6. 2.

EXERCICIS - QUANTIFICACIÓ I PURESA

(RESOLEU-LOS INDIVIDUALMENT)

1. Analitza la puresa de les següents mostres. A les mostres que creguis que hi ha
contaminació, explica quins són els possibles contaminants i quines solucions prendries
per eliminar-los:

MOSTRA 1: DNA MOSTRA 2: DNA MOSTRA 3: RNA

A230 = 0,182 A230 = 0,235 A230 = 0,229

A260 = 0,352 A260 = 0,436 A260 = 0,312

A280 = 0,265 A280 = 0,248 A280 = 0,166

A320 = 0,025 A320 = 0,020 A320 = 0,029

MOSTRA 1:

*Per que els resultats siguin més fiables restarem a cada absorbància el valor obtingut per
l’absorbància a A320
De manera que queda el següent:
A230 = 0,182 – 0,025 = 0,157
A260 = 0,352 – 0,025 = 0,327
A280 = 0,265 – 0,025 = 0,240

1. Quocient A260/A280 (Mesurar el grau de contaminació)

a. 0,327/0,240 = 1,36 Com el resultat es inferior a 1,6 podem afirmar que aquesta
mostra té una contaminació excessiva de fenols o de proteïnes
b. Solucions:
i. – Si la contaminació es per proteïnes basta amb l’adició de proteïnasa
K
ii. – Si la contaminació es per fenols caldria repetir el mètode de
purificació amb cloroform/alcohol isoamílic i la posterior precipitació de
DNA
2. Quocient A260/A230 (Mesurem la contaminació per contaminants menors com
carbohidrats i sals )
a. 0.327/0,157 = 2,08 Com el resultat es troba entre 1,5 i 2,2 podem afirmar que
no tenim contaminació per sals
MOSTRA 2
*Per que els resultats siguin més fiables restarem a cada absorbància el valor obtingut per
l’absorbància a A320
De manera que queda el següent:
A230 = 0,235 – 0,02 = 0,215
A260 = 0,436 – 0,02 = 0,416
A280 = 0,248 – 0,02 = 0,228

1. Quocient A260/A280 (Mesurar el grau de contaminació)

a. 0,416/0,228 = 1,82 Com el resultat es un valor comprès entre 1,7 i 2 podem
afirmar que el grau de puresa es l’adequat.
2. Quocient A260/A230 (Mesurem la contaminació per contaminants menors com
carbohidrats i sals)
a. 0,416/0,215 = 1,93 Com que el resultat es troba entre 1,5 i 2,2 podem afirmar
que no tenim contaminació per sals.
MOSTRA 3
*Per que els resultats siguin més fiables restarem a cada absorbància el valor obtingut per
l’absorbància a A320
De manera que queda el següent:
A230 = 0,229 – 0,029 = 0,2
A260 = 0,312 – 0,029 = 0,283
A280 = 0,166 – 0,029 = 0,137

1. Quocient A260/A280 (Mesurar el grau de contaminació)

a. 0,283/0,137 = 2,06 Com que el resultat es troba entre 1,8 i 2,1 el grau de
puresa de ARN es l’adequat.
2. Quocient A260/A230 (Mesurem la contaminació per contaminants menors com
carbohidrats i sals)
a. 0,283/0,2 = 1,41 Com que aquest valor és inferior a 1,5 podem afirmar que
aquesta mostra conté carbohidrats i sals
b. Solució: precipitar i rentar de nou l’àcid nucleic amb etanol, deixar-lo assecar
i resuspendre’l novament

2. En un tub eppendorf disposem de 50µl d’una solució de DNA genòmic humà. Per calcular
la seva concentració es dilueixen 5µl de la solució amb 195µl de tampó i es mesuren les
absorbàncies de la dilució a 260nm, 280nm i 320nm.
Els valors obtinguts són:
MOSTRA

A260 = 0,469

A280 = 0,265

A320 = 0,019
 *Per que els resultats siguin més fiables restarem a cada absorbància el valor obtingut per
l’absorbància a A320
De manera que queda el següent:
A260 = 0,469 – 0,019 = 0,450
A280 = 0,265 – 0,019 = 0,246

Calculeu:
1. La puresa del DNA
Per mesurar la puresa utilitzarem el quocient A260/A280.
 0,450 / 0,246 = 1,83 Com el resultat ens dona entre 1,7 i 2 podem dir que la mostra té
un grau de puresa adequat.

2. La concentració de la solució original en ng/µl

Per mesurar la concenctració ens basarem en que una unitat d’absorbància equival a 50ng/μl
(o 50μg/μl) de ADNds (assumim que al ser DNA genòmic humà es de doble cadena)

L’absorbància a A320 mesura la terbolesa de la solució per tant si restem el valor de A320 al de
A260. Podrem aplicar l’equivalència abans esmentada.
De manera que tenim:

0,469 - 0,019 = 0,45 · 50ng/μl = 22,5 ng/μl

Com que hem aplicat una dissolució 1/40 hem de fer la inversa per calcular la concentració
original

22,5ng/uL · (40/1) = 900 ng/uL

3. La quantitat total de DNA en µg en la solució original.

900ng/uL · 50uL = 45.000ng · (1ug/1000ng) = 45ug

En total hi havien 45ug en la solució original.