1

Els cultius cel·lulars tenen lloc als LABORATORIS DE CULTIUS CEL·LULARS.

LABORATORI DE CULTIUS CEL·LULARS: Creixement de cèl·lules eucariotes en medis
artificials i en condicions controlades.

Cultiu cel.lular (un altra definició): resultat del creixement in vitro de cèl.lules
obtingudes d’organismes multicel·lulars.

2
3
Podem diferenciar 3 tipus de cultius: cultiu d’òrgans (1), cultiu d’explants(2) i cultiu
de cèl.lules(3)

4
Cultiu de pell

CULTIUS D’ÒRGANS: El cultiu d’un òrgan es basa en mantenir un òrgan sencer o part
d’ell en un medi de cultiu artificial i una atmosfera controlada.
Ex. Cultius de ganglis, de pell, de fragments hepàtics, etc.

Aquests cultius estan vius durant un temps limitat. No poden propagar-se.

Únicament es produeix creixement d'algunes cèl·lules diferenciades o
embrionàries presents en els teixits que no conserven l'estructura tissular
típica de l'òrgan.

L’òrgan es posa sobre una reixeta i entra en contacte amb el medi de cultiu, d’on
obté nutrients i elimina substàncies de rebuig.
En aquests cultius no hi ha propagació, la gran part de les cèl·lules no creixen.
Només ho fan algunes cèl·lules indiferenciades o embrionàries, sobretot de la zona
perifèrica de del teixit.
Serveixen per fer estudis d’interaccions i relacions intracel·lulars, estudis
regeneratius, respostes d’òrgans a estímuls. Un cop s’acaba l’estudi i es vol
començar un altre, es necessita un òrgan nou.
Es col·loca l'òrgan sobre una reixeta (entra en contacte amb el medi de
cultiu) situada en la interfase líquid-gas d'un mitjà del qual obté els

5
nutrients i al qual pot alliberar les deixalles. Aquest tipus de cultiu permet
mantenir, almenys en part, l'arquitectura característica del teixit “in vivo”.
Es conserven les interaccions histològiques i, gràcies a això, aquest tipus
de cultiu permet mantenir els tipus cel·lulars diferenciats, per la qual cosa
representen una bona rèplica del teixit d'origen. No obstant això, no
creixen molt (la proliferación cel·lular es limita a les cèl·lules embrionàries
de la perifèria) i no es poden propagar. Es necessita un nou explant per a
cada experiment el que suposa molt més treball i una limitada
reproducibilidad de la mostra. Quantificar és difícil i la quantitat de
material que es pot conrear és reduïda.

5
CULTIUS D’EXPLANTS: Són cultius de teixits vius o d’explants (teixit viu extret del
seu òrgan). Ex. Teixits epitelials, vellositats coriòniques.
Consisteixen en adherir un fragment del teixit a la superfície d’una placa o una
ampolla de cultiu i nodrir-lo amb un medi de cultiu.
En aquestes condicions les cèl·lules perifèriques de del teixit es multipliquen migrant
a la superfície del suport.

6
7
CULTIUS DE CÈL·LULES:.
Es fan a partir de mostres de: sang perifèrica, líquid amniòtic, teixits, restes ovulars,
cèl·lules mare, cèl·lules hematopoiètiques.
S’agafen suspensions cel·lulars, que es posen en un flascó de cultiu amb un medi de
cultiu i s’incuben en les condicions òptimes per que es divideixin

condicions adequades de temperatura i humitat

8
Cultiu cel·lular primari 🡪 la suspensió cel·lular de partida s'obté
disgregant les cèl·lules d'un teixit per mètodes mecànics o enzimàtics.
D'aquesta manera s'obté una mescla cel·lular complexa formada pels
diferents tipus cel·lulars presents en el teixit. El cultiu primari es pot
realitzar a partir d'aquesta mescla o seleccionant un tipus cel·lular
concret.

Cultiu cel·lular secundari 🡪 La suspensió cel·lular de partida s'obté a

partir d'un cultiu primari o d'un altre secundari, mitjançant un subcultiu o
‘pase'. També es pot obtenir a partir d'una línia cel·lular mantinguda en
congelació.

Alerta! *Un grup de cèl·lules amb un mateix origen, estructura i funció

constitueixen un mateix tipus cel·lular. En el procés de disgregació d'un
òrgan o teixit s'obtenen diferents tipus cel·lulars.

celulas crecerán hasta que no quepan en la placa

9
10
CITOTOXICITAT: Tòxic per les cèl·lules. Substàncies químiques o cèl·lules immunes.
CARCINOGÈNESIS: Procés pel qual una cèl·lula normal es transforma en una cèl·lula
cancerígena. Canvis en el material genètic de les cèl·lules que fan que les cèl·lules es
reprodueixin de manera descontrolada i formin una massa maligna.
MUTAGÈNESIS: Mutacions sobre el ADN. Estudis de mutacions provocades per
agents químics tòxics.

11
12
La teràpia gènica es pot definir com una tècnica terapèutica mitjançant la
qual s'insereix un gen funcional en les cèl·lules d'un pacient per a corregir
un defecte genètic causant d'una patologia.

13
En l'actualitat es proposa per a gairebé qualsevol malaltia.

14
15
16
modificació genètica dins del cos del pacient.
El gen que volem introduir s'introdueix a un liposoma, a traves respiracció entra,
arriba celules.

INVIVO: dins del pacient

17
gen funcional s’introdueix a les cèl·lules fora del pacient.

EXVIVO: fora del pacient

18
19
Temes:
- selecció d’embrions
- xenotransplantaments
- teràpia gènica
Ho apunten abans de l’explicació i després afegeixen més coses.

20
21
22
23
24
25
Els cultius de cèl·lules, en funció de la suspensió cel·lular poden ser: PRIMARIS O
SECUNDARIS.

CULTIU CEL·LULAR PRIMARI: S'obté una suspensió cel·lular a partir de la disgregació

de cèl·lules d’un teixit per mètodes mecànics o enzimàtics.
Obtenim una barreja de cèl·lules complexa, que conté diferents tipus cel·lulars del
teixit. Puc fer un cultiu de la barreja o seleccionar les cèl·lules que m’interessen.

CULTIU CEL·LULAR SECUNDARI: S’obté de la suspensió cel·lular del cultiu primari

mitjançant subcultius o passes. També a partir de línies cel·lulars conservades en
congelació.

Al tercer o quart pase/subcultiu puc obtenir un cultiu estable i homogeni amb un

únic tipus cel·lular. És el que denominarem LÍNIA CEL·LULAR.

26
Una vegada que a les cèl·lules en suspensió se'ls afegeix el medi de cultiu,
s'introdueixen en un recipient adequat (flascó de cultiu) i s'incuben en
condicions òptimes de temperatura i humitat, les cèl·lules comencen a
créixer.
La dinàmica de creixement d'un cultiu, és a dir, la concentració de
cèl·lules pels diez d'evolució del cultiu, es representa gràficament
mitjançant una corba de creixement.

FASE DE LATÈNCIA: En aquesta fase no hi ha creixement. El nº de cèl·lules es manté.

Dura aproximadament 24h d’evolució del cultiu. hi ha una petita mort de les
cèl·lules
FASE DE CREIXEMENT EXPONENCIAL: Augment del pendent de la recta, per tant és
la fase en què el nº de cèl·lules augmenta exponencialment fins arribar al màxim.
Dura aproximadament de 6-7 dies.
FASE ESTACIONÀRIA: La corba s’aplana i el nº de cèl·lules roman constant. Es dóna a
partir dels 8 dies. continuen vives per sense dividir-se.
FASE DE MORT: moren quan deixen de tenir nutrients.

El punt de la corba per fer un SUBCULTIU O PASE, és entre el final de la fase

exponencial i l’inici de la fase estacionària.

27
28
29
DIA 9. les cèl·lules es van multiplicant. El dia 1 hi ha 1 cel. , el dia 2 hi han 2 cel, dia 3
hi han 4 cel,….. fins al dia 10 esta plena
9 meitat de plena → es duplica → placa plena

30
El creixement en monocapa consisteix en el fet que les cèl·lules creixen
adherides sobre una superfície sòlida (plàstic o vidre). Les cèl·lules
necesiten adherir-se a una superficie sólida per poder creixer.

FASES:
• ADHESIÓ A LA SUPERFÍCIE: En aquesta fase les cèl·lules creixen adherides sobre
la superfície sòlida del suport (plàstic o vidre).
• PROLIFERACIÓ I FORMACIÓ DE COLÒNIES: Un cop enganxades a la superfície del
flascó o placa, comencen a créixer i ocupar tota la superfície.
• INHIBICIÓ PER CONTACTE: Finalment les cèl·lules ocupen tota la superfície del
suport en el que estan creixent i estableixen contactes entre elles. Arriba un punt
en que no poden establir més contactes i es produeix la INHIBICIÓ PER
CONTACTE. Les cèl·lules paren de dividir-se però continuen vives.

Perquè les cèl·lules reprenguin el seu creixement es necessita fer

un subcultiu o 'passi' de part de les cèl·lules a un nou flascó de cultiu. El
moment idoni per a realitzar-lo és el final de la fase exponencial.

No tots el tipus cel·lulars tenen la mateixa facilitat per créixer en un cultiu. En

general, els cultius són més fàcil de cultivar quan les cèl·lules són més
indiferenciades, és a dir, quan les cèl·lules tenen més capacitat de dividir-se o
diferenciar-se en altres cèl·lules.

31
Molts tipus de cèl·lules perden les característiques de diferenciació quan es cultiven.
Aquesta pèrdua de propietats i funcions pot ser causada per la desdiferenciació o
adaptació a les noves condicions generades pel medi, molt diferents a les condicions
fisiològiques tissulars.

31
• ADAPTACIÓ AL MEDI: Període curt de temps en que les cèl·lules s’adapten al
medi i a les condicions del cultiu, abans de començar a proliferar.
• PROLIFERACIÓ EN SUSPENSIÓ: Un cop adaptades, les cèl·lules disperses al medi
de cultiu comencen a créixer de manera exponencial.
• INHIBICIÓ PER DENSITAT: Les cèl·lules s’han estat dividint, i arriben a un nº molt
elevat en relació amb l’espai i els nutrients del medi de cultiu. S’adonen que no
poden obtenir més nutrients del medi i paren de dividir-se, però segueixen vives.
ES DEIXEN DE DIVIDIR PERQUÈ ELS FALTEN NUTRIENTS.

Igual que en els cultius en monocapa, és necessari fer un ‘pase’ perquè el

creixement es reprengui

32
LÍNIA CEL·LULAR PRIMÀRIA: La població cel·lular augmenta en cada pase (cada cop
hi ha més frascons de cultiu). Les cèl·lules s’estabilitzen a partir del 3r pase: cèl·lules
uniformes, homogènies i mantenen característiques morfològiques i fisiològiques
durant les següents generacions. Si totes les cèl·lules venen d’un mateix teixit, pot
passar que les cèl·lules amb major creixement impedeixin el creixement de la resta.

33
Les línies cel·lulars primàries tenen una vida finita, és a dir, es mantenen
en creixement durant un nombre determinat de generacions o passades,
característic de cada tipus cel·lular (sol oscil·lar entre 20 i 100) i després
entren en la denominada fase de senescència.

Es pot conservar una línia cel·lular primària congelant cèl·lules abans

d'aconseguir la senescència i , si pot ser, en els primers pases.

En qualsevol cas, cal anotar sempre el número de passada del qual

procedeixen les cèl·lules congelades per a saber en tot moment
aproximadament quants passades els queden abans que el cultiu mori.

34
35
Les línies cel·lulars contínues són aquelles que s'obtenen a partir d'un
cultiu primari i que es mantenen en cultiu per temps il·limitat mitjançant
passades seriades.

Aquestes línies apareixen espontàniament en alguns cultius, que es

mantenen durant més passades dels esperats, Això és degut a l'aparició
en cultiu de cèl·lules immortals, capaces d'originar línies estables i
permanents.
Apareixen a conseqüència d'un fenomen de transformació de les cèl·lules
normals, relacionat amb la pèrdua dels mecanismes de control cel·lular.
les cèl·lules transformades tenen unes característiques especials:
• Creixen indefinidament en cultiu (són immortals)
• Perden la dependència de l'ancoratge per a créixer pel que poden
créixer en suspensió
• Perden la inhibició per contacte
• Poden envair teixits i produir tumors
• Acumulen anomalies genètiques. Normalment són aneuploides, amb
múltiples aberracions cromosòmiques

36
37
38
39
40
Cultius cel·lulars de mostres: vellositats corials, restes ovulars, moll de l’ós, ganglis i
teixits.

Podem diferenciar 3 tipus de cultius:

CULTIUS D’ÒRGANS: El cultiu d’un òrgan es basa en mantenir un òrgan sencer o un

trosset d’ell, en un medi de cultiu artificial i una atmosfera controlada. Ex. Cultius de
ganglis, de pell, de moll de l’ós, de fragments hepàtics.
Aquests cultius estan vius durant un temps limitat. També els diferents tipus de
cèl·lules que els composen, la estructura de teixits i l’arquitectura de l’òrgan.
L’òrgan es posa sobre una reixeta i entra en contacte amb el medi de cultiu, d’on
obté nutrients i elimina substàncies de rebuig.
En aquests cultius no hi ha propagació, la gran part de les cèl·lules no creixen.
Només ho fan algunes cèl·lules indiferenciades o embrionàries, sobretot de la zona
perifèrica de del teixit.
Serveixen per fer estudis d’interaccions i relacions intracel·lulars, estudis
regeneratius, respostes dels òrgans a estímuls. Un cop s’acaba l’estudi i es vol
començar un altres, es necessita un òrgan nou.

CULTIUS D’EXPLANTS: Són cultius de teixits vius o d’explants (teixit viu extret del
seu òrgan). Ex. Teixits epitelials, vellositats coriòniques.

41
Consisteixen en adherir un fragment del teixit a la superfície d’una placa o una
ampolla de cultiu i nodrir-lo amb un medi de cultiu.
En aquestes condicions les cèl·lules perifèriques de del teixit es multipliquen migrant
a la superfície del suport.

CULTIUS DE CÈL·LULES: Són els cultius més habituals i amb els que nosaltres
treballarem.
Es fan a partir de mostres de: sang perifèrica, líquid amniòtic, teixits, restes ovulars,
cèl·lules mare, cèl·lules hematopoiètiques.
S’agafen suspensions cel·lulars, que es posen en un flascó de cultiu amb un medi de
cultiu i s’incuben en les condicions òptimes per que es divideixin.

41
42
44
Veure activitat en grup

45
Veure activitat en grup

46
Veure activitat en grup

47
Veure activitat en grup

48
Veure activitat en grup.
Els aminoàcids esencials són aquells que el organismes no poden sintetitzar per si
mateixos. Són 9: fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
treonina, triptòfan i valina. Els medis de cultiu cel·lular han d’incloure en la seva
composició aquests aminoàcids, perquè les cèl·lules puguin sintetitzar proteïnes.
Alguns medis més complets, afegeixen aminoàcids que són esencials només per
alguns tipus cel·lulars, com arginina, cisteïna i tirosina.

49
Veure activitat en grup.

50
Veure activitat en grup.

51
52
1. DISGREGACIÓ CEL·LULAR: Es pot realitzar per dos mètodes. MECÀNIC I
ENZIMÀTIC.
• Mecànic: Es col·loca la mostra de teixit, sobre una membrana de niló o metàl·lica
amb porus grans (ens permetrà que les cèl·lules passin a través dels porus).
S’aixafa el teixit suaument i es col·loca la membrana dintre la placa de petri.
Rentem la membrana amb tampó o medi de cultiu, de manera que sobre la
membrana queden les restes del teixit aixafat. Les cèl·lules passen a la placa a
través dels porus i queden suspeses en el medi de cultiu o tampó.
• Enzimàtic (basat en tripsinització): Consisteix en fer un tractament del teixit amb
un enzim, que és tripsina, la qual digereix les proteïnes de la matriu extracel·lular,
trencant la unió entre les cèl·lules i alliberant-les. La tripsina pot combinar-se amb
EDTA.
• Col·locar el teixit a disgregar en una placa de petri amb PBS fred i picar-lo
amb el bisturí el màxim possible.
• Passar el teixit picat a un tub falcon de 15ml i afegir solució de tripsina-
EDTA.
• Incubar de 30-60 minuts, depenent del gruix del teixit.
• Afegir medi de cultiu amb sèrum fetal boví i antibiòtic.
• Pipetejar energèticament 20-30 vegades.
• Deixar reposar fins que es formi un PELLET i eliminar el sobrenedant amb
una pipeta.

53
 • Afegir nou medi de cultiu i resuspendre el pellet.
• Centrifugar i descartar el sobrenedant.
• Resuspendre les cèl·lules en medi de cultiu nou.

Després de la primera etapa, obtenim un suspensió de cèl·lules complexa, a partir

de les quals volem obtenir un cultiu primari. Molts cops és necessari seleccionar un
tipus cel·lular.

2. RECOMPTE I VIABILITAT CEL·LULAR: Un cop obtinguda la suspensió cel·lular

inicial, es essencial conèixer la densitat cel·lular, és a dir el nº de cèl·lules/ml. A més
s’ha de comprovar la viabilitat d’aquestes cèl·lules, és a dir, confirmar que estan
vives. Aquests dos processos es realitzen de forma simultània diluint les cèl·lules
amb un colorant vital (tripan blue) i contant-les amb una cambra (Cambra de
Neubauer).

3. INICI DEL CULTIU O SEMBRA: Un cop s’ha determinat el recompte i viabilitat

cel·lulars, iniciem el nostre cultiu cel·lular sembrant un nº determinat de cèl·lules.
Treballar sempre en campana de flux laminar.
• Primer cal escollir el recipient en que s’ha de fer el cultiu cel·lular.
• En funció del recipient, establir el nº de cèl·lules que es volen sembrar
inicialment.
• Fer recompte de les cèl·lules viables de la suspensió.
• Transferir un volum de cèl·lules desitjat a un tub falcon i rentar-les amb
medi de cultiu atemperat a 37ºC (el medi de cultiu estava congelat).
• Introduir el volum de medi i cèl·lules al recipient escollit per fer el cultiu.
• Col·locar el recipient de cultiu en un incubador a 37ºC amb un 5% de CO2 i
95% d’humitat.

4. MANTENIMENT DEL CULTIU CEL·LULAR: Els cultius cel·lulars un cop iniciats, s’han
de mantenir realitzant diverses operacions, per poder fer estudis genètics.

• CONTROL PERIÒDIC DEL CULTIU AMB EL MICROSCOPI: Els cultius de

cèl·lules es van controlant cada 1-3 dies aproximadament. Es retiren de
l’incubador i s’examinen amb el microscopi invertit per observar
l'aparença i creixement de les cèl·lules. Així controlem la fase exponencial
abans d’entrar en fase estacionària.

• CANVI DE MEDI DE CULTIU: És el manteniment més freqüent, per renovar

els nutrients que gasten les cèl·lules i retirar les substàncies de rebuig
generats pel metabolisme cel·lular. Aquest procediment es fa cada 2-3

53
 dies i quan s’observi un canvi de color del medi (vira l’indicador de pH). Es
canvien uns 2/3 del volum del medi, per conservar substàncies
beneficioses pels cultius produïdes i secretades per les cèl·lules. En cultius
monocapa es retira el medi amb una pipeta i es substitueix per una de
nou. En cultius de cèl·lules en suspensió, es centrifuga el cultiu i es retira
el sobrenedant, afegint medi de cultiu nou.

• SUBCULTIU O PASE: Als 7-8 dies de creixement. Els cultius cel·lulars

entren en fase estacionària i es necessari que fem un pase si volem
mantenir el cultiu. En cultius monocapa, aquest procediment és necessari
per desenganxar les cèl·lules de la superfície del recipient.
Es fa mitjançant TRIPSINITZACIÓ, procediment per desenganxar les
cèl·lules mitjançant una solució de TRIPSINA/EDTA. La tripsina digereix les
proteïnes responsables de la unió de les cèl·lules a la superfície i entre elles.
L’EDTA retira cations de Calci que estabilitzen la interacció cèl·lula substrat.
▪ Retirar tot el medi de cultiu.
▪ Rentar la monocapa amb una solució de PBS+EDTA.
▪ Incubar la monocapa amb una solució de Tripsina-EDTA.
▪ Afegir un volum 4-5 cops més gran que el de tripsina, de medi de
cultiu nou complet (amb sèrum animal). El sèrum animal conté un
inhibidor de la tripsina, pel qual para la tripsinització.
▪ Pipetejar diverses vegades el medi de cultiu per tot el recipient
amb força per acabar de desenganxar les cèl·lules de la superfície.
Així obtenim una suspensió cel·lular sense agregats.
▪ Fer un recompte de cèl·lules viables.
▪ Calcular el factor de dilució necessari per fer subcultius en
recipients nous.
▪ Preparar tants recipients estèrils com sigui necessari per
subcultivar i el medi de cultiu nou a afegir.
▪ Repartir les cèl·lules rentades en els diferents recipients en la
proporció que hem calculat.
▪ Incubar els subcultius al incubador.

En un cultiu de cèl·lules en suspensió, es realitza un recompte de cèl·lules

viables i es calcula el factor de dilució necessari perquè la densitat cel·lular
sigui adequada per reiniciar el creixement.

5. CONSERVACIÓ DE CÈL·LULES: Un cop tenim cèl·lules aïllades, les volem mantenir

en congelació per fer diversos estudis. El procediment a seguir és el següent:

53
 • Rentem la suspensió cel·lular amb medi de cultiu i fer un recompte de
cèl·lules viables, per determinar quantes cèl·lules posarem en cada
criotub.
• Retirar el medi de cultiu per centrifugació i substituir-lo per un volum
adequat de sèrum animal amb DMSO (crioprotector).
• Aliquotar en criotubs.
• Congelar progressivament a -20ºC, -80ºC i nitrogen líquid indefinidament.

6. DESCONGELACIÓ DE CÈL·LULES: Mireu el video de descongelació de cèl·lules

Hela.
En aquest cas ens serveixen per iniciar un cultiu cel·lular a partir d’una línia cel·lular
congelada en nitrogen líquid.
• Treure el criotub del congelador i posar-lo en un bany termostàtic a 37ºC.
• Netejar la superfície del vial amb etanol 70ºC per prevenir
contaminacions.
• Transferir les cèl·lules del vial al tub falcon de 15ml i afegir medi de cultiu
complet.
• Centrifugar 3-4 min per treure restes del crioprotector.
• Eliminar el sobrenedant amb DMSO.
• Afegir medi de cultiu nou complet.
• Iniciar el cultiu cel·lular.

53
1. DISGREGACIÓ CEL·LULAR: Es pot realitzar per dos mètodes. MECÀNIC I
ENZIMÀTIC.
• Mecànic: Es col·loca la mostra de teixit, sobre una membrana de niló o metàl·lica
amb porus grans (ens permetrà que les cèl·lules passin a través dels porus).
S’aixafa el teixit suaument i es col·loca la membrana dintre la placa de petri.
Rentem la membrana amb tampó o medi de cultiu, de manera que sobre la
membrana queden les restes del teixit aixafat. Les cèl·lules passen a la placa a
través dels porus i queden suspeses en el medi de cultiu o tampó.
• Enzimàtic (basat en tripsinització): Consisteix en fer un tractament del teixit amb
un enzim, que és tripsina, la qual digereix les proteïnes de la matriu extracel·lular,
trencant la unió entre les cèl·lules i alliberant-les. La tripsina pot combinar-se amb
EDTA.
• Col·locar el teixit a disgregar en una placa de petri amb PBS fred i picar-lo
amb el bisturí el màxim possible.
• Passar el teixit picat a un tub falcon de 15ml i afegir solució de tripsina-
EDTA.
• Incubar de 30-60 minuts, depenent del gruix del teixit.
• Afegir medi de cultiu amb sèrum fetal boví i antibiòtic.
• Pipetejar energèticament 20-30 vegades.
• Deixar reposar fins que es formi un PELLET i eliminar el sobrenedant amb
una pipeta.

54
 • Afegir nou medi de cultiu i resuspendre el pellet.
• Centrifugar i descartar el sobrenedant.
• Resuspendre les cèl·lules en medi de cultiu nou.

Després de la primera etapa, obtenim un suspensió de cèl·lules complexa, a partir

de les quals volem obtenir un cultiu primari. Molts cops és necessari seleccionar un
tipus cel·lular.

2. RECOMPTE I VIABILITAT CEL·LULAR: Un cop obtinguda la suspensió cel·lular

inicial, es essencial conèixer la densitat cel·lular, és a dir el nº de cèl·lules/ml. A més
s’ha de comprovar la viabilitat d’aquestes cèl·lules, és a dir, confirmar que estan
vives. Aquests dos processos es realitzen de forma simultània diluint les cèl·lules
amb un colorant vital (tripan blue) i contant-les amb una cambra (Cambra de
Neubauer).

3. INICI DEL CULTIU O SEMBRA: Un cop s’ha determinat el recompte i viabilitat

cel·lulars, iniciem el nostre cultiu cel·lular sembrant un nº determinat de cèl·lules.
Treballar sempre en campana de flux laminar.
• Primer cal escollir el recipient en que s’ha de fer el cultiu cel·lular.
• En funció del recipient, establir el nº de cèl·lules que es volen sembrar
inicialment.
• Fer recompte de les cèl·lules viables de la suspensió.
• Transferir un volum de cèl·lules desitjat a un tub falcon i rentar-les amb
medi de cultiu atemperat a 37ºC (el medi de cultiu estava congelat).
• Introduir el volum de medi i cèl·lules al recipient escollit per fer el cultiu.
• Col·locar el recipient de cultiu en un incubador a 37ºC amb un 5% de CO2 i
95% d’humitat.

4. MANTENIMENT DEL CULTIU CEL·LULAR: Els cultius cel·lulars un cop iniciats, s’han
de mantenir realitzant diverses operacions, per poder fer estudis genètics.

• CONTROL PERIÒDIC DEL CULTIU AMB EL MICROSCOPI: Els cultius de

cèl·lules es van controlant cada 1-3 dies aproximadament. Es retiren de
l’incubador i s’examinen amb el microscopi invertit per observar
l'aparença i creixement de les cèl·lules. Així controlem la fase exponencial
abans d’entrar en fase estacionària.

• CANVI DE MEDI DE CULTIU: És el manteniment més freqüent, per renovar

els nutrients que gasten les cèl·lules i retirar les substàncies de rebuig
generats pel metabolisme cel·lular. Aquest procediment es fa cada 2-3

54
 dies i quan s’observi un canvi de color del medi (vira l’indicador de pH). Es
canvien uns 2/3 del volum del medi, per conservar substàncies
beneficioses pels cultius produïdes i secretades per les cèl·lules. En cultius
monocapa es retira el medi amb una pipeta i es substitueix per una de
nou. En cultius de cèl·lules en suspensió, es centrifuga el cultiu i es retira
el sobrenedant, afegint medi de cultiu nou.

• SUBCULTIU O PASE: Als 7-8 dies de creixement. Els cultius cel·lulars

entren en fase estacionària i es necessari que fem un pase si volem
mantenir el cultiu. En cultius monocapa, aquest procediment és necessari
per desenganxar les cèl·lules de la superfície del recipient.
Es fa mitjançant TRIPSINITZACIÓ, procediment per desenganxar les
cèl·lules mitjançant una solució de TRIPSINA/EDTA. La tripsina digereix les
proteïnes responsables de la unió de les cèl·lules a la superfície i entre elles.
L’EDTA retira cations de Calci que estabilitzen la interacció cèl·lula substrat.
▪ Retirar tot el medi de cultiu.
▪ Rentar la monocapa amb una solució de PBS+EDTA.
▪ Incubar la monocapa amb una solució de Tripsina-EDTA.
▪ Afegir un volum 4-5 cops més gran que el de tripsina, de medi de
cultiu nou complet (amb sèrum animal). El sèrum animal conté un
inhibidor de la tripsina, pel qual para la tripsinització.
▪ Pipetejar diverses vegades el medi de cultiu per tot el recipient
amb força per acabar de desenganxar les cèl·lules de la superfície.
Així obtenim una suspensió cel·lular sense agregats.
▪ Fer un recompte de cèl·lules viables.
▪ Calcular el factor de dilució necessari per fer subcultius en
recipients nous.
▪ Preparar tants recipients estèrils com sigui necessari per
subcultivar i el medi de cultiu nou a afegir.
▪ Repartir les cèl·lules rentades en els diferents recipients en la
proporció que hem calculat.
▪ Incubar els subcultius al incubador.

En un cultiu de cèl·lules en suspensió, es realitza un recompte de cèl·lules

viables i es calcula el factor de dilució necessari perquè la densitat cel·lular
sigui adequada per reiniciar el creixement.

5. CONSERVACIÓ DE CÈL·LULES: Un cop tenim cèl·lules aïllades, les volem mantenir

en congelació per fer diversos estudis. El procediment a seguir és el següent:

54
 • Rentem la suspensió cel·lular amb medi de cultiu i fer un recompte de
cèl·lules viables, per determinar quantes cèl·lules posarem en cada
criotub.
• Retirar el medi de cultiu per centrifugació i substituir-lo per un volum
adequat de sèrum animal amb DMSO (crioprotector).
• Aliquotar en criotubs.
• Congelar progressivament a -20ºC, -80ºC i nitrogen líquid indefinidament.

6. DESCONGELACIÓ DE CÈL·LULES: Mireu el video de descongelació de cèl·lules

Hela.
En aquest cas ens serveixen per iniciar un cultiu cel·lular a partir d’una línia cel·lular
congelada en nitrogen líquid.
• Treure el criotub del congelador i posar-lo en un bany termostàtic a 37ºC.
• Netejar la superfície del vial amb etanol 70ºC per prevenir
contaminacions.
• Transferir les cèl·lules del vial al tub falcon de 15ml i afegir medi de cultiu
complet.
• Centrifugar 3-4 min per treure restes del crioprotector.
• Eliminar el sobrenedant amb DMSO.
• Afegir medi de cultiu nou complet.
• Iniciar el cultiu cel·lular.

54
55
En alguns casos es poden esterilitzar els cultius per eliminar-los.

56
Si tenim un cultiu contaminat, cal aïllar-lo ràpidament de la resta i esterilitzar-lo.

57