6.

QUALITAT DE L’ADN PURIFICAT

Abans de continuar amb els vostres experiments, és important que, en aquest punt,
determineu si heu treballat correctament en els passos anteriors. Així doncs, cal que
comproveu la qualitat de la vostra mostra d’ADN purificat, ja que obtenir àcids nucleics de
bona qualitat és la clau per a realitzar diferents tècniques de biologia molecular, com PCR,
seqüenciacions, hibridacions, etc.

Per tal de comprovar la qualitat de l’ADN purificat, NO heu de gastar tota la vostra
mostra d’ADN purificat, ja que si la gasteu tota, no podreu avançar en els vostres
experiments. És per això que caldrà que agafeu només una petita quantitat de mostra i
que la resta la reserveu per experiments posteriors.

La qualitat dels àcids nucleics ve determinada per tres paràmetres:

- Integritat
- Concentració
- Puresa

Ompliu la taula següent:

Paràmetre Què permet determinar?

Integritat La integritat de l’ADN ens permet saber si a la nostra mostra tenim

una cadena o més d’una i com de llargues són.

Concentració Permet determinar la relació que hi ha entre la quantitat de solut i

la quantitat de dissolició o dissolvent

Puresa La puresa ens permet determinar si la mostrai conté altres

substàncies que no són DNA

INTEGRITAT

Responeu les preguntes següents:

- Com es diu la tècnica que et permet analitzar aquest paràmetre al laboratori?

Electroforèsi en gel d’agarosa

- En què consisteix aquesta tècnica i de quina manera us permet analitzar la

integritat?
Consisteix en aplicar un corrent a través d’un gel que conté la nostra mostra d’interés.
Llavors, segons la seva mida i càrrega les molècules es desplaçaran per el gel en les
diferents direccions i velocitats, de manera que aconseguim separar les unes de les
altres. Totes les molècules d’ADN tenen la mateixa capacitat de càrrega per massa. Degut
a això podem separar els fragments de DNA únicament per la seva mida. El DNA té
càrrega negativa per tant migrarà al pol positius de manera que la distància recorreguda
per cada fragment de DNA serà inversament proporcional al logaritme del seu pes
molecular. Amb aquesta tècnica podem observar quants fragments diferents de DNA
estan presents a la mostra i com de grans son respecte altres.

També podem determinar la mida absoluta d’un fragment de DNA examinant-lo juntament
a una escala estàndard (marcador o ladders) de fragments de mida coneguda.

- De quin material són els gels que heu de preparar per a dur a terme aquesta
tècnica?

Els gels que s’utilitzen per separar ADN estan fets d’un poliscàrid que normalment es
agarosa o poliacrilamida (no tant comú)

- De quina manera afecta la concentració d’aquests gels en els resultats que podreu
observar?
La concentració del gel d’agarosa afecta de manera que, a major concentració menor es
la mida dels fragments que se separen ja que com l’agarosa està molt concentrada a
l’ADN li costara més avançar.

- Per a què serveix el tampó que utilitzeu en aquesta tècnica?

El tampó que s’utilitza es per mantenir el pH del medi al voltant de 8. D’aquesta forma les
molècules de DNA migraran al pol positiu ja que a pHs superiors a 5 tenen càrrega
negativa.

- Què són els marcadors (o ladders, en anglès) i per a què serveixen?

Els marcadors o ladders son uns fragments de DNA de mida i pes coneguts que també
analitzar. Ens permet comparar els resultats de la mostra problema amb aquest i així
determinar el seu pes i mida.

Abans d’entrar en la interpretació de resultats, cal que domineu el llenguatge científic en

relació a aquesta tècnica:
- Què és un pou? Insereix una foto on se’n pugui observar un o més i assenyala’l amb
una fletxa.
Un pou (well en anglés) es cadascun dels “forats” on
ficarem les diferents mostres de DNA a analitzar.

POU

- Què és un carril? Insereix una foto on se’n pugui observar un o més i assenyala’l
amb una fletxa.
Un carril es cadascú del camí pel qual es mourà la nostra mostra en funció de la seva
massa i càrrega. Cada pou té el seu carril

carril

- Què és una banda? Insereix una foto on se’n pugui observar una o més i assenyala-
la amb una fletxa.
Les bandes corresponen a fregmanets de DNA de igual mida i
carrega.

banda

- Què vol dir que una banda sigui més gruixuda que una altra?
El gruix de les bandes ens indica la quantitat de fragments iguals de DNA que hi ha.

Ara sí que podeu passar a interpretar els resultats il·lustrats en les imatges següents.
Recordeu fer servir argot científic quan en feu la interpretació.
 Imatge 1 Imatge 2

Imatge 3 Imatge 4

Imatge Interpretació

1 Carril 1 amb el marcador, el carril 2 conté una única banda observem doncs
que el DNA té un alt nivell de integritat. Al carril 3 observem una espècie de
degradat (anomenat smear) això ens indica que la mostra esta una mica
contaminada, ja que correspon segurament a alguna proteïna. Al carril 3
observem el mateix degradat que al 4 però molt més gran això vol dir que hi ha
molta més contaminació proteica.

2 El carril “M” es el marcador, en aquest cas en els carrils 1, 2 i 3 veiem la

mateixa banda ben definida l’única diferència es que cada cop son més
gruixudes. Aquest fet ens indica que la concentració que tenim de DNA es
major

3 En aquesta tenim el carril “M” com a marcador. Els carrils 1 i 2 tenen un smear
 en tot el carril i no podem veure cap banda de manera que segurament tinguem
la mostra molt contaminada o en algun procés hem degradat el DNA (com per
exemple centrifugant). El carril 3 no trobem ni banda ni smear per tant o no hem
ficat res o la mostra que hem ficat no conté ADN.

4 El carril M conté el marcador. En el carril 1 podem observar tres bandes, una,

ben definida, mes a sota i les altres dos, no tan definides amb smear això vol
dir què tenem el dna que esta integrat a tres nivells. En el carril 2 veiem 2
bandes, la de sota molt ben marcada i gruixuda ( fet que reflecteix un gran grau
de concentració) i l’altre banda molt difusa una mica més a dalt. En les bandes
3, 4 i 5 podem veure una sola banda en la mateixa posició ben definides i
sense smear

- Què hi ha al carril anomenat M?

En el carril anomenat M hem introduït el nostre marcador

- Què volen dir els números que apareixen a l’esquerra de la imatge del gel?
Indiquen la quantitat de nucleotids que hi ha en aquelles bandes.

- Pregunta de HIGH LEVEL… us hi atreviu? Per què podríeu dir que la imatge 4 és
diferent a les altres 3? Què té de diferent? A quin moment de la investigació creieu
que correspon?
En les 3 primeres imatges podem veure que els fragments de DNA que es veuen a
l’electroforèsi són del voltant d’uns 7.000-7500 nt per tant podem parlar de que estem
comprovant que hem fet un bon procés de purificació del ADN. En canvi si ens fixem en la
imatge 4 ens donen unes bandes d’uns 350 nt, això ens indica que el que estem fent és
comprovar que hem realitzat una bona PCR, és a dir, hem fet còpies d’un gen específic.

- Pel que fa a la imatge 4, quina longitud diríeu que té la banda del carril número 4? I
les 3 bandes més intenses del carril 1?
La banda del carril numero 4 té una longitud d’uns 400 nt (nucleòtids) les tres bandes del
carril 1 uns 350 - 500 - 750 nt de baix a dalt

- Pel que fa a la imatge 4, quina és la diferència entre les 2 bandes del carril 2? Com
les observeu i què vol dir que les observeu així?
La banda de sota és veu més clarament pel fet que hi ha una major concentració d’àcids
nuclèics de la mateixa mida,en canvi, la banda de dalt es veu més difusa i amb una mica
d’smear per tant podem dir que no es troba tant concentrat

CONCENTRACIÓ

Abans de continuar, us serà d’ajut llegir el document: 6.1. Espectrometria d’absorció

molecular.
A continuació, responeu les preguntes següents:

- Com es diu l’aparell que et permet analitzar aquest paràmetre al laboratori?

Espectrofotometre.

- Com et permet aquest aparell determinar la concentració de la teva mostra d’ADN?

Primerament incidim un feix de llum (radiació) sobre la cubeta que conté la mostra. A partir
de la quantitat de llum que travessa la cubeta podem conèixer la quantitat de llum que ha
absorbit la mostra. Podem traspolar la quantitat de llum absorbida amb la concentració de
la mostra.

- A quants ng/ul equival 1 unitat d’absorbància en cada cas?

Unitats d’absorbància (uA) en funció del Equivalència en ng/ul (o ug/ml)

tipus d’àcid nucleic analitzat

1 uA ADNds 50 ug/ml

1 uA ADNss 33 ug/ml

1 uA ARN 40 ug/ml

- Quina informació proporciona l’absorbància a 320 nm?

Mesura la terbolesa de la solució, és a dir, la presència de partícules en suspensió.

- Exemple real. Un DNA genòmic purificat d’una mostra de sang es re-suspèn en

100µl de tampó. Per calcular la seva concentració el diluïm 1/50 en tampó.
L’absorbància de la dilució a 260 nm és de 0,326 i a 320 nm és de 0,006. Quina
quantitat de DNA genòmic teniu a la mostra inicial?

Restem la de 260nm (terbolesa + ADN) a la de 320 (terbolesa) per tenir absorbància de

ADN pur i apliquem factor de dilució 1/50.

0,326-0,006= 0,320nm //\\ 50ug/ml * 0,32 = ug/ml de ADN //\\ 16 ug/mL d’ADNds diluït
1/50

(16ug/ml x 50):1= 800ug/mL //\\ 800ug/mL * (1mL/1000uL) = 0,8ug/uL * 100uL = 80ug

PURESA

Responeu les preguntes següents:

- Com es diu l’aparell que et permet analitzar aquest paràmetre al laboratori?

Espectofotòmetre
 - Com et permet aquest aparell determinar la concentració de la teva mostra d’ADN?
Primerament incidim un feix de llum (radiació) sobre la cubeta que conté la mostra. A partir
de la quantitat de llum que travessa la cubeta podem conèixer la quantitat de llum que ha
absorbit la mostra. Podem traspolar la quantitat de llum absorbida amb la concentració de
la mostra.

- Quines són les longitud d’ona amb les que principalment treballareu? Quina
informació proporciona cada mesura?
Longitud d’ona (nm) Què es mesura amb aquesta longitud d’ona?

320 nm Terbolesa

260 nm Terbolesa + ADN

280 nm
Identificar les proteïnes contaminants

230 nm
Identificar els carbohidrats
Un cop obtinguts aquest paràmetres amb l’aparell que heu citat anteriorment, es duen a
terme una sèrie de càlculs que us permeten obtenir informació respecte la puresa de la
vostra mostra.

- Completeu la taula següent:

Àcid Quocient Quina informació Quins valors Què indiquen

nucleic entre proporciona aquest es poden aquests valors?
analitzat absorbàncies quocient? obtenir?

ADN A260 / A280 Entre 1,7 i 2 Grau de puresa

adequat

Entre 1,6-1,8 Puresa

acceptable.

> 2,1 Concentració

elevada d’ARN

ARN Entre 1,8 - 2,1 Grau de puresa

adequat

ADN i A260 / 230 Entre 1,5 i 2,2 Àcid nucleic és

ARN pur

< 1,5 Contaminació

amb carbohidrats,
fenol i sals

http://www.fundacio.udl.cat/biobancos/doc/talleres/Controles_de_calidad_de_acidos_nucleic
os_congreso_Rosa_Pinto.pdf
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS
%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf
https://www.condalab.com/pdf/FAQ_agarosas.pdf
http://www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html#ssdna
http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf