Introducció als cultius cel·lulars

TÈCNIQUES DE CULTIUS CEL·LULARS

1. INTRODUCCIÓ
Un cultiu cel·lular és el conjunt de tècniques que permeten el manteniment de les cèl·lules in vitro, intentant conservar al màxim
les seves propietats fisiològiques, bioquímiques i genètiques. En general, quan parlem de cultius cel·lulars fem referència a cultius
de cèl·lules eucariotes animals.

Té múltiples aplicacions diferents. Moltes àrees de la investigació biomèdica (bàsica i aplicada), industrial i fins i tot agronòmiques
de plantes amb interès comercial.

El cultiu de teixits es va desenvolupar a partir dels últims anys del segle XIX com una continuació a les tècniques de l’embriologia.
Durant molt temps, es va considerar com una barreja de ciència i art.

Inicialment va ser considerada com una tècnica particularment difícil d'aprendre. No obstant això, avui dia aquestes dificultats
estan superades gràcies a factors com els mitjans de composició definida, la disponibilitat d'antibiòtics, les instal·lacions asèptiques
(sales de cultiu netes, cabines de flux laminar, incubadors estèrils, etc), dispositius de cultiu (ampolles amb taps filtrants, plaques
de Petri ventilades).

- Roux (1885): mantenir cèl·lules embrió de pollastre en solució salina.

- Harrison (1907): cultiu de medul.la espinal embrionària d’amfibis. Iniciador dels cultius de teixits animal.

- La primera limitació per a l'establiment de cultius era aconseguir un mitjà nutritiu adequat. Burrows (1910) va emprar
plasma de pollastre per a nodrir els explants de teixits embrionaris de pollastre.

- Rous i Jones (1916) van emprar per primera vegada extractes enriquits en tripsina per a dissociar les cèl·lules d'embrions
de pollastre, establint el primer cultiu cel·lular. Es van desenvolupar nombrosos mètodes de manipulació en condicions
d'asèpsia que encara avui dia s'utilitzen..

- 1920-1940: pocs avenços ... problema: contaminacions i
dificultats per mantenir condicions estèrils.
- 1948 Sanford i col.: aïllament de cèl·lules de línia cel·lular
L929. Van demostrar que perquè una cèl·lula
arribi a dividir-se necessita ser alimentada amb els
nutrients correctes
- 1950 Dulbecco: tripsina com agent disgregador
₋ 1961 Hayflick: ús d’antibiòtics anti-microbians.
₋ 1965 Ham: introdueix el medi lliure de sèrum
que permet mantenir algunes cèl·lules de
mamífer en cultiu indefinidament.
₋ 1969 Augusti / Sacco: primera línia cel·lular
estable (diferenciada) de neuroblastoma.

- 1952 Gry i col.: primera línia cel.lular estable HeLa ₋ 1975 Kohler / Milstein: primera línia cel·lular
(Henrietta Lacks) productora d’anticossos monoclonal.

- 1954 Levi-Montalcini: estableixen el factor de creixement

nerviós ₋ 1976 Sato: Requeriment de barreges
d’hormones i factors de creixement en medis de
- 1955 Eagle: definició de requeriments nutricionals de les cultiu.
cèl·lules en cultiu.

Les cèl·lules HeLa van ser les primeres cèl·lules humanes cultivades en un laboratori. Derivada d’un carcinoma d’úter de la pacient
Henrietta LLacks. Actualment hi ha moltes línies cel·lulars humanes, però les HeLa continuen sent les més famoses.

Algunes de les seves principals aplicacions han estat:

 Desenvolupament de la vacuna contra  Investigació general contra la SIDA.

la poliomielitis.
 Experiments en cosmètica.
  Desenvolupament de la vacuna contra el papil·loma
humà.
 Viatges a l’espai per comprovar que passa a gravetat
zero.
Actualment:
Cultius de línies Cultius primaris i/o Biotecnologia de teixits
cel·lulars immortals especialitzats
(diferenciats)
Avantatges
 Permeten un control precís i fi del medi ambient
(factors fisicoquímics (pH, temperatura) i fisiològics
(hormones, factors de creixement). Per algunes línies
cel·lulars s’han establert medis definits.
Un medi definit es aquell el qual es coneixen tots els
components que ho formen i la seva concentració
exacta.
 Caracterització i homogeneïtat de la mostra. Una
mostra de teixit és sempre heterogènia. No obstant
això, al cap d'un o dos passis, les línies cel·lulars
conreades són homogènies, és a dir, la seva
morfologia i la seva composició són uniformes.
 Economia. Estalvi econòmic en ús de reactius i
drogues.
En els cultius cel·lulars s'empren dissolucions amb
una concentració molt de menor que en el cas de
l'animal complet. A més, es garanteix l'accés directe
de la substància a les cèl·lules sense que es dilueixi i
sense que sofreixi cap mena de modificació
metabòlica. El cost dels assajos clínics es redueix
considerablement i es pot fer un major nombre de
proves.
 Desenvolupament de mapes genòmics
 Investigació general contra el càncer.
Cèl·lules mare com a iPS (induced
precursors Pluripotent Stem Cells)
indiferenciats
Inconvenients
 Tècnica sensible (contaminants). Cal experiència i
treballar en condicions estrictes d’asèpsia perquè el
seu creixement és molt més lent que el dels
contaminants més habituals (fongs, llevats, bacteris,
micoplasmes, etc.).
A més, les cèl·lules animals són incapaços de
mantenir-se vives en absència de la complexa mescla
de nutrients present en el plasma o en el fluid
intersticial. Tot això condiciona en gran manera
l'instrumental requerit i el grau de preparació del
personal encarregat dels cultius.
 Quantitat i cost. Produir 1 gram de cèl·lules en cultiu
costa 10 vegades menys que obtenir-les a partir del
teixit d'un animal. En un laboratori normal es poden
aconseguir fins a 10 grams de cèl·lules sense que es
ressenti molt el pressupost de recerca.
Per a produir fins a 100 grams de cèl·lules cal
incrementar tant l'instrumental com el personal. Per
a produir quantitats majors es necessiten
instal·lacions de tipus industrial.
 Inestabilitat. Pot variar la composició al llarg de
generacions. Moltes línies cel·lulars contínues són
inestables i adopten una dotació cromosòmica
aneuploide, la qual cosa afecta tant la seva velocitat
 També es redueixen els costos relacionats amb la
fabricació del possible nou medicament: en lloc de
fabricar quantitats de l'ordre del gram (per a l'estudi
en animals) n'hi ha prou que se sintetitzin uns pocs
mil·ligrams.
 Motivacions ètiques. Reemplaçament de models in
vivo
de creixement com a la seva capacitat per a
diferenciar-se. És possible, per tant, trobar
diferències significatives en la línia cel·lular d'una
generació a la següent.
L'única manera d'evitar-ho és emprar línies estables
que es ressembren cada determinat temps o després
d'un determinat nombre de generacions a partir d'un
estoc congelat.

 Desdiferenciació i selecció. Inestabilitat genètica en

els cultius cel·lulars, perden les característiques
fenotípiques pròpies del teixit de procedència.

 Diferencies amb el model in vivo. Per tant, hem de

ser previnguts quant a la validesa dels resultats
obtinguts “in vitro ” perquè poden diferir del que
pugui observar-se “in vivo”.

 En realitat, un cultiu cel·lular es un disgregat cel·lular

d’un teixit i encara que són una bona aproximació,
presenten certes diferències amb el model in vivo:
₋ S'ha perdut l'organització espacial
tridimensional pròpia del teixit.

₋ S'han perdut les interaccions entre els diferents

tipus cel·lulars, i entre les cèl·lules i la matriu
extracel·lular.

₋ Manquen els components sistèmics implicats

en la regulació de l'homeòstasi in vivo,
especialment els sistemes nerviós i endocrí.

₋ Pressió parcial d’oxigen reduïda. L'energia

s'obté principalment a través de la glicòlisis, ja
que el cicle de Krebs juga un paper molt reduït.

1.1. TIPUS DE CULTIUS CEL·LULARS

Actualment s'entén per cultiu cel·lular al conjunt de tècniques que permeten el manteniment de les cèl·lules 'in vitro', mantenint
al màxim les seves propietats fisiològiques, bioquímiques i genètiques. Es distingeixen quatre tipus de cultiu cel·lular.

 Cultiu d’òrgans  Cultius cel·lulars dissociats:

 Explants primaris ₋ Cultiu cel·lular adherent o en monocapa.
 Cultius histotípics i organotípics ₋ Cultiu cel·lular en suspensió.
 A. Cultiu d’òrgans

Es col·loca l’òrgan sobre una reixa situada a la interfase líquid-gas en un medi del que obté els nutrients i
en el que es poden alliberar les substàncies de rebuig (no disgregació). Estructura tridimensional d’un
teixit no disgregat que es cultiva i que reté algunes o totes la característiques histològiques del teixit “in
vivo”.

₋ Permet mantenir l’arquitectura del teixit in vivo. Es conserven les interaccions i els tipus cel·lulars
diferenciats, representa bé el teixit d’origen.

₋ Creixement limitat (la proliferació cel·lular es limita a les cèl·lules embrionàries de la perifèria) i
no es poden propagar.

₋ Cal un nou explant a cada experiment (més treball i menys reproducibiltiat de la mostra).

B. Explants primaris

Es col·loca un fragment petit de teixit o òrgan en una interfase sòlid-líquid d’un suport de vidre o
plàstic.

₋ Les cèl·lules s’adhereixen a la superfície i les cèl·lules poden migrar i proliferar per la
superfície del suport.

₋ Es mantenen algunes funcions fisiològiques

₋ És útil per petites quantitats de teixit com biòpsies de pell. L’organització tissular es perd.

C. Cultius histotípics i organotípics

Els cultius histotípics són cultius d'un sol tipus cel·lular que aconsegueix aconseguir una elevada
densitat cel·lular (tal com ocorre en els teixits). Els cultius organotípics consten de diversos tipus
cel·lulars que interaccionen entre si d'una forma que intenta semblar-se el més possible a l'original.

L'objectiu final d'aquesta mena de cultius és la creació “in vitro” de teixits o òrgans completament
funcionals que puguin ser utilitzats en empelts o en trasplantaments. Els cultius organotípics
constitueixen la base d'una nova disciplina denominada enginyeria de teixits.

Es disgreguen cèl·lules d’un cultiu primari i es seleccionen i expandeixen en les condicions adequades
per tal de donar lloc a cultius cel·lulars que reprodueixin l’estructura dels òrgans. Es manté
parcialment l’estructura del teixit in vivo. Es poden propagar (de manera limitada).

₋ Diferents tipus: esferes, organoides,

multicapes tridimensionals, etc
 D. Cultiu cel·lular primari. Cultius cel·lulars dissociats.

És el tipus més utilitzat. Format per cèl·lules disperses disgregades d’un teixit viu o línia cel·lular disgregada.
La disgregació cel·lular es realitza per mètodes enzimàtics o mecànics. Les cèl·lules són capces de proliferar
i la població cel·lular creix notablement. En general hi sol haver un sol tipus cel·lular i són homogènies
genèticament.

Segons les condicions de creixement distingim:

₋ Cultiu cel·lular adherent o en monocapa. Cèl·lules dependents d’ancoratge. Creixen adherides a

un suport sòlid de plàstic o vidre. L'ancoratge al substrat és un prerequisit per a la proliferació
cel·lular. Ex: cèl·lules epitelials.

₋ Cultiu cel·lular en suspensió. Cèl·lules independents d’ancoratge. Creixen disperses en el medi de cultiu. Ex: cèl·lules
hematopoètiques.

1.2. ORIGEN, ESTABLIMENT I EVOLUCIÓ D’UN CULTIU CEL·LULAR

1. Cultiu cel·lular primari

Cultius cel·lulars obtinguts directament a partir de teixits normals o patològics
subcultiu mitjançant disgregació (mecànica o enzimàtica) o explants de teixits o òrgans.

2. Línia cel·lular primària o  Es poden obtenir mitjançant diferents mètodes.

finita
 Tot cultiu cel·lular s’inicia amb un cultiu primari.
Immortalització
 Heterogeneïtat (molts tipus cel·lulars diferents) i inestabilitat (canvis població cel·lular)

3. Línia cel·lular estable o

continua
Les cèl·lules del cultiu primari es van dividint i acaben ocupant tot el recipient (confluència). En aquest punt, cal trasplantar-les en
un altre suport de cultiu més diluïdes (subcultiu) --> Línia cel·lular primària.

Les cèl·lules del cultiu primari en monocapa es dispersen per mètodes enzimàtics i es passen a un nou flascó de cultiu. En el cas de
cèl·lules en suspensió, senzillament es dilueixen al mig fresc. Els successius cultius així formats es denominen una línia cel·lular. La
formació d'una línia cel·lular a partir d'un cultiu primari implica que:

₋ Augmenta el nombre de cèl·lules obtingudes

₋ Acaben predominant un o dos tipus cel·lulars: els que tenen major taxa de creixement.
₋ La població cel·lular es fa uniforme i homogènia
₋ Les seves característiques es conserven durant les successives generacions i, si es conserven en nitrogen líquid, de manera
indefinida

Línia cel·lular (cell line) vs soca cel·lular (cell strain):

 Línia cel·lular (cell line). Obtinguda després de subcultivar un cultiu primari. Amb els passes la població de cèl·lules es
torna més uniforme i homogènia (els tipus cel·lulars amb més capacitat de creixement acaben predominant) però hi
poden haver diversos llinatges cel·lulars de fenotips similars.
  Soca cel·lular (cell Strain). Obtinguda després de subcultivar un cultiu primari i seleccionar un dels llinatges cel·lulars per
clonatge, separació cel·lular física o qualsevol altre tècnica de selecció. Només conté un llinatge cel·lular.

Normalment, les línies cel·lulars tenen una vida finita que, segons el tipus de cèl·lula, es pot prolongar entre 20 i 100 generacions.
Superat aquest límit, les cèl·lules entren en una etapa que es denomina senescència en la qual perden la seva capacitat de proliferar
(suposadament per l'escurçament dels telòmers) i moren.

No obstant això, algunes cèl·lules (com les de rosegadors i les tumorals) eviten la senescència i donen lloc a línies cel·lulars
contínues, que creixen indefinidament. Aquestes cèl·lules poden sorgir de manera espontània (exposició a radiacions ionitzants o
a carcinògens químics) o induïda (infecció vírica o transfecció d'ADN) i són el resultat d'un canvi genotípic denominat transformació.

Els cultius i línies cel·lulars primàries tenen una capacitat de proliferació i expansió limitades, són finites

Línies cel·lulars: entre 20 i 100 generacions

Pèrdua de la capacitat de proliferar

LIMIT DE HAYFLICK: numero de vegades que una població de

cèl·lules humanes normals es dividirà abans de que es
detingui la divisió cel·lulars.

SENESCÈNCIA
REPLICATIVA

El rellotge cel·lular: la longitud dels telòmers

Els telòmers són repeticions de seqüències d'ADN i se situen en els extrems dels cromosomes. S'encarreguen de protegir els
cromosomes de possibles fusions i la seva degradació, garantint així la seva estabilitat i la de les cèl·lules. No obstant això, amb el
pas del temps els telòmers es van escurçant progressivament, associat a un procés de divisió cel·lular.

En concret és la telomerasa l'enzim encarregat de mantenir la longitud dels telòmers. No obstant això, les cèl·lules sanes a penes
produeixen telomerasa, de manera que els telòmers van escurçant-se progressivament fins a tenir una longitud molt curta, la qual
cosa desemboca en una mort cel·lular o senescència replicativa (parada cel·lular).

Per tant, la longitud telomérica és un biomarcador del

grau d'envelliment però també de salut en general,
podent servir per a estimar o mesurar l'edat biològica.

La telomerasa

És un complex format per proteïnes i ARN descobert inicialment en un protozou (Tetrahymena). Permet allargar els telòmers i
evitar la senescència replicativa.

Inactiu en la majoria de cèl·lules adultes. Les cèl·lules mare, durant el desenvolupament embrionari o en processos patològics com
el càncer aquesta pot activar-se.

Línia cel·lular estable o continua

Transformació
Línia cel·lular primària Línia cel·lular estable  Immortalització cel·lular (poder
il·limitat de proliferació i expansió)
 Selecció de les cèl·lules amb capacitat  Pèrdua inhibició per contacte
de sobreviure i proliferar.  Genèticament inestables
 Canvis genètics. (heteroploides i aberracions
 Canvis morfològics. cromosòmiques)
Les cèl·lules transformades es caracteritzen perquè:

 Són immortals: creixen indefinidament 

 El seu creixement és aberrant: es perd la inhibició

per contacte, la limitació de la densitat cel·lular
durant la proliferació i la dependència de
l'ancoratge.

 Són malignes: envaeixen teixits i donen lloc al

creixement de tumors

 Són genèticament inestables: són heteroploides

(varia el nombre de cromosomes) i presenten
aberracions cromosòmiques

En 1952 es va obtenir la primera línia cel·lular contínua humana. Són les denominades cèl·lules HeLa, cèl·lules extretes a partir
d'un tumor de coll de l'úter d'una pacient afroamericana que es deia Henrietta Lacks.

Com es produeix la transformació:

 De manera espontània (línies tumorals)

 Induïda per agents químics (generen mutacions)
 Induïda per radiacions (generen mutacions)
 Introducció i expressió d’un gen que confereix immortalitat (oncogen o hTERT)

Quan creixen en cultiu s'estableix una nova selecció: augmenten en número aquelles cèl·lules que tenen una major taxa de
creixement. Així doncs, cal considerar al cultiu com un ens dinàmic en el qual les proporcions relatives dels diferents elements que
el formen varien en el temps en funció de la pressió selectiva al fet que estiguin sotmesos. En general, quan s'aconsegueix la
confluència, les cèl·lules detenen el seu creixement, encara que poden existir tipus cel·lulars neoplàsics que continuen duplicant-
se fins a desplaçar als altres tipus cel·lulars del cultiu.

En aconseguir la confluència és quan moltes línies cel·lulars expressen els seus aspectes més característics. És en aquest estat quan
la seva morfologia i fisiologia són més semblants al seu estat original. És també el moment en el qual es deté el creixement i es fa
necessari dividir, replaquear o propagar les cèl·lules.

En els cultius primaris, les cèl·lules creixen durant un cert nombre de passades que depèn, sobretot, del tipus cel·lular i de les
condicions de cultiu. No obstant això, al final totes elles entren en una fase de senescència en la qual s'acumulen nombroses
anormalitats i es perden les funcions especialitzades, la qual cosa condueix a la mort del cultiu.

 Poder limitat o nul de proliferació

 Poder limitat o nul d’expansió

 Poder limitat o nul de proliferació (de 20 a 80 generacions segons el tipus)

 Poder limitat o nul d’expansió

 Poder il·limitat de proliferació

 Poder il·limitat d’expansió
Proliferació: capacitat d’una cèl·lula de dividir-se. Les línies cel·lulars
finites tenen proliferació limitada (20-80 generacions) mentre que les
línies cel·lulars estables il·limitada. Hi ha cèl·lules que tenen una taxa
de proliferació ràpida i d’altres més lenta.
Expansió: la capacitat d’augmentar el nombre de cèl·lules que hi ha en
un cultiu cel·lular. Per expandir un cultiu cel·lular cal que les cèl·lules
estiguin proliferant.
CULTIUS PRIMARIS VS LÍNIES CEL·LULARS ESTABLES
CULTIU PRIMARI
 Diploide
 No transformada
 Monocapa
 Taxa proliferació nul·la o lenta (48-96 hores)
 Fenotip proper al origen
 Cèl·lules obtingudes a partir de teixits animals.
 Mantenen les característiques de diferenciació
cel·lular pròpies del teixit in vivo
 Inicialment heterogeneïtat
 Si les cèl·lules es divideixen in vitro s’obté una linia
cel·lular primària
 Dificultat tècnica
2. SELECCIÓ DE LÍNIES CEL·LULARS
2.1. COM SELECCIONAR UNA LÍNIA CEL·LULARS
Per seleccionar una línia cel·lular cal considerar diversos paràmetres:
 Línia primària (finita) o estable (contínua). Les línies
cel·lulars estables són més fàcils de mantenir, creixen
més ràpid, es clonen més ràpid i tenen major
rendiment.
 Espècie. Les línies no humanes requereixen menys
permisos i és més accessible la obtenció del teixit
animal.
 Característiques de creixement: taxa de creixement
o divisió, eficiència de plaqueig, dificultat per cultivar,
creixement en monocapa o suspensió, etc.
 Disponibilitat. Cal comprovar si hi ha stocks
disponibles, sobretot si es tracta de línies cel·lulars
finites.
2.2. COM OBTENIR INFORMACIÓ SOBRE UNA LÍNIA CEL·LULAR
 Nom de la línia cel·lular  Quin tipus de cultiu és?
Com s’ha obtingut? Si és
 Tipus morfologia i una línia immortalitzada,
aspecte
LINIA CEL·LULAR ESTABLE
 Aneuploide (més inestabilitat cromosòmica)
 Monocapa o capes poliestratificades
 Taxa proliferació ràpida (12-24 hores)
 Variació fenotípica en relació al teixit d’origen i
possible pèrdua de característiques i marcadors
específics
 Creix contínuament
 S’obté a partir de cèl·lules tumorals o mitjançat la
manipulació genètica

 Validació. Està ben caracteritzada i autentificada la
línia cel·lular? Buscar informació i comprovar en
bases de dades que no estigui mal identificada.
 Requeriments específics per tenir-la en cultiu
 Expressió fenotípica. La línia cel·lular expressa les
característiques adequades?
 Línia cel·lular de control. Si es vol utilitzar un mutant
transfectat, transformat o una cèl·lula anormal,
existeix una línia equivalent “normal” que pugui ser
utilitzada com a control?
 Estabilitat. Com d’estable és la línia cel·lular? Ha
estat clonada? Si volguessis clonar-la, quan temps
tardaries?
 Cariotip  Temps de divisió
 Medi de cultiu i  Densitat de sembra i
requeriments especials freqüència de subcultiu
 com s’ha produït la
 Espècie i teixit d’origen transformació?  Condicions de  Nivell de bioseguretat
manteniment
 Adherent o en (temperatura, CO2, etc)  Preu
suspensió?

2.3. BASES DE DADES I BANCS DE LÍNIES CEL·LULARS

A. Bases de dades i bancs de línies cel·lulars

 ICLAC (International Cell Line Authentication Committee)

₋ https://iclac.org/
₋ Registre línies cel. mal identificades: https://iclac.org/databases/cross-contaminations/

 Cellosaurus: https://web.expasy.org/cellosaurus/
 ATCC (American Type Culture Collection): https://www.atcc.org/
 ECACC cell culture collection: http://www.hpacultures.org.uk/collections/ecacc.jsp
 DSMZ: https://www.dsmz.de/

B. Articles científics (on les hagin utilitzats)

 PubMed: http://www.ncbi.nlm.nih.g ov/pubmed

 Imagina’t que comences a treballar amb una línia cel·lular i buscant informació o quan comences a cultivar-les t’adones
que s’adhereixen poc a la superficie de la placa i s’aixequen amb facilitat. Què podries fer a l’hora de subcultivar-les? Com
podries incrementar la seva adhesió?

En determinats estudis o per cultivar determinats tipus cel·lulars cal realitzar recobriments (coatings) en els materials de cultiu
(ECM sintètica).

Recobriment o revestiment (o per la seva designació en anglès: coating) és un objecte que es torna a cobrir de substrat. En molts
casos són realitzats per millorar alguna(es) propietats o qualitats de la superfície del substrat, tals com aspecte, adhesió,
característiques de mullat, resistència a la corrosió, resistència al desgast, i resistència a les ratlladures entre moltes altres.

El coating pot ser de:

 Matrigel  Fibronectina  Col·lagen  Laminina  ECM

generada per
alters cèl·lules