CHROMATOGRAPHY PLANAR

Taufik Turahman, M.Farm., Apt

What is Chromatography?
Chromatography is a technique for separating
mixtures into their components in order to
analyze, identify, purify, and/or quantify the
mixture or components.

• Analyze
Separate • Identify
• Purify

Mixture Components • Quantify

Kromatografi
(chroma = warna, graphein = gambar)

• Dasar pemisahan: perbedaan distribusi

komponen-komponen campuran pada
fasa diam dan fasa gerak.
• Fasa diam: kolom, lempeng, kertas.
• Fasa gerak: cairan atau gas.
Uses for Chromatography
Chromatography is used by scientists to:

• Analyze – examine a mixture, its components, and their

relations to one another
• Identify – determine the identity of a mixture or components
based on known components
• Purify – separate components in order to isolate one of interest
for further study
• Quantify – determine the amount of the a mixture and/or the
components present in the sample
 Uses for Chromatography

Real-life examples of uses for chromatography:

• Pharmaceutical Company – determine amount of each chemical found in
new product
• Hospital – detect blood or alcohol levels in a patient’s blood stream
• Law Enforcement – to compare a sample found at a crime scene to samples
from suspects
• Environmental Agency – determine the level of pollutants in the water
supply

• Manufacturing Plant – to purify a chemical needed to make a product

DASAR KROMATOGRAFI
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-
komponen campuran tersebut diantara dua fase
Definition of Chromatography
Simplified Definition:
Chromatography separates the components of a mixture
by their distinctive attraction to the mobile phase and the
stationary phase.

Explanation:
• Compound is placed on stationary phase
• Mobile phase passes through the stationary phase
• Mobile phase solubilizes the components
• Mobile phase carries the individual components a certain
distance through the stationary phase, depending on their
attraction to both of the phases
Jenis-Jenis Kromatografi
Berdasarkan jenis fase (fase bergerak & fase diam) yang digunakan
• Kromatografi gas – cairan
• Kromatografi gas - padat
• Kromatografi cairan – cairan
• Kromatografi cairan - padat

Berdasarkan teknik yang digunakan

• Kromatografi kolom
• Kromatografi Planar, (Thin Layer Chromatography & Paper
crom)
Berdasarkan prinsipnya
• Kromatografi partisi
• Kromatografi absorbsi
• Kromatografi pertukaran ion
 Types of Chromatography
• Liquid Chromatography – separates liquid samples
with a liquid solvent (mobile phase) and a column composed of solid
beads (stationary phase)

• Gas Chromatography – separates vaporized samples with a

carrier gas (mobile phase) and a column composed of a liquid or of
solid beads (stationary phase)

• Paper Chromatography – separates dried liquid

samples with a liquid solvent (mobile phase) and a paper strip
(stationary phase)

• Thin-Layer Chromatography – separates dried liquid samples

with a liquid solvent (mobile phase) and a glass plate covered with a
thin layer of alumina or silica gel (stationary phase)
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi
pigmen tumbuhan atau
komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas kaca
untuk memisahkan komponen kimia dan
bahan lainnya

Paper Chromatography
Dapat digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen tinta, pewarna,
senyawa tumbuhan (klorofil), make-up, dan
banyak zat lain

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia zat-zat yang tidak diketahui, seperti
senyawa berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh tiap-tiap puncak dalam grafik .
Illustration of
Chromatography
Stationary Phase

Separation

Mobile Phase

Mixture Components
Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase
Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase

Black        
Red       
Yellow          
Paper Chromatography (PC)
Merupakan metode analitik yang digunakan untuk
memisahkan bahan kimia berwarna, terutama pigmen
dapat juga digunakan untuk memisahkan warna primer
atau sekunder dalam tinta
Kromatografi Kertas (PC)
Fase diam → kertas serap (Whatman)
Fase gerak →pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Dilakukan secara Ascending , Descending, Horizontal Rf
(Retensi Factor). Jarak relatif pada pelarut disebut sebagai
.
nilai Rf Untuk setiap senyawa berlaku
rumus sebagai berikut:

Rf
Ascending Descending Horizontal
 Faktor-factor yg mempengaruhi nilai RF
• Pelarut
Jenis pelarut dan komposisi dari pelarut dapat mempengaruhi nilai karena akan mempengaruhi koefisien partisi
• Suhu
Perubahan suhu berpengaruh terhadap nilai Rf karena perubahan suhu akan menyebabkan terjadinya perubahan
koefisien partisi dan kecepatan aliran
• Ukuran bejana
Volume bejana mempengaruhi homogenitas atmosfer sehingga mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-
komponen pelarut. Jika bejana besar, bisa menyebabkan perambatan menjadi lebih lama.
• Jenis kertas
Pori-pori kertas dan ketebalan kertas akan mempengaruhi perambatan sehingga berpengaruh terhadap nilai Rf.
• Sifat campuran
Karakteristik komponen yang akan dipisahkan mempengaruhi nilai Rf sebab kelarutan dalam eluen dan partisi
komponen-komponen tersebut di antara fasa tetap dan fasa gerak berbeda-beda sehingga nilai Rf dari masing-masing
komponen akan berbeda pula
 Pemilihan kertas

berpengaruh pada pemisahan dengan kromatografi kertas

karena ukuran pori-pori kertas mempengaruhi kecepatan aliran
pelarut.
Kertas yang digunakan diutamakan memiliki kemurnian yang
tinggi dan ketebalan kertas yang merata untuk memperoleh
hasil analisa yang valid.
Kertas kromatografi merupakan kertas berpori dari selulosa
murni, memiliki afinitas besar terhadap air dan pelarut polar lain
dengan membentuk ikatan hidrogen.
Karakteristik dari kertas kromatografi Whatmann
 Pemilihan pelarut
• Pelarut yang digunakan adalah pelarut yang memiliki
kemurnian tinggi dan mudah menguap. Pemilihan pelarut
organic ini sangat penting karena akan menentukan
keberhasilan pemisahan. Pemilihan pelarut disesuaikan
dengan kepolaran komponen yang akan dianalisa
• Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak
yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar.
Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh
fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
 IDENTIFIKASI SENYAWA

Noda yang berwarna dapat diamati dan diidentifikasi secara langsung, sedangkan
untuk noda yang tidak berwarna perlu diberikan perlakuan tambahan agar dapat
diidentifikasi.
Noda yang tidak berwarna dapat diidentifikasi dengan cara berikut ini:

• Secara fisika
Identifikasi noda secara fisikas dilakukan dengan melakukan pengamatan di
bawah sinar UV dengan panjang gelombang yang digunakan adalah 366 nm dan
254 nm.
Secara kimia
1. Penyemprotan
Penyemprotan dilakukan dengan menggunakan pereaksi sehingga noda
yang terdapat pada kertas menjadi berwarna. Bahan yang biasa
digunakan: etanol, propanol, n-butanol, kloroform. Larutan ninhidrin
digunakan untuk mendeteksi asam amino, baru memberikan warna
setelah 24 jam
2. Pencelupan
Pencelupan dilakukan dengan menggunakan pereaksi yang dimasukkan
dalam bejana yang dangkal kemudian lembaran kertas dicelupkan di
dalamnya. Bahan yang digunakan sama dengan bahan yang digunakan
pada penyemprotan.
Kromatografi Kertas Dua Arah
 Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.

 Menggunakan dua pelarut yang berbeda. Pelarut

pertama harus kering dahulu.
Spots move with
the second
solvent
Thin-Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)/(TLC)
• Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik
yang keras.
• Fase diam → Gel silika (SiO2) atau alumina (Al2O3), atau
substansi yang dapat berpendar dalam sinar ultra violet
• Eluen bergerak dari bawah ke atas karena gaya kapiler.
 Principles of TLC
TLC is a fast, simple, and inexpensive analytical technique
used to determine or monitor:
 The of components in a mixture.
 The identity of two substances.
 The effectiveness of a purification.
 The appropriate conditions for a column
chromatographic separation.
 The progress of a reaction.
 Column chromatography effectiveness.
Fasa Diam
Syarat fasa diam:
• Tidak larut dalam fasa gerak.
• Tidak bereaksi dengan zat yang akan dipisahkan.
• Tidak berwarna.
• Komposisi seragam.
 Fasa Diam
• Bahan yang sering digunakan sebagai fasa diam:
Silika (SiO2) dan Alumina (Al2O3).
• Bahan fluoresen: seng sulfida (ZnS).
• Bahan perekat: gipsum (CaSO4).
Contoh: Silika Gel GF254 , Silica Gel 60H
G = mengandung gipsum
F254 = fluoresensi di bawah sinar 254 nm
H = tanpa perekat
Adsorbents for TLC

• Silica gel
• Silica gel-F (Fluorescing indicator added)
• Magnesium Silicate (Florisil)
• Polyamides
• Starch
• Alumina
Pembuatan lapisan tipis:
• Adsorben (+perekat) diaduk dengan air hingga
homogen (terbentuk slurry).
• Slurry dituang merata pada permukaan penyokong.
Atau: setangkup gelas obyek dicelupkan pada slurry.
• Dikeringkan dengan pemanasan pada suhu 120 °C
(oven).
 Pelat beli jadi (aluminium, kaca, plastik)

1 2 3

1. Potong pelat sesuai ukuran yang dikehendaki

2. Ukur 1 cm dari tepi
3. Beri garis dan tandai tempat penotolan
(permukaan jangan sampai rusak)
Fasa Gerak (Eluen)
• Kebanyakan pelarut untuk kromatografi bersifat
mudah menguap dan mudah terbakar. Hindari api!
 Deret eluotropik pelarut pengembang
ANALIT
Parafin titik didih tinggi Non-polar
Sikloheksan
Hidrofil
Benzen
Sikoheksan-etil asetat 95:5
• Asam
Benzen-etil asetat 95:5
Kloroform
• Alkohol
Sikloheksan-etil asetat 85:15
Kloroform-aseton 9:1
• Amina
Benzen-metanol 95:5
Sikloheksan-etil asetat 1:1
• Keton
Benzen-etanol 9:1
Benzen-etil asetat 1:1
• Eter
Dietil eter
Etil asetat-metanol
• Hidrokarbon
Aseton
Dimetil formamid
Air Daya elusi  Lipofil
 Aplikasi sampel
• Sampel dilarutkan dalam pelarut organik paling non
polar yang dapat melarutkannya.
• Dengan bantuan pipa kapiler, larutan sampel ditotolkan
pada permukaan lapisan tipis, yakni pada garis dasar
kira-kira 1 cm dari salah satu ujung lempeng.
• Penotolan jangan sampai melukai permukaan lapisan
tipis  perlu latihan!
• Perhatikan banyaknya sampel yang ditotolkan 
jangan sampai ‘overload’ (perlu pengalaman).
 Aplikasi sampel

1 2 3

1. Tambahkan beberapa tetes pelarut pada sampel

2. Aduk hingga sampel larut
3. Celupkan salah satu ujung kapiler
 Aplikasi sampel

13 4 5

3. Totolkan, jangan sampai merusak permukaan

4. Cuci kapiler dengan pelarut
5. Keringkan dengan kertas tisu atau kertas saring
Bejana pengembang
Penotolan

(a) Setelah penotolan

(b) Setelah elusi
 Mengembangkan kromatogram
• Masukkan lempeng dengan bantuan pinset,
sandarkan pada dinding bejana.
• Garis dasar harus lebih tinggi dari permukaan
eluen.
• Biarkan eluen naik hingga ±1 cm dari tepi atas.
• Angkat lempeng, beri tanda batas elusi
dengan pensil.
• Uap kan pelarut dalam lemari asam.
Development

---Thin Layer Chromatography

(TLC), animation -
YouTube.mp4
Sebuah garis menggunakan pensil digambar
dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan
pada garis itu. x
Ketika bercak dari campuran itu mengering,
lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang
tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa
batas pelarut berada di bawah garis dimana
posisi bercak berada.

Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah

kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap
dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini,
dalam gelas kimia biasanya ditempatkan
beberapa kertas saring yang terbasahi oleh
pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan
uap mencegah penguapan pelarut.
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rfuntuk setiap warnadihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari1.7
cm dari garis awal, sementara
pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga
nilai Rfuntuk komponen berwarna
merah menjadi:
Analisis Sampel yang Tidak Berwarna

1.Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis
seringkali memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran
flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak

pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat
dengan mata. Ketika sinar UV diberikan pada
lempengan, akan timbul pendaran dari posisi
yang berbeda dengan posisibercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. –Ultraviolet light at 254 nm
(shortwave UV).
–Long wave UV (366 nm) is
used less commonly.
 2. Penunjukkan bercak secarakimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi
tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan
produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang
dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.

Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa- senyawa
berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas
arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram,
atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercakdaripada lempengan.
Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

Fenol = FeCl3  Biru kehitaman, Flavonoid= AlCl3  Kuning, Steroid =

Vanilin H2So4  Biru/Merah Keunguan, Alkaloid = Dragendorf  Jingga
kecoklatan
Visualization
 Menampakkan noda
Noda dapat ditampakkan dengan:
• Sinar ultraviolet  senyawa yang
bagaimana?
Awas: jangan memandang lampu UV!
• Uap iodin (I2) : masukkan lempeng dalam
wadah tertutup berisi kristal I2.
• Pereaksi warna
Lempeng besar  semprotkan
lempeng kecil  celupkan
Uv 254 & 366
 Menampakkan noda dengan sinar UV

!!!!!!!!
Awas jangan memandang langsung lampu UV
Penotolan ganda
KLT dua dimensi
KLT dua dimensi

Kiri: komponen-komponen stabil

Kanan: komponen mengalami dekomposisi
Noda berbentuk ‘aneh’

(a) Zat mengandung

gugus asam atau
basa kuat.
(b) Permukaan adsorben
rusak pada
penotolan.
(c) Senyawa ditotolkan
dalam pelarut sangat
polar.
TLC Problems: Troubleshooting
 Over migration
 Under migration
 Distorted solvent front
 Distorted spots
 Distorted spots
 No separation
 No separation
 Tailing
 Tailing
 Tailing
 Tailing/no separation
Developer too polar Reduce polarity
Developer too non-polar Increase polarity
Developer not equilibrated Equilibrate
Wrong adsorbent Change plates
Spotted too much Change concentration
Wrong developer Change developer
Wrong adsorbent Change plate type
Spot overloading Reduce concentration
Component is basic Increase acidity
Component is acidic Increase basicity
Decomposition Developer/plate
Any Question??
Terimakasih