ng d'ADN.
Com les elucions són de 50 ng i la quantitat total és de 2250 ng (50 ng x 45 ng) tenim
bastant ADN.
ANÀLISI D’ABSORBÀNCIA:
○ Absorbància a 230 nm (A230 nm): indica la presència de compostos orgànics
com per exemple; l'alcohol o els precipitants que hi ha a la primera solució.
○ Absorbància a 260 nm (A260 nm) és la longitud d'ona òptima per tal de citar-se
l'ADN i absorbeixi.
○ Absorbància a 280 nm (A280 nm) és la longitud d'ona òptima per tal de citar les
proteïnes i absorbir-les.
Quan el valor és superior a 1, significa que està correcte perquè no hi ha tanta

contaminació, és a dir la poca polimerasa que hi havia l’hem tret de sobre.
De contaminants orgànics, potser n’ha quedat algun, però molt petit perquè l'ADN
sobrepassa al contaminant orgànic. Quan aquests valors estan a prop d’1,5 o per damunt
es considera que la mostra està neta i és òptima per tal de treballar amb ella.
Les mostres es troben a 45 ng/µl i estan exactament igual que la referència, presenten
alguns contaminants, però estan per damunt d’1 fet que indica que es pot treballar amb
aquestes l’endemà per dur a terme la digestió enzimàtica.
64
7.4. Doble digestió enzimàtica plasmidi
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 Micropipeta manual P2 (0,2-2µl).
1 Termobloc. 1 Tub Eppendorf.
1) Realitzar una Master Mix de tots els reactius que es necessiten per dur a terme la
digestió del plasmidi amb enzims.
Aquest càlcul es realitza partint de la concentració d’ADN que tenim en ng per tal
d’arribar a la concentració final d’1 µg.
2) Incubar el plasmidi a 37°C durant 1 hora per tal de ser digerit.
Figura 31: Incubant el plasmidi a 37ºC

durant 1 hora; Font: Elaboració pròpia.
3) Afegir 1 µl de NdeI i 0,5 µl de XhoI.
4) Incubar durant 30’ al termobloc. Es duu a terme una doble digestió enzimàtica
perquè es digereixen dos enzims.
65
7.5. Electroforesi en gel d'agarosa del plasmidi

L’electroforesi ja s’ha explicat detalladament al principi, com aquest procediment torna a
ser exactament el mateix que l’anterior, i a més s’utilitza el mateix material, només
pretenc anomenar els passos i afegir algunes imatges, de les quals no s’han mostrat
encara. En aquest cas, el Buffer TAE al 5X ja el tenim preparat perquè s’ha realitzat la
quantitat suficient el primer dia per dur a terme tot el disseny experimental.
a) Preparació del gel d’agarosa
b) Carregar les mostres al gel d’agarosa

Els components que s’utilitzen per a carregar les mostres al gel d’agarosa s’esmenten a
la següent taula:
Components:
Referència (o patró)
Plasmidi digerit
Colorant 6X
Taula 11: Reactius amb els quals es carrega el gel d’agarosa; Font: Elaboració pròpia.
Figura 32: Mostres carregades al gel

d’agarosa; Font: Elaboració pròpia.
66
c) Realitzar el desplaçament de la mostra al voltatge pertinent
Figura 33: Resultat final del desplaçament de la

mostra al voltatge pertinent; Font: Elaboració pròpia.
d) Tinció del gel d’agarosa
7.6. Doble digestió enzimàtica dels productes de la PCR
MATERIAL I UNITATS
1 Microcentrífuga
a) Descongelació productes de la PCR

Els productes de PCR es troben a 45 ng/µl. Per dur a terme una digestió cal utilitzar
entre 500 - 1000 ng. En el nostre cas, s’han decidit emprar 750 ng.
Per conèixer el volum d’ADN que s’haurà d'utilitzar es realitza la següent divisió:
750 ng ÷ 45 ng/µl = 16,7 µl d’ADN.
Com que la suma dels reactius i l’ADN superen els 20 µl totals de la reacció que volem
obtenir és imprescindible baixar la quantitat d’ADN a 13 µl.
Sempre que es descongela algun producte o molècules que no siguin proteïnes és

molt important centrifugar abans.
1) Centrifugar els productes de PCR en una microcentrífuga.
67
Figura 34: Centrifugant els

productes de PCR; Font: Elaboració
pròpia.
b) Protocol de preparació productes de la PCR per a la digestió enzimàtica
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 Micropipeta manual P2 (0,2-2µl).
1 Termobloc. 2 Tubs Eppendorf.
Reactius: Quantitat x1 (µl):
ADN 13 µl
Buffer TANGO 4 µl
Reacció:
NdeI 2 µl
Enzims
XhoI 1 µl
TOTAL 20 µl
Taula 12: Reactius i quantitats per realitzar la digestió enzimàtica dels productes de la PCR; Font:
68
1) Afegits tots aquests reactius en un mateix tub Eppendorf, en ser solucions

viscoses, cal resuspendre amb una micropipeta.
2) Incubar la solució realitzada dels productes de PCR a 37º C durant 1 hora al
termobloc.
3) Afegir de nou els enzims NdeI i XhoI a la reacció dels productes de PCR.
4) Incubar a 37ºC durant 30’ al termobloc.
Figura 35: Afegint enzims NdeI i XhoI

a la reacció dels productes de PCR;
c) Retallar la banda del plasmidi
MATERIAL I UNITATS
1 Cutter.
1 Ulleres de protecció.
Per retallar la banda del plasmidi és inevitable anar a una cambra fosca, aquesta disposa
d’un transil·luminador que genera una llum semblant a ultravioleta i s'encarrega d’excitar
la tinció que s’uneix a l’ADN, fet que provoca la visió del gel d’agarosa directament.
69
És obligatori utilitzar sempre unes ulleres de protecció, ja que és molt perillós i pot
perjudicar la vista.
Figura 36: Entrada de la cambra fosca;

1) Col·locar el gel damunt del “vestit il·luminador”.

2) Amb un cutter es talla el gel d’agarosa.
3) Extreure el fragment d’ADN i treure l'excés del gel d’agarosa.
d) Observacions del resultat

A causa de la prevenció de danys a la vista no s’ha pogut dur a terme una fotografia per
tal de mostrar els resultats.
S’observa que el gel brilla. A la dreta es troba el marcador i a l'esquerra s’observen les
bandes del plasmidi molt tènues; una banda amunt (dona just on està el colorant blau) i
una altra a baix (dona just on està el colorant lila), el fet d’estar just on estan els
colorants, tapa molt la fluorescència.
70
7.7. Purificació del plasmidi i productes de la PCR (“DNA extraction

from agarose gels”)
MATERIAL I UNITATS
2 Gradetes de tubs Eppendorf. 1 Micropipeta manual P1000 (100-1000 µl).

Diverses puntes de pipeta. 1 Micropipeta manual P200 (20-200 µl).
1 Termobloc. 6 Tubs Eppendorf.
1 Centrifugadora. 1 Balança electrònica.
3 Columnes.
El fet de tenir una massa (agarosa tallada), per cada 100 mg de gel d’agarosa amb un
percentatge inferior al 2% (el nostre és d’1%) s’han d’afegir 200 µl.
1) Determinar el pes d’un tub Eppendorf en una balança. És d’1 g total.
2) Mesurar el pes del gel d’agarosa. És de 270 mg total.
3) Transferir el gel d’agarosa a un tub Eppendorf net.
4) Afegir el doble de quantitat de Buffer NTI (540 µl) al tub Eppendorf amb el gel
d’agarosa.
La solució canvia de color perquè es barreja amb un producte que conté colorant
blau.
5) Incubar la mostra del gel d’agarosa al termobloc durant 10’ a 60º C.

És important vigilar cada 2-3 minuts fins que el gel estigui completament dissolt.
6) Centrifugar per tal que descendeixin totes les restes de líquid que s’han quedat al
caputxó del tub Eppendorf
7) Prendre 3 columnes.
71
Nom columna: Què contindrà?
Columna (r) producte PCR xxxxxx
Columna (s) producte PCR xxxx
Columna (P) Plasmidi
Taula 13: Noms de la columna i del contingut que conté. Font: Elaboració pròpia.
En aquest tipus de columnes, el màxim volum que es pot afegir és de 700 µl. Com en el
nostre cas la barreja de Buffer NTI i agarosa ja estan a prop d’ 1 mL, afegim 700 µl al tub
del plasmidi, esperem que descendeixi i finalment, afegim la resta.
1) Afegir 700 µl de l’agarosa fosa al tub del plasmidi.
2) Centrifugar durant 30’’.
A partir d’aquest moment, tot el procediment es realitza amb les tres columnes alhora.
Com això ja seria purificació de mostra líquida, el volum no pot ser inferior als 30 µl, ja
que ha d’estar entre 50-100 µl.
En aquest cas tenim 20 µl, llavors cal afegir a cada columna 30 µl d'aigua per tal d’arribar
als 50 µl.
3) Afegir a cada tub Eppendorf (s) i (r) 30 µl d’aigua.
4) Afegir a cada tub Eppendorf (s) i (r) 100 µl del Buffer NTI i barrejar una mica.
S'obté un color groguenc.
5) Amb ajuda d’una micropipeta traspassar la barreja a les columnes (S) i (R).
6) Afegir el que queda d’agarosa líquida al plasmidi digerit.
72
a) Procés de centrifugació
Quan la solució ve de digestió enzimàtica i sobretot si ve de gel és millor fer tres rentats
en comptes de dos. No es fan més rentats, ja que a partir del quart es queda igual. En el
nostre cas farem 3 rentats de 30’’ cadascun.
1) Centrifugar les 3 columnes (s), (r), (P) alhora durant 30’’.
Figura 37: Mostres col·locades al rotor de la

centrifugadora; Font: Elaboració pròpia.
2) Afegir alcohol per precipitar l'ADN i eliminar les restes del colorant de la primera
solució de l'agarosa.
3) Centrifugar durant 30’’. Abocar líquid que queda posteriorment de la

centrifugació.
4) Afegir alcohol.
5) Centrifugar durant 30’’. Abocar líquid que queda posteriorment de la

centrifugació.
73
6) Centrifugar sense afegir res per eliminar l'excés que ha pogut quedar a l’interior
de la columna.
7) Escalfar al termobloc les columnes a 70° C durant 5’ amb els taps dels 3 tubs
Eppendorf oberts per assegurar que s’ha eliminat del tot l’alcohol.
Aquest pas és opcional, encara que és molt recomanable perquè es nota molt el
canvi, ja que quan no s’escalfa hi ha vegades que les lligacions no funcionen
correctament, i això és degut a la petita quantitat d'alcohol que queda.
Figura 38: Escalfant les columnes al

termobloc amb els taps dels tubs
Eppendorf oberts; Font: Elaboració pròpia.
8) Aprofitar per escalfar un tub amb aigua durant 5’.
9) Prendre 3 tubs d’Eppendorf (un per a cada columna).
10) Passar cadascuna de les columnes als tubs Eppendorf.
11) Afegir aigua a les columnes que es troben amb els tubs Eppendorf i incubar
durant 5’.
74
12) Centrifugar per tal que l'aigua s'ascendeixi amb l'ADN.

En aquests moments, ja tenim el plasmidi i les mostres d’ADN tallats i purificats per tant,
això vol dir que l’ADN ja està net.
b) Mesurar la concentració d’ADN net
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 Biodrop o nanodrop
Es mesura la concentració d’ADN net al biodrop o nanodrop, on a més podem observar

la puresa, i així veure si s’han arrossegat contaminants o no.
La gota a d'estar ben col·locada, en cas de no ser així, no ho calcula correctament.
És molt important que entre mesura i mesura rentar amb aigua abans per no
contaminar la següent mostra.
Generalment, quan es fa purificació de doble digestió i concretament si ve de gel, potser

la ràtio està entre 0,6 o 0,5, així i tot, no ha de per què generar inconvenients.
La referència ens n’ha donat 0.

El plasmidi ha donat 8.000 ng/µl, és a dir el resultat sobrepassa a 1.
La meva mostra ha donat 13.000 ng/µl.
75
Figura 39: Resultat de la meva

mostra al nanodrop; Font:
Realitzada la recollida de dades de la quantitat d’ADN que tenim, s’efectuen els càlculs
per tal de saber la quantitat que s’ha d’introduir del plasmidi digerit i del producte de
PCR digerit.
Generalment, es recomana que la “ràtio” siguin 3 molècules d’inserit (el producte de PCR
digerit) per 1 de plasmidi, o 5 molècules d’inserit per 1 de plasmidi.
En el meu cas, utilitzo 5 molècules d’inserit per 1 de plasmidi. Si això no funciona, és
perquè la digestió no s’ha realitzat correctament.
Mesura: 6000 parells de bases.

Mesura plasmidi: 5200 parells de bases; Concentració: 8 ng/µl
Inserit: 13 ng/µl
De tot el gen ATAD3A, només s’amplifica una regió que correspon al domini N-terminal.
Dins d’aquesta regió, s’ha fet un petit retall. Seguidament, s’ha amplificat un gen que va
des de l’aminoàcid 51 fins al 225. En total tenim 175 aminoàcids. Com que un aminoàcid
ve codificat per un triplet (3 nucleòtids), i nosaltres tenim 175 aminoàcids totals, hi
hauria d’haver 525 parells de bases.
L’objectiu és fer que la reacció de lligació tingui un volum final de 10 µl.
76
Dintre d’aquests 10 µl cal tenir en compte que es queden fixos:

● El volum de lligases = 0,5 µl
● El volum de Buffer 10x = 1 µl
Per tant, el que varia és la quantitat de plasmidi, la quantitat d’inserit i la concentració

final d’ADN que tenim. Si volem que la ràtio sigui de 5, tenim dues opcions:
● Baixar la quantitat de plasmidi (augmentarà la ràtio, però baixarà la concentració
d’ADN).
● Augmentar la quantitat d’inserit, però la concentració d'ADN ha d’estar compresa
entre 1 o 10 ng/µl.
En conclusió, resulta més eficient augmentar la quantitat d’inserit, ja que només canvia
la ràtio.
7.8. Procés de lligació
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 Micropipeta manual P2 (0,2-2 µl).
3 Tubs Eppendorf.
a) Protocol de preparació mostres per a la lligació
1) Realitzar una Master Mix, per a dues reaccions. Es fa per a tres reaccions, per tal
d’assegurar la quantitat.
77
Es realitza una Master Mix perquè són valors molt complicats de manipular i per sort,
s’utilitzen les mateixes quantitats per a les dues mostres.
Reactius Quantitat x1 Quantitat x3

Aigua 1,9 µl 5,7 µl
Master Mix Plasmidi 5 µl 15 µl

(MM)
Buffer 1 µl 3 µl
Enzim lligasa 0,5 µl 1,5 µl
TOTAL 8,4 µl 25,2 µl
Taula 14: Reactius i quantitat per realitzar mostres per a la lligació; Font: Elaboració pròpia.
2) Agafar 2 tubs Eppendorf.
3) Afegir a cada tub Eppendorf 8,4 µl de la Master Mix i 1,6 µl d’inserit. En total són
10 µl de cadascuna de les solucions.
4) Deixar durant 1 hora a temperatura ambient.

Finalitza el procés de lligació.
7.9. Transformació a E.Coli per xoc tèrmic
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 encenedor de bomba.
1 Termobloc.
Per realitzar aquest procés, primerament es descongelen les cèl·lules competents que es
troben a -80ºC.
78
En aquest moment, tenim milions de cèl·lules, les quals actualment estan en solució i
volem introduir-los-hi el nostre plasmidi tancat.
La reacció de lligació ha sigut de 10 µl totals, però només utilitzem 5 µl perquè en el

suposat cas que hagi funcionat bé la lligació no deixa de ser un excés d'ADN i pot ser
tòxic per a la cèl·lula. S'afegeix doncs, la meitat de la solució per assegurar que s’està
afegint la quantitat suficient perquè tingui lloc la transformació, però no estigui corrent
el risc de ser tòxic per a la cèl·lula.
1) Passar la punta de la pipeta molt ràpid per la flama.

2) Agafar 5 µl d'ADN.
3) Afegir aquests 5 µl d’ADN a la cèl·lula.
4) Incubar en gel uns 15’. Es duu a terme per tal que E.Coli accepti el que
s’introdueix.
5) Incubar al termobloc a 42° C durant 45’’.
La paret i la membrana estan formades per lípids per tant, amb el xoc tèrmic es torna
molt inestable i fa que es generin porus a la paret i a la membrana.
6) Ràpidament, posar en gel durant 2’ perquè aquest canvi tèrmic tan sobtat, fa que
es tanquin tots els porus, es torni a estabilitzar la membrana i la paret, i que el
nostre plasmidi amb l’inserit quedi retingut a l’interior del bacteri.
En aquest moment, la transformació d’E.Coli finalitza.
a) Plaquejar en placa de petri
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 encenedor de bomba.
2 Plaques de Petri. 1 nansa de sembra.
1 Estufa. 1 Termobloc.
79
Es plaquegen en plaques de petri de medi LB amb l’antibiòtic kanamicina perquè al

nostre plasmidi hi ha un gen de resistència kanamicina (gen marcador), d'aquesta
manera, en el suposat cas que hi hagi cèl·lules en les quals no ha entrat l’ADN, o ADN que
no s’ha lligat correctament i encara està obert, aquell es degrada.
És una forma d'assegurar que només aquells bacteris que tenen un plasmidi tancat
sobrevisquin i, en principi haurien de ser aquells que tinguin el gen a l’interior.
1) Encendre la flama i passar la punta de la micropipeta.
2) Agafar 200 µl de medi LB líquid amb ajuda d’una micropipeta.
3) Afegir el medi LB líquid a cada tub Eppendorf amb les nostres cèl·lules que ja
contenen l’ADN a l’interior i deixar a la gradeta.
4) Incubar al termobloc a 37°C durant 1 hora.
Sempre que es volen fer créixer bacteris han d’estar en agitació al termobloc.
És important no retornar al gel, perquè si directament del gel es passa a una

temperatura de 37°C, semblaria un altre “xoc tèrmic” i, se suposa que l'ADN està tot
concentrat a la cèl·lula. (Si es fa el contrari, l’ADN comença a sortir del bacteri E.Coli).
5) Centrifugar durant 3’ per tal de concentrar totes les cèl·lules. Queda un

sobrenedant.
6) Retirar uns 100 µl del volum que tenim, i amb el volum que queda resuspendre
les cèl·lules.
7) Amb una micropipeta, agafar la quantitat que tenim de cèl·lula i col·locar en una
placa de LB kanamicina.
80
8) Amb ajuda d’una nansa de sembra s’estén la quantitat de cèl·lula per tota la placa
de petri. A l’hora de plaquejar no pot quedar líquid a la placa.
9) Deixar creixent en una estufa a 37ºC durant aproximadament 15 hores.
L’endemà, si el procés ha resultat exitós i arriben a créixer bacteris (colònies) es fa una

PCR d’una sola colònia (Colony PCR).
7. 10. Colony PCR
MATERIAL I UNITATS

Diverses puntes de pipeta. 1 Micropipeta manual P2 (0,2-2 µl).
3 Tubs Eppendorf. 1 Tub Eppendorf.
5 Tubs Eppendorf de PCR.
L’objectiu és contemplar si el gen s’ha inserit a l'interior del plasmidi.

Una colònia es forma perquè els bacteris han aconseguit sobreviure i han començat a
reproduir-se. Aquestes colònies són milions de clons d’un únic bacteri.
Apareixen colònies = el plasmidi s’insereix a la cèl·lula tancat, però no implica que

estigui el gen. En cas que surtin colònies, però la PCR surti negativa, això vol dir que el
plasmidi s'ha tancat sobre si mateix i no ha entrat el gen a l’interior.
a) Protocol preparació mostres per a la Colony PCR
1) Identificar les colònies que han aparegut a la placa de petri. (PR: 1 colònia, PS: 4
colònies).
81
Figura 40: Colònies identificades a la placa de petri

amb LB kanamicina. Font: Elaboració pròpia.
2) Calcular la quantitat que es necessita de cada reactiu per tal de dur a terme la
Master Mix. Es realitzen 5 PCR en total, ja que és una per a cada colònia.
La Master Mix es fa per a 6 reaccions per assegurar la quantitat necessària.
Reactius Quantitat x1 Quantitat x6 (6)

Aigua 14,8 µl 88,8 µl
Buffer de la polimerasa 2 µl 12 µl
Suplement de sulfat de 1,2 µl 7,2 µl

Master Mix
magnesi
(MM)
Forward 1 µl 6 µl
Encebadors
Revers 0,6 µl 3,6 µl
Nucleòtids 0,2 µl 1,2 µl
Enzim polimerasa 0,2 µl 1,2 µl
TOTAL 20 µl 120 µl
Taula 15: Reactius i quantitats per realitzar mostres per a la Colony PCR; Font: Elaboració pròpia.
En la Colony PCR no es proporciona l'ADN motlle, ja que ho seran les pròpies colònies.
Per aquesta raó, cada colònia s’afegeix a cada tub Eppendorf diferent.
82
b) Repartició de la Master Mix
1) Separar la solució de la MM en 5 tubs Eppendorf diferents. A cada tub Eppendorf

de PCR s’hi afegeixen 20 µl totals d’aquesta.
Figura 41: Afegint 20 µl a cada tub

Eppendorf de PCR; Font: Elaboració
pròpia.
2) Extreure cada colònia de la placa de petri i afegir una a cada tub Eppendorf
diferent.
Figura 42: Extraient la colònia de la

placa de petri amb LB kanamicina; Font:
83
c) Cicle de Colony PCR

1) Col·locar els tubs Eppendorf amb la solució al termociclador.
Producte R2; Hibridació: 58ºC

Producte S3; Hibridació: 56ºC
Cal seguir les mateixes condicions per tal d'assegurar que si surt negativa la PCR de
colònies, que sigui perquè no s’ha arribat a inserir el gen i no pel dubte de la
temperatura d’hibridació.
PASSOS: TEMPERATURA TEMPS:

(ºC):
1a Desnaturalització 95ºC 8’
2a 95ºC 30’’
Desnaturalització
35 cicles
Hibridació 50-60ºC 30’’
Elongació 72ºC 35’’
Extensió 72ºC 4’
Taula 16: Protocol de la Colony PCR en Termociclador en 35 cicles. Font: Elaboració pròpia.
7.11. Electroforesi en gel d'agarosa de la Colony PCR

L’electroforesi en gel d’agarosa de la Colony PCR es duu a terme amb els mateixos passos
i materials que s’han explicat a la primera electroforesi de la PCR, per aquesta raó no es
tornen a esmentar i només em centro en els resultats.
a) Observacions del resultat de l’electroforesi:

Podem observar els encebadors i el producte de PCR. Això vol dir que les 5 colònies han
funcionat. Així i tot, han hagut algunes colònies que no han funcionat del tot, això ens
84
manifesta que en aquestes colònies no s’ha integrat correctament el plasmidi, ja que la

PCR a sortit negativa. En conclusió, de totes les colònies que han aparegut a la placa de
petri amb LB kanamicina és més fiable extreure l'ADN de la colònia 1 o de la colònia 4.
Figura 43: Resultat de l’electroforesi en gel

d’agarosa de la Colony PCR Font; Elaboració
pròpia.
8. ENTREVISTA RAMIRO ILLANES VICIOSO

L’objectiu d’aquest apartat és resumir els punts clau de l’entrevista que he pogut
realitzar al personal d’investigació que m’ha acompanyat durant l’estada. Aquesta
entrevista es troba completa a l’apartat d’Annexos 2.
Ramiro Illanes Vicioso va estudiar un grau en Bioquímica a l’Universitat de Sevilla

(2011-2015). Més endavant, va realitzar un Màster Oficial en Investigació,
Desenvolupament, Control i Innovació de Medicaments a l’Universitat de Granada
(2015-2016). Actualment, es troba realitzant un Doctorat en Biotecnologia, concretament
en Biologia Estructural a l’Institut de Biologia Molecular (2018-2023).
La curiositat de Ramiro per la Biologia Estructural va iniciar durant la secundària quan

va començar a estudiar les principals macromolècules biològiques. El propòsit principal
del seu equip d’investigació és resoldre l’estructura secundària i tridimensional de
proteïnes mitocondrials implicades en el desenvolupament de malalties rares.
85
Actualment, investiga el gen ATAD3A que codifica per una proteïna mitocondrial
humana implicada en el desenvolupament de la síndrome d’Harel-Yoon.
Segons Ramiro Illanes, hi ha una gran ignorància per part de la població pel que fa a la
ciència en general i considera que cal més informació bàsica que doni suport i permeti
entendre el perfil clínic d’aquestes malalties. Així mateix, ens comenta un dels beneficis
que aporten els OGM a la investigació, permetre simular les característiques clíniques
d'una malaltia o altra sense comprometre la salut d'una persona.
Figura 44: Ramiro Illanes Vicioso, estudiant de

doctorat; Font:
https://www.ibmb.csic.es/en/staff-member/r
amiro-illanes-vicioso/
86
9. CONCLUSIONS
Amb l’elaboració d’aquest treball de recerca he assolit i donat resposta a tots els
objectius plantejats a l’inici del treball. Les conclusions es concreten de la manera
següent:
He pogut ampliar els meus coneixements sobre l’enginyeria genètica i els OGM i he
comprès la relació que hi ha entre l’enginyeria genètica i la investigació de determinades
malalties rares donant resposta i demostrant-ho en el marc teòric d’aquest treball amb
l’explicació dels diferents conceptes, eines i tècniques. He iniciat el treball sense cap
coneixement i el finalitzo amb molts i cadascun dels conceptes que s’han esmentat
durant tot aquest.
Parlant dels beneficis i de la millora que ens aporten els OGM a la investigació de
determinades malalties rares, si ens basem en l’anàlisi de la informació d'articles
científics, notícies, l’entrevista feta a Ramiro Illanes Vicioso i la realització d’una pràctica
acompanyada per personal professional, podem pensar que sí que ens aporten notables
beneficis, ja que han tingut un gran impacte en el coneixement envers les investigacions
d’avui dia. Un exemple serien els ratolins modificats, gràcies a aquests s'ha aconseguit
estudiar amb detall la majoria d'alteracions pigmentàries i visuals associades a
l'albinisme.
Pel que fa a la part pràctica, l’objectiu de l'obtenció d'un OGM treballant amb diferents
tècniques de l'enginyeria genètica s'ha dut a terme al laboratori de Biologia Estructural.
Puc concloure que ha estat un experiment exitós perquè en finalitzar l’estada s’ha
obtingut com a resultat un bacteri (E.Coli) modificat genèticament treballant amb
diverses tècniques de l’enginyeria genètica com són: la PCR, la digestió enzimàtica, la
lligació, la transformació cel·lular i la PCR d’una sola colònia (Colony PCR). Dins
d’aquestes tècniques s’ha dut a terme un seguit de processos bàsics de laboratori com
són l’electroforesi i la purificació, els quals m’han anat mostrant els resultats de
cadascuna de les tècniques.
87
He comprovat que la PCR ha funcionat correctament, el que suposa que hem aconseguit
amplificar el nostre gen d’interès sense dificultat. A més, el fet d’haver realitzat tres
mostres per comprovar i observar la millor m’ha permès triar la mostra amb la qual
després realitzar els següents processos.
Per tal de confirmar que la digestió enzimàtica, la lligació i la transformació s’han dut a
terme correctament, la solució que ha quedat en acabar aquests processos s’ha hagut
d’estendre per tota una placa de petri de medi LB amb l’antibiòtic kanamicina, incubar
durant 15 hores aproximadament i dur a terme una Colony PCR. Després de tots aquests
procediments ha demostrat que el gen d’interès que havíem amplificat amb la PCR s'ha
inserit a l’interior del plasmidi correctament per posteriorment, dur a terme la
producció de proteïnes recombinants per a la investigació de malalties rares.
El fet de tenir l’oportunitat de viure aquesta meravellosa experiència, m’ha permès

l’ampliació del meu coneixement sobre cadascun dels estris i aparells que s’han utilitzat
durant tot el procediment, començar a tenir ja contacte amb el món universitari i
professional, els quals m’han proporcionat una perspectiva de com funciona el món de la
recerca i de la investigació que abans no tenia. I sobretot, prendre consciència del
treball i la implicació que també requereix treballar en l’àmbit d’investigació i que
realment la ciència cada dia avança més.
Com a últim objectiu, he utilitzat el mètode científic per a la redacció del disseny
experimental demostrant-ho en la part pràctica.
Abans d’endinsar-me en el món de l’enginyeria genètica i abans de trepitjar un

laboratori considerava que estudiar els OGM, des de microorganismes fins a plantes i
animals, no era pas complicat. Finalitzada la recerca he pogut concloure que tota la
tecnologia que hi ha darrere dels OGM és molt potent i molt complexa.
88
10. BIBLIOGRAFIA I WEBGRAFIA
BIBLIOGRAFIA
Llibre Biología molecular e ingeniería genética. 2.ª edición. Conceptos, técnicas y

aplicaciones en ciencias de la salud; Autor: Ángel Herráez.
Llibre “Convivint amb transgènics”; Autor: David Bueno i Torrens.
Llibre “Biología Molecular, Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud”,

Segunda Edición; Autors: Salazar, Sandoval, Armendáriz.
Llibre B2 (BIOLOGIA) BATXILLERAT. Editorial Vicens Vives, 2016.

Taula 17: Bibliografia de la recerca; Font: Elaboració pròpia.
WEBGRAFIA
Raco.cat. 2022. [online] Available at:

<https://raco.cat/index.php/TreballsSCBiologia/article/download/72031/396344/>
[Accessed 6 July 2022].
https://raco.cat/index.php/TreballsSCBiologia/article/download/72031/396344/
Enciclopedia.cat. 2022. enginyeria genètica | enciclopedia.cat. [online] Available at:

<https://www.enciclopedia.cat/gran-enciclopedia-catalana/enginyeria-genetica>
https://www.enciclopedia.cat/gran-enciclopedia-catalana/enginyeria-genetica
Termcat.cat. 2022. enginyeria genètica - Diccionari de bioètica | TERMCAT. [online]

Available at:
<https://www.termcat.cat/es/diccionaris-en-linia/271/fitxa/MzIxMjk1OQ%3D%3D>
https://www.termcat.cat/es/diccionaris-en-linia/271/fitxa/MzIxMjk1OQ%3D%3D
2022. [online] Available at:

<https://www.mheducation.es/bcv/guide/capitulo/8448171888.pdf> [Accessed 6 July
2022].
https://www.mheducation.es/bcv/guide/capitulo/8448171888.pdf
genètica, B. and Pineda, C., 2022. Biotecnologia i enginyeria genètica. [online]

Cn-tec.blogspot.com. Available at:
<https://cn-tec.blogspot.com/2020/04/biotecnologia-i-enginyeria-genetica.html>
https://cn-tec.blogspot.com/2020/04/biotecnologia-i-enginyeria-genetica.html
89
Inicio | fundación José Ortíz Avila (no date). Available at:

https://fundacionortizavila.com/descargar/345/5c9401d5648d2eff799dab1cb3789c1b
(Accessed: July 9, 2022).
https://fundacionortizavila.com/descargar/345/5c9401d5648d2eff799dab1cb3789c1b
Tesisenred.net. 2022. [online] Available at:

<https://www.tesisenred.net/bitstream/handle/10803/77950/RPB_TESI.pdf?seque
nce=1&isAllowed=y> [Accessed 12 July 2022].
https://www.tesisenred.net/bitstream/handle/10803/77950/RPB_TESI.pdf?sequen
ce=1&isAllowed=y
Khan Academy. 2022. Las enzimas de restricción y la ADN ligasa (artículo) | Khan
Academy. [online] Available at:
<https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-clonin
g-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase> [Accessed 16 July 2022].
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning
-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
Raco.cat. 2022. [online] Available at:

<https://raco.cat/index.php/RevistaSociologia/article/download/14876/303125>
https://raco.cat/index.php/RevistaSociologia/article/download/14876/303125
Centro de Biotecnología. 2022. Biotecnología moderna. [online] Available at:

<https://www.centrobiotecnologia.cl/general/biotecnologia-moderna/> [Accessed
17 July 2022].
https://www.centrobiotecnologia.cl/general/biotecnologia-moderna/
Iberdrola. 2022. ¿Qué es la Biotecnología? Tipos y Aplicaciones - Iberdrola. [online]

Available at:
<https://www.iberdrola.com/innovacion/que-es-la-biotecnologia> [Accessed 17 July
2022].
https://www.iberdrola.com/innovacion/que-es-la-biotecnologia
Sites.google.com. 2022. historia de la ingeniería genética - ingenieria genética. [online]

Available at:
<https://sites.google.com/site/ingenieriagenetica4esob/historia-de-la-ingenieria-g
enetica> [Accessed 21 July 2022].
https://sites.google.com/site/ingenieriagenetica4esob/historia-de-la-ingenieria-ge
netica

<https://www.studocu.com/ca-es/document/universitat-de-barcelona/enginyeria-
genetica/tema-5-tipus-de-vectors/2403017> [Accessed 24 July 2022].
90
https://www.studocu.com/ca-es/document/universitat-de-barcelona/enginyeria-g
enetica/tema-5-tipus-de-vectors/2403017

<https://www.studocu.com/ca-es/document/institut-deducacio-secundaria-darge
ntona/biologia/enginyeria-genetica/26629904> [Accessed 24 July 2022].
https://www.studocu.com/ca-es/document/institut-deducacio-secundaria-dargent
ona/biologia/enginyeria-genetica/26629904
Miteco.gob.es. 2022. [online] Available at:

<https://www.miteco.gob.es/es/calidad-y-evaluacion-ambiental/temas/biotecnolog
ia/preguntasfrecuentesomg2_tcm30-189175.pdf> [Accessed 30 July 2022].
https://www.miteco.gob.es/es/calidad-y-evaluacion-ambiental/temas/biotecnologi
a/preguntasfrecuentesomg2_tcm30-189175.pdf
RESERVADOS, I., 2022. Orphanet: B�squeda de una enfermedad. [online] Orpha.net.

Available at:
<https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search.php?lng=ES&data_id=2584
9> [Accessed 1 August 2022].
https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search.php?lng=ES&data_id=25849
Omim.org. 2022. Entry - #617183 - HAREL-YOON SYNDROME; HAYOS - OMIM.

[online] Available at:
<https://omim.org/entry/617183?search=S%C3%ADndrome%20de%20Harel-Yoon&h
ighlight=%22harel%20yoon%22%20de%20harelyoon%20sindrome> [Accessed 1
August 2022].
https://omim.org/entry/617183?search=S%C3%ADndrome%20de%20Harel-Yoon&hi
ghlight=%22harel%20yoon%22%20de%20harelyoon%20sindrome
Genome.gov. 2022. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) | NHGRI. [online]

Available at:
<https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polime
rasa> [Accessed 4 August 2022].
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polimer
asa
Capítulo 13: Electroforesis (no date) AccessMedicina. Available at:

https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?sectionid=124155760
(Accessed: August 12, 2022).
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1803&sectionid=124155
760
91
AllScience. 2022. ¿Qué son las Enzimas de Restricción, para qué se usan y qué función
desempeñan en la naturaleza?. [online] Available at:
<https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/que-son-las-enzimas-de-restriccio
n-para-que-se-usan-y-que-funcion-desempenan-en-la-naturaleza> [Accessed 12
August 2022].
https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/que-son-las-enzimas-de-restriccion
-para-que-se-usan-y-que-funcion-desempenan-en-la-naturaleza
Cómo solucionar problemas de Clonación Basada en enzimas de restricción (no date)

GoldBio. Available at:
https://goldbio.com/articles/article/solucionar-problemas-clonacion-basada-enzim
as-restriccion (Accessed: August 12, 2022).
https://goldbio.com/articles/article/solucionar-problemas-clonacion-basada-enzim
as-restriccion
WPD.UGR.ES (no date). Available at:

https://wpd.ugr.es/~rnavajas/wordpress/wp-content/uploads/2017/03/manual_pr
act_GII.pdf (Accessed: August 13, 2022).
https://wpd.ugr.es/~rnavajas/wordpress/wp-content/uploads/2017/03/manual_pr
act_GII.pdf
Dr. Fernando Tuya | www.fernandotuya.org (no date). Available at:

http://fernandotuya.org/wp-content/uploads/2010/10/digestion-DNA.pdf
http://fernandotuya.org/wp-content/uploads/2010/10/digestion-DNA.pdf
(no date) LabXchange. Available at:

https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:783397ff:lx_simulation:1
L’edició Genòmica (no date). Available at:

https://www.iec.cat/activitats/documents/edicio_genomica_i_el_seu_impacte.pdf
https://www.iec.cat/activitats/documents/edicio_genomica_i_el_seu_impacte.pdf
Ara.cat (2018) Organismes modificats Genèticament Al Súper, Ara.cat. Ara.cat.

Available at:
https://www.ara.cat/ciencia-medi-ambient/organismes-modificats-geneticament-al
-super_1_2759985.html (Accessed: August 17, 2022).
https://www.ara.cat/ciencia-medi-ambient/organismes-modificats-geneticament-al
-super_1_2759985.html
92
Someicca (no date) Someicca , SOMEICCA. Available at:

https://someicca.com.mx/organismos-geneticamente-modificados-ogm/ (Accessed:
August 18, 2022).
https://someicca.com.mx/organismos-geneticamente-modificados-ogm/
Nucleospin Gel and PCR clean-up user manual - Takara Bio (no date). Available at:
https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/NucleoSpin%20Gel%20an
d%20PCR%20Clean/NucleoSpin%20Gel%20and%20PCR%20Clean-up%20User%20M
anual_Rev_04.pdf (Accessed: August 20, 2022).
https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/NucleoSpin%20Gel%20an
d%20PCR%20Clean/NucleoSpin%20Gel%20and%20PCR%20Clean-up%20User%20M
anual_Rev_04.pdf
Recipients a pressió (III). mesures preventives de Seguretat. (no date). Available at:
https://www.uab.cat/doc/seguretat (Accessed: September 17, 2022).
https://www.uab.cat/doc/Doc_seguretat_LAB_CA
Acerca de la PCR - inmunojmvucv.files.wordpress.com (no date). Available at:

https://inmunojmvucv.files.wordpress.com/2020/01/acerca-de-la-pcr.pdf
(Accessed: October 2, 2022).
https://inmunojmvucv.files.wordpress.com/2020/01/acerca-de-la-pcr.pdf
UCV, I.J.M.V. (2020) Práctica 3: Reacción en Cadena de La Polimerasa (PCR),

inmunojmvucv. Available at:
https://inmunojmvucv.wordpress.com/2020/01/28/practica-3-reaccion-en-cadena
-de-la-polimerasa-pcr-2/ (Accessed: October 10, 2022).
https://inmunojmvucv.wordpress.com/2020/01/28/practica-3-reaccion-en-cadena
-de-la-polimerasa-pcr-2/
Ub (no date) Se Descubre Cómo el Gen 'ywhaz' es capaz de alterar el desarrollo

neuronal, Universitat de Barcelona. Available at:
https://www.ub.edu/web/ub/es/menu_eines/noticies/2022/05/016.html
(Accessed: December 5, 2022).
Admin (2019) Tratamiento Efectivo del lupus en un modelo en Ratón Mediante Linfocitos
Modificados Genéticamente - Fundación Mencía, Fundación Mencía - Otro sitio
realizado con WordPress. Available at:
https://www.fundacionmencia.org/tratamiento-efectivo-del-lupus-en-un-modelo-e
n-raton-mediante-linfocitos-modificados-geneticamente/ (Accessed: December 5,
2022).
93
Admin (2019) Nueva Terapia Génica con crispr para el Envejecimiento Acelerado -
Fundación Mencía, Fundación Mencía - Otro sitio realizado con WordPress. Available at:
https://www.fundacionmencia.org/nueva-terapia-genica-con-crispr-para-el-enveje
cimiento-acelerado/ (Accessed: December 5, 2022).
Nombre* et al. (2019) Medicamentos derivados de Animales Transgénicos, Gen-Ética.

Available at:
https://montoliu.naukas.com/2016/02/07/medicamentos-derivados-de-animales-tr
ansgenicos/ (Accessed: December 5, 2022).
(no date) ¿Que es el albinismo? (Alba, 2018). Texto de Lluis Montoliu. Fotografias de Ana
Yturralde. Patrocinado por Alba y ciberer. Available at:
http://wwwuser.cnb.csic.es/~albino/queeselalbinismo/investigacion.html (Accessed:
December 6, 2022).
Taula 18: Webgrafia de la recerca; Font: Elaboració pròpia.
94
11. ANNEXOS
11.1. ANNEX 1: conceptes bàsics relatius a nivell de laboratori.

Master Mix (MM): barreja de tots els components per després poder dividir la solució
en diferents mostres.
Referència o patró: barreja d'ADN de diferents longituds per després comparar la mida
que s’espera amb aquesta, i assegurar que ha funcionat correctament la PCR.
Colorant SYBR: component capaç d'unir-se a l'ADN.
Ràtio molar: quantitat de molècules d’inserit que hi ha per una molècula de plasmidi.
Medi LB (lysogeny broth): medi nutritiu emprat per al creixement bacterià.
Sobrenedant: líquid que queda sobre un sediment o precipitat després de ser produïda
la sedimentació.
LB kanamicina: antibiòtic que s’encarrega de fer créixer només aquells bacteris als
quals s’ha inserit el plasmidi tancat.
Soca: és una població de microorganismes d'una sola espècie descendents d'una única
cèl·lula o que provenen d'una determinada mostra en particular, la que usualment és
propagada clonalment, a causa de l'interès en la conservació de les qualitats definitòries.
Pinta de l’electroforesi: genera els buits per poder introduir la mostra una vegada
estigui gelificat.
Absorbància: és una mesura de la radiació que absorbeix una substància quan sobre
aquesta incideix les ones electromagnètiques, generalment a la regió visible d'una
determinada longitud d'ona.
95
11.2. ANNEX 2: entrevista a Ramiro Illanes Vicioso, estudiant de

doctorat en biologia estructural.
Data: 19/09/2022
1. Et sembla correcte el rumb que està prenent l’enginyeria genètica?

Sí que em sembla correcte el rumb adaptat considerant els avenços que s'han
donat en els últims 50 anys tenint en compte com són de jove els camps com
l'enginyeria genètica o la bioquímica.
2. A quina línia de recerca et centres?

La meva línia de recerca és la Biologia Estructural.
3. Quin és l’objectiu de les investigacions del teu equip?

Ens centrem a resoldre l'estructura secundària i tridimensional de proteïnes
mitocondrials implicades en el desenvolupament de malalties rares.
4. Com creus que avança la investigació de proteïnes mitocondrials humanes

implicades en el desenvolupament de malalties rares?
Hi ha molts estudis a nivell d'organismes model i cribratge de famílies on
s'observa un component hereditari determinant, però considero que cal més
investigació bàsica que doni suport i permeti entendre el perfil clínic d'aquestes
malalties.
5. Creus que aquest tema (proteïnes mitocondrials humanes implicades en el

desenvolupament de malalties rares) no preocupa prou a la població? Per què?
No és que hi hagi poca preocupació pel que fa a aquest tema, considero que hi ha
una gran ignorància per part de la població pel que fa a la ciència en general. És
inevitable que els primers involucrats en aquesta temàtica siguin investigadors,
personal sanitari i les famílies que passen per aquest tipus de situacions. Tot i
així, crec que caldria fer gran èmfasi general amb vista a incentivar la curiositat
per la ciència i el desenvolupament del pensament crític.
96
6. Quins interessos i factors van ser els causants de l’interès a treballar en la

biologia estructural de proteïnes essencials per a la viabilitat dels mitocondris
i dels patògens?
El fet que el mitocondri tingui el seu propi ADN, i s'heretin principalment per via
materna, suposa tot un món de possibilitats pel que fa a entendre com funciona
la comunicació entre aquesta i el nucli cel·lular per al correcte desenvolupament
cel·lular i, finalment, el desenvolupament de l'individu.
7. Quins avantatges creus que comporta treballar amb organismes genèticament

modificats?
La dificultat de la metodologia varia en funció de l'organisme amb què es treballi
però, al cap i a la fi, fa possible una versatilitat experimental de la qual abans no
es disposava. Concretament, permet simular les característiques clíniques d'una
o altra malaltia sense comprometre la salut d'una persona.
8. Creus que es podria considerar “humà” espècies alterades que contenen gens
humans? Per què?
No, perquè el fet que ens desenvolupem com a éssers humans implica la
presència de tot el nostre genoma, que les cèl·lules disposin de les eines
moleculars necessàries per desxifrar aquesta informació i l'ambient fisiològic en
què ens trobem durant el nostre desenvolupament.
9. Personalment, com consideres l’impacte de l’enginyeria genètica en funció de

la humanitat? per què?
Ho considero positiu perquè permet avançar cap a una millor qualitat de vida.
10. Per quina raó has decidit treballar amb aquesta malaltia rara provocada per
mutacions a la proteïna ATAD3A?
El projecte em sembla un repte per la dificultat i la complexitat, és el que més
m'apassiona de la ciència.
97
11. Què ens podries dir sobre la proteïna ATAD3A?

Se sap poc sobre aquesta proteïna, ja que segons quina mutació o alteració
tridimensional es genera un perfil patològic o un altre, és el que s'anomena un
“calaix de sastre”.
12. Amb quines altres proteïnes mitocondrials humanes implicades en el

desenvolupament de malalties rares heu o esteu treballant avui dia
Principalment amb ATAD3A.
13. Quin paper hi juga l’estudi de les estructures de proteïnes?

Conèixer l'estructura d'una proteïna i la seva composició aminoacídica permet
entendre'n el funcionament molecular, i això és clau per comprendre el
funcionament de la xarxa de proteïnes que podem trobar en una cèl·lula.
14. Generalment, de quina manera purifiqueu una proteïna?

Ens servim de marcadors d'afinitat i propietats fisicoquímiques intrínseques de la
proteïna d'interès per poder-la aïllar de la resta del contingut cel·lular.
15. A l'enginyeria genètica hi ha diferents tècniques, quines creus que són les més
emprades? Quines són les més comunes al teu equip?
Les més emprades al nostre equip amb la PCR (polymerase chain reaction), doble
digestió enzimàtica i lligació.
16. En quin moment vas decidir dedicar-te a la biologia estructural i com has
arribat a on estàs (experiència)?
La meva curiositat per la Biologia Estructural va començar durant la secundària
quan vam estudiar les principals macromolècules biològiques, sempre em va
cridar l'atenció aquesta relació estructura-funció que fa possible la vida.
17. A part d’Espanya, on més has realitzat estudis i investigacions? És certa

aquesta importància que se li dona al fet d’investigar a l’estranger?
He estat diverses vegades a Grenoble (França) per anàlisi de mostres, però no he
fet una estada com a tal. Des del meu punt de vista, la importància d'investigar a
98
l'estranger rau en la formació de noves xarxes de contactes i tràfec d'informació,

no podem oblidar que el gran objectiu de la Ciència és entendre el món que ens
envolta i forma, poder transmetre aquesta informació a tota la població i millorar
la qualitat de vida de la nostra societat. Malauradament, i al meu entendre, la
Ciència ha estat, i continua sent, un àmbit força elitista en què et consideren
millor científic com més hagis estat fora, i això no sempre és així.
18. Com a investigador, entenc que dediques una gran quantitat d’hores de treball,
et resulta difícil compaginar la vida laboral amb la vida personal?
Treballar en investigació és molt sacrificat i exigent, un sap quan entra al
laboratori, però no quan en surt. A més, hi ha el fet d'haver de venir a treballar
alguns caps de setmana, i que les hores extres no es paguen perquè es
consideren “activitat intrínseca de l'investigador”. Això és una cosa que no està
regulada per res, i hauria de canviar radicalment. Així que sí, és força complicat
l'equilibri vida-treball, però un també ha d'aprendre a respectar la seva vida
personal.
99
11.3. ANNEX 3: Pòster Científic.

Finalitzada la recerca, he decidit realitzar aquest pòster científic per tal d’ampliar els
meus coneixements envers les diferents aplicacions i programes. I a més, trobar una
manera molt més senzilla d’interpretar el procediment de l’obtenció d’un OGM.
El meu objectiu ha estat imprimir-lo en DIN A0 i mostrar tot el procediment i els
coneixements que he pogut adquirir durant tot el treball.
Figura 45: Pòster científic dels Organismes Genèticament Modificats; Font: Elaboració pròpia.
https://docs.google.com/presentation/d/1Nwa-nrq_-1X59zcTeWGyYLpJtdjfjSpTKkvtHtrc4_Y/ed
it#slide=id.p
WEBGRAFIA D’IMATGES
Imatges del procediment de la producció d’una proteïna recombinant; Font: Khan
Academy.
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tu
torial/a/bacterial-transformation-selection
100
Imatge de la síndrome d’Harel-Yoon; Font: Europe PMC.

https://europepmc.org/article/med/27640307
Imatge del bacteri E.Coli; Font: Laboratorio Gedysa

https://www.laboratoriogedysa.com/bacteria-escherichia-coli/
La resta de les imatges exposades a l’apartat d’experimentació són elaboracions pròpies

realitzades durant l’estada al laboratori.
101

53enfermetats Rares

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

53enfermetats Rares

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Treball de Recerca 2n Batxillerat

A continuació, m’agradaria agrair la increïble oportunitat que em va oferir el programa

El bloque práctico está principalmente centrado en la obtención de un Organismo

Palabras clave: Biotecnología, ingeniería genética, OGM, enzimas de restricción, ADN

The practical block is mainly focused on obtaining a Genetically Modified Organism

Keywords: Biotechnology, genetic engineering, GMO, restriction enzymes, DNA ligase,

Anys més tard he tingut l’oportunitat de participar en el programa BATX2LAB, impulsat

Amb l’elaboració d’aquest treball s’hi marquen els següents objectius:

● Ampliar els meus coneixements sobre l’enginyeria genètica i els Organismes

● Comprendre la relació que hi ha entre l’enginyeria genètica i la investigació de

● Treballar amb diferents tècniques de l’enginyeria genètica per obtenir un OGM.

● Utilitzar el mètode científic per a la redacció del disseny experimental.

Pel que fa a l’estructura, consta de dos grans blocs: un de teòric i un de pràctic.

La funció principal del primer bloc és aprofundir en conceptes vinculats a la

D’altra banda, el segon bloc, de caire pràctic, pretén centrar-se en:

● L’obtenció d’un OGM a nivell de laboratori.

Generalment, la paraula biotecnologia s’utilitza de forma més restrictiva. En aquest

Aquest treball es focalitza en la “Biotecnologia Vermella”, també anomenada

○ Producció agroalimentària: Per a desenvolupar cultius i millorar collites i

○ Producció industrial: S'aplica a sectors com la cosmètica, l'alimentació, els

1.2. Breu perspectiva històrica

Un cop és descoberta l’estructura i el funcionament de l’ADN (Àcid Desoxiribonucleic),

● El balanç nutricional de certs aliments que consumim habitualment, fet que ha

● La capacitat productiva de les terres.

● El descobriment de nous medicaments per al tractament de diverses malalties i

● El desenvolupament de la bioremediació per al tractament de terres

● El desenvolupament de les biorefineries com un mitjà per crear nous tipus de

● El desenvolupament de pràctiques per al reciclatge de residus.

2.2. Principals eines i tècniques de l’enginyeria genètica

El descobriment dels enzims de restricció va facilitar l’estudi de l’ADN, ja que gràcies a

Tot i que hi ha centenars d’enzims de restricció diferents, tots funcionen essencialment

NOM: FUNCIÓ ESPECÍFICA:

Tallar els enllaços fosfodièster que

Tallar l’enllaç fosfodièster en nucleòtids

EXONUCLEASES: Tallar els enllaços dels nucleòtids que

Taula 1: Tipus d’enzims de restricció; Font: Elaboració pròpia

Els enzims de restricció es classifiquen en 4 grans categories:

● Enzims de tipus I: tallen l’ADN en llocs distants de la seqüència de

● Enzims de tipus II: tallen l’ADN dins o prop de la seqüència de reconeixement.

● Enzims de tipus III: tallen l’ADN prop de les seqüències de reconeixement.

● Enzims de tipus IV: escinda l’ADN metilat. Aquestes no es consideren

ENDONUCLEASES DE RESTRICCIÓ MÉS COMUNES

Enzim: Microorganisme del qual Seqüència de

EcoRI Escherichia coli. 5’ -GAATTC-3’

HindIII Haemophilus aegyptius. 5’ -AAGCTT-3’

BamHI Bacillus amyloliquefaciens. 5’ -GGATCC-3’

SmaI Serratia marcercens. 5’ -CCCGGG-3’

monocatenaris, això facilita la seva interacció amb un altre extrem monocatenari

Figura 2: Extrems cohesius produïts per enzims de restricció; Font: GoldBio

● Els extrems roms es generen quan el tall de l’enzim es produeix de forma

Figura 3: Extrems roms produïts per enzims de restricció; Font: GoldBio

● Vectors de clonació: tenen com a finalitat l'emmagatzematge de seqüències i

Figura 4: Components del vector de clonació; Font:

● Vectors d’expressió: s’utilitzen per a produir una proteïna recombinant i

Figura 5: Components del vector d’expressió; Font:

Figura 6: Parasexualitat en bacteris: la transformació; Font: adn-dna

● La reacció en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction).

a) Reacció en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction)

comercial: taq polimerasa. L’elevada temperatura provoca la desnaturalització i

Figura 7: Reacció en cadena de la polimerasa (PCR); Font:

b) La tecnologia de l’ADN recombinant

1) Les endonucleases reconeixen la seqüència diana en el plasmidi vector i a

2) Digestió enzimàtica: es produeix el tall en el plasmidi i a l’inserit, el que causa