2.1.2 Instal.

lacions
equipaments i matiErials
per manipular
microorganismes i
cèl.lules
M07: TÈCNIQUES DE PRODUCCIÓ
INDUSTRIAL
QUè és un procÉs biotecnològic? Un procés industrial
on s’utilitza un microbi
per fabricar un
producte d’interès
farmacèutic (API)

PRODUCCIÓ
INSULINA
E.COLI
 QUÈ ÉS UN PROCÉS
BIOTECNOLÒGIC?
UPSTREAM PROCESS (USP): és la primera part del procés
biotecnològic, on els microorganismes, procariotes o eucariotes,
són utilitzats per escalar eficientment la producció
del producte desitjat.
Inclou totes les etapes de cultiu cel·lular: des de l’aïllament
del microorganisme, la preparació de medis, el desenvolupament
del inòcul, la conservació de les cèl·lules fins que es recull
el producte.
L'objectiu d'USP és optimitzar el creixement de micoorganisme de producció
en volums i entorns industrials i, per tant, conduir a la producció de grans
quantitats del producte objectiu.
 QUÈ ÉS UN PROCÉS
BIOTECNOLÒGIC?
DOWNSTREAM PROCESS (DSP):aquesta etapa s‘inicia quan es recull
el producte i inclou totes les etapes de separació del micoorganisme
productor i de la purificació del producte.
Cada pas de purificació condueix a una major puresa del producte. Tanmateix,
amb cada pas de purificació, la recuperació global del producte es redueix.

L'objectiu del DSP és obtenir la màxima puresa del producte (important en molts
medicaments per reduir la resposta immunogènica del pacient) i al mateix temps
evitar les pèrdues de producte durant les etapes de purificació.
 DISSENY DEL PROCÉS
El disseny del procés industrial ha de garantir
l’obtenció de la concentració, rendiment i puresa
desitjada del producte.

Upstream: instal·lacions i equipament han de garantir

el màxim rendiment.

Downstream: instal·lacions i equipament han de garantir

la màxima puresa i minimitzar la pèrdua de producte.
EsquemA general d’un procÉs biotecnològic

DIAGRAMA
DE
FLUX
PROCÉS
EsquemA general d’un procÉs biotecnològic

DIAGRAMA
D’INSTAL.LACIONS
PROCÉS
 ÂREA DE CULTIUS:INSTAL.LACIONS I
EQUIPAMENT
L’ àrea de treball per manipular i condicionar cultius ha d’instal·lar-se en una
zona tranquil·la del laboratori, allunyada de vies de pas i dedicada exclusivament
a cultiu de cèl·lules

Mantenir un gradient d’esterilitat des de dins fins al medi exterior.

S’ha de garantir i facilitar:
Esterilitat
Control de la contaminació del microorganisme productor
(d’altres microorganismes o altres substàncies pirògenes)
 ÂREA DE CULTIUS:INSTAL.LACIONS I
EQUIPAMENT
Controlant els fluxos d’aire i la ventilació d’una sala podem tenir dos
tipus de sales:
AMB PRESSIÓ POSITIVA:
s’utilitza en cas de de microorganismes sense risc biòlogic
el flux d’aire des sortida és mes gran que el flux d’aire d’entrada
evita que l’interor de la sala es contamini
AMB PRESSIÓ NEGATIVA:
s’utilitza en cas de de microorganismes amb risc biòlogic
el flux d’aire d’entrada és mes gran que el flux d’aire de sortida
evita que una possible contaminació de l’aire interior surti cap a fora
 PRE-SALES DE CULTIU
EQUIPS D’ESTIRILITZACIÓ:
Autoclau
Equip de filtració
Encenedor Bunsen
UV

Altres equips o utensilis:

Pipetes
Centrífugues
Equips de purificació d’aigua
Elements estructurals i arquitectònics
PRE-SALES DE CULTIU

AUTOCLAU

Sistema d’esterilització de sòlids i líquids

que utilitza vapor d’aigua.
Esterilització per temperatura humida (121º amb sobrepressió
d’1 atm durant uns 20 minuts).
No apte per utensilis termolàbils o sensibles a la temperatura
No apte per medis rics en sucres.(<118ºC per evitar la caramelització)
PRE-SALES DE CULTIU
MANTENIMENT I POSADA EN MARXA DE L’AUTOCLAU:

Revisar goma o junta tòrica

Comprovar posició vàlvula de pressió
Col·locar aigua destil·lada a l’interior comprovar el seu nivell
Depositar el material a esterilitzar a l’interior de la cistella
Rentar interior dipòsit i canviar l’aigua destil·lada
Mai obrir fins que no baixi per sota de 50º i quan no hi hagi pressió
Validar i comprovar procés d’esterilitzar
PRE-SALES DE CULTIU
MATERIALS AUTOCLAVES:

Per esterilitzar material: TOT MENYS EL MICROORGANISME

Medis de cultiu (tots no!)
Materials de plàstics resistents al calor (PP, PTFE, PC....)
Puntes Eppendorfs, tubs d’assaig, matrassos
No tancar completament els recipients, deixar ¼ de rosca per
enroscar per deixar actuar el vapor i evitar sobrepressions
Deixar assecar i dipositar material en lloc sec i net o en estufa
(si pot ser amb llum UV per evitar re contaminacions)
PRE-SALES DE CULTIU
EQUIPS DE FILTRACIÒ:

Per filtrar reactius (0,45 µm)

Per esterilitzar medis de cultiu (<0,22 µm):
Bomba peristàltica o de buit
Hermeticitat
Matràs de seguretat per evitar líquid a la bomba
Material en contacte amb el líquid ha de ser estèril
Embut, recipient receptor i filtre
Tècnica cara, per petits volums.
Per volums molt petits amb xeringa
PRE-SALES DE CULTIU
LLUM ULTRAVIOLADA (UV)

Exposar materials a radiació UV (elevada energia)

Provoca danys en l’ADN de l’organisme,
impedint la seva reproducció
Especialment s’usa a 250 nm aproximadament UVB
Per esterilitzar medis, instrumental i desinfectar
superfícies de treball i grans volums d’aigua o líquids
Risc per al personal
SAS
PRE-SALES DE CULTIU
MAGATZEM / CAMBRA DE CONGELACIÓ

Àrea dedicada a la conservació d’organismes i cèl·lules

Subministrament elèctric auxiliar
Sistemes seguretat i equips protecció
Frigorífics (5-8ºC); congeladors (-20ºC);
ultracongeladors (- 40ºC); tancs de nitrogen (-200ºC
SALES DE CULTIU

Sonicador, vòrtex
Instrumentació de transferència genètica
Plaques calefactores
Centrifugadora
Cabines de flux laminar
Cabines de bioseguretat
Incubadors de CO2 i cambres de cultiu
SALES DE CULTIU INSTRUMENTACIÓ DE
VORTEX SONICADOR TRANSFERÈNCIA GÈNICA

ELECTROPORACIÓ
SALES DE CULTIU
CENTRIFUGA
És usada per concentrar cèl·lules o
separar-les del medi.

De diferents dimensions: Diferents formes de gir:

Minicentrífuga: Ependorf de
0,2/0,5/1,5 ml 10.000 rpm
Centrífuga de sobretaula:15
ml i 4000-5000 rpm
Centrífuga de grans
dimensions
Ultracentrífugues: gran
velocitat (fins a 50.000 rpm)
SALES DE CULTIU
TIPUS DE CABINA:

CABINA O CAMPANA EXTRACTORA

CABINA O CAMPANA DE FLUX
LAMINAR
CABINA DE BIOSEGURETAT
CLASSE I
CLASSE II
CALSSEIII
SALES DE CULTIU
CABINA O CAMPANA EXTRACTORA

Sistema de ventilació de pressió negativa, on l’aire

de l’entorn és impulsat cap a l’interior i es extret
per la campana cap a l’exterior.
Protegeix el personal de gasos tòxics o aerosols
Evita la sortida de contaminants al aire del
laboratori
Controlar la velocitat de l’aire 0,6-07 m/s

EVITA E,L RISC QUÍMIC

SALES DE CULTIU
CABINA DE FLUX LAMINAR
Es realitza tot el treball amb microorganismes o cèl·lules. Mantenir una
àrea lliure de partícules, especialment de possibles contaminants
(bacteris, llevats, ...) que puguin accedir al cultiu.

Dispositiu mecànic que força el pas de l'aire a

través d'un filtre de gran superfície (filtre HEPA)
situat o bé al sostre (Flux vertical) o a la paret
frontal (Flux horitzontal) i que amb una eficiència
del 99.999% reté les partícules

EVITA LA CONTAMINACIÓ DEL

PRODUCTE
SALES DE CULTIU
CABINA DE FLUX LAMINAR MANTENIMENT CABINES

Canvi de filtre HEPA cada 6 mesos o

les hores en funcionament estipulat
pel fabricant
Revisió de cabal de flux (anemòmetre) i
estanqueïtat de la cabina
Canvi del llum UV després de les hores
estipulades en funcionament
Comprovació efectivitat UV
Registre d’ús i neteja.
Registres de manteniment
SALES DE CULTIU
CABINA DE BIOSEGURETAT
Com es cataloga la perillositat dels microorganismes?
Patogenicitat del microorganisme
Mode de transmissió i gamma de l’hoste
Disponibilitat local de mesures preventives
efectives de contenció
EVITA EL RISC BIOLÒGIC
Disponibilitat local de tractament eficaços

Protegeixen la persona,
el producte i l’ambient.

https://www.cbm.uam.es/images/servicios/cultivos-lavado-
esterilizacion/documentos/anexo_II_rd%20664_clasificacion_agentes_b
iologicos.pdf
SALES DE CULTIU
CABINA DE CLASSE I
Unitat de contenció parcial adequada per
la manipulació d’agents de baix risc.
Necessitat de protecció de l’operari i
del medi però no del producte.
Cabines anomenades de “gasos”
No són d’ús comú en els laboratoris
de cultiu de teixits.
SALES DE CULTIU
CABINA DE CLASSE II

Panell frontal d'accés

Flux laminar
Filtre HEPA de l’aire recirculat en cada cicle
Filtre HEPA de l’aire que surt a l’exterior
Ofereix protecció a l’operari, al medi i al producte
Velocitat de l’aire 38 o 50 cm/s.
Recirculació de l’aire del 30- 70% o total
Adequada per treballar amb agents classificats
amb nivell de seguretat 1,2 i 3.
SALES DE CULTIU
CABINA DE CLASSE III

Cabina totalment segellada

L’entrada i sortida d’elements a través d’una caixa
de doble porta
La manipulació la realitza un operari a través
de guants segellats en el frontal de la cabina
Ofereix protecció a l’operari, al medi i al producte.
Dos filtres HEPA ( extracció i admissió)
Adequada per treballar amb agents classificats
amb nivell de bioseguretat 4
SALES DE CULTIU
INCUBADORS DE CO2
És un equip que conté un controlador de temperatura
i CO2 que crea una atmosfera natural per el
creixement de cultius
Imprescindibles pel cultiu cel·lular de cèl·lules
eucariotes ( sobretot cèl·lules de mamífer)
La finalitat del CO2 és controlar el pH del medi
de cultiu
També controla la humitat i aportació d’oxigen

Neteja i manteniment:
Cada 15 dies rentar amb aigua i sabó, ruixar amb
alcohol 70º i antisèptic les lleixes.
Alguns porten incorporat funció esterilització per calor
SALES DE CULTIU
INCUBADORS DE CO2
Dispositiu d’injecció d’una barreja d’aire i CO2 en la
proporció desitjada, entre 4 i 7%. El CO2 d’elevada
puresa es subministra en ampolles pressuritzades,
i es barreja en el dispositiu d’injecció.
L’estabilitat de temperatura es una condició
indispensable en l’incubador. (28ºC cell lines insect)
(37 ºC mamallian cells lines)
Per controlar la temperatura solen estar equipats
d’una camisa d’aigua ( waterjacket)

SEMPRE TENIR UN INCUBADOR DE MÉS PER

POSSIBLES CONTAMINACIONS!!!!
SALES DE CULTIU
CAMBRES CLIMÀTIQUES
Grans dimensions
Creixement i manteniment en condicions de
temperatura, humitat i llum controlades
Especialment per vegetals
SALA DE MICROSCÒPIA
EQUIPS ÒPTICS
Lupa ( fins a 10x)
Microscopi vertical convencional
Microscopi invertit
Microscopi electrònic (per mostres on es necessita
més resolució, com els interiors cel·lulars)
Microscopi de fluorescència

Els microscopis s’empren pel control de cultius.

Els microscopis invertits tenen la principal avantatge
que permeten la observació de mostres vives
ESTABULARI (ANIMALARI)
Àrea dedicada a la producció i manteniment d’animals
d’experimentació
Aplicació en biomedicina i indústria farmacèutica
Aprovació interna pel comitè ètic
Requereix de personal amb formació
específica certificada
Requereix autorització
per l’administració (RD 53/2013)
Complir la regla de les 3 R’s
(reemplaçar, reduir i refinar)
ESTABULARI (ANIMALARI)
Infraestructura científica:

Zona lliure de patògens

Quiròfans i laboratori
Ventilació
Magatzem de material, pinso
Equip d'anestèsia
Àrea rentat animals
Àrea de quarantena
Il·luminació i temperatura
Insectari
Incinerador
CELL CULTURE LABORATORY AND EQUIPMENT OVERVIEW

Tasca 1: Visualtiza el següent video i recull en un full escrit la següent informació:

Llista de les característiques de les instal.lacions de les sales de cultiu

Llista dels equips que menciona, incloent una definició de perquè serveix cada
equip i manteniment associat

S’ha d’entregar en un full escrit a mà, no es considerarà vàlid un full escrit a ordinador.