屠畜副産物の持続的利用に資するヘパリン原薬製造

における精製工程および分析方法の至適化に関する
研究

著者 村田 浩志
学位名 博士(農学)
学位授与機関 宮崎大学
学位授与番号 17601甲第66号
URL http://hdl.handle.net/10458/4941
 宮 崎 大 学 大 学 院

博 士 学 位 論 文

屠畜副産物の持続的利用に資するヘパリン原薬製造における
精製工程および分析方法の至適化に関する研究

Study on Optimization of Purification Process and an

Analytical Method for Manufacturing of Heparin Products
Aiming for Sustainable Util zation of
By-products Derived from Animal Carcass

2014 年 3 月

宮崎大学大学院農学工学総合研究科

資 源 環 境 科 学 専攻

村 田 浩 志
 目 次
Page
第 1 章 緒論 1

1. は じ め に 1

2. 血 液 透 析 療 法 で 使 用 さ れ る ヘ パ リ ン 3

未 分 画 HP（ unfractionated heparin, UFH ） 4

低 分 子 HP（ Low molecular weight heparin, LMWH ） 6

3. HP 製 剤 中 に 混 入 し た 不 純 物 に よ る 有 害 事 象 7

4. 本 研 究 の 目 的 9

第 2章 各ムコ多糖の分子量分布および亜硝酸分解に対する反応性
の確認 12

緒言 12

実験材料と方法 14

1. 供 試 材 料 14

2. ム コ 多 糖 の 亜 硝 酸 分 解 処 理 14

3. ゲ ル ろ 過 HPLC に よ る 分 子 量 分 布 の 確 認 14

結果と考察 16

要約 29

第 3章 エタノール分画処理によるヘパリンの精製、および亜硝酸

分 解 と ゲ ル ろ 過 HPLC を 組 み 合 わ せ た 純 度 確 認 試 験 の 検 討 31

緒言 31

実験材料と方法 33

1. 供 試 材 料 33

2. ム コ 多 糖 の 亜 硝 酸 分 解 処 理 33

3. ゲ ル ろ 過 HPLC に よ る 分 子 量 分 布 の 確 認 34

4. 1 H-NMR 法 に よ る ム コ 多 糖 の 確 認 34

5. エ タ ノ ー ル 分 画 処 理 35

結果と考察 37

-i -
 要約 50

第 4章 エタノール分画処理による低分子ヘパリンの精製 、および
亜 硝 酸 分 解 と ゲ ル ろ 過 HPLC を 組 み 合 わ せ た 純 度 確 認 試 験
の検討 51

緒言 51

実験材料と方法 53

1． 供 試 材 料 53

2. ゲ ル ろ 過 HPLC に よ る ム コ 多 糖 の 分 子 量 分 布 の 確 認 53

3. 1 H-NMR 法 に よ る ム コ 多 糖 の 確 認 54

4. エ タ ノ ー ル 分 画 処 理 に よ る ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 精 製
（予備検討） 54

5. エ タ ノ ー ル 分 画 処 理 に よ る ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 精 製
（本検討） 55

6. ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム の エ タ ノ ー ル 分 画 物 の 亜 硝 酸 分
解処理 56

結果と考察 59

要約 76

第 5章 総括 77

Summary 81

謝辞 85

参考文献 86

-ii-
略語一覧
略語 英語 日本語

ATⅢ AntithrombinⅢ アンチトロンビンⅢ

BSE Bovine spongiform encephalopathy 牛海綿状脳症
CHP Crude heparin 粗ヘパリン
CS Chondroitin sulfate コンドロイチン硫酸
CS-A Chondroitin sulfate type -A コンドロイチン硫酸 A
CS-B Chondroitin sulfate type -B コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 B（ DS）
CS-C Chondroitin sulfate type -C コンドロイチン硫酸 C
CS-D Chondroitin sulfate type -D コンドロイチン硫酸 D
CS-E Chondroitin sulfate t ype-E コンドロイチン硫酸 E
CSF Chondroitin sulfate family コンドロイチン硫酸ファミリー
CS-H Chondroitin sulfate type -H コンドロイチン硫酸 H
CS-K Chondroitin sulfate type -K コンドロイチン硫酸 K
DN Dalteparin sodium ダルテパリンナトリウム
DS Dermatan sulfate デ ル マ タ ン 硫 酸 （ CS-B）
EN Enoxaparin sodium エノキサパリンナトリウム
EtOH Ethanol エタノール
FDA U.S Food and Drug Administration アメリカ食品医薬局
GAG Glycosaminoglycan グリコサミノグリカン
Gal D-Galactose D-ガ ラ ク ト ー ス
GalN D-Galactosamine D-ガ ラ ク ト サ ミ ン
GalNAc N-acetyl-D-Galactosamine N-ア セ チ ル -D-ガ ラ ク ト サ ミ ン
GlcN D-Glucosamine D-グ ル コ サ ミ ン
GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine N-ア セ チ ル -D-グ ル コ サ ミ ン
GlcNS N-sulfate-D-glucosamine N-ス ル フ ェ ー ト -D-グ ル コ サ ミ ン
GluA D-Glucuronic acid D-グ ル ク ロ ン 酸
HA Hyaluronic acid ヒアルロン酸
HP Heparin ヘパリン
HS Heparan sulfate ヘパラン硫酸

-iii-
ICH International Conference on 日 米 EU 医 薬 品 規 制 調 和 国 際 会 議
Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use
IdoA L-Iduronic acid L-イ ズ ロ ン 酸
KS Keratan sulfate ケラタン硫酸
LMWH Low molecular weight heparin 低分子ヘパリン
MeOH Methanol メタノール
MHRA U.K Medicines and Healthcare イギリス医薬品庁
products Regulatory Agency
MS Mucopolysaccharide ムコ多糖
OSCS Over-sulfated chondroitin sulfate 過硫酸化コンドロイチン硫酸
PG Proteoglycan プロテオグリカン
PN Parnaparin sodium パルナパリンナトリウム
RI Refractive index 示差屈折
RN Reviparin sodium レビパリンナトリウム
UA Uronic acid ウロン酸
UFH Unfractionated heparin 未分画ヘパリン
UV Ultra violet 紫外吸収

-iv-
第 1 章 緒論

1. は じ め に

生 体 成 分 で あ る ム コ 多 糖 （ mucopolysaccharide , MS） は 、 グ リ コ サ ミ ノ グ リ

カ ン （ glycosaminoglycan, GAG ） と も 呼 称 さ れ 、 動 物 の 結 合 組 織 を 中 心 に あ ら

ゆる組織中、特に結合組織中ではタンパク質と結合した状態であるプロテオグ

リ カ ン（ proteoglycan, PG ）と し て 存 在 す る 。MS は そ の 分 子 内 に 保 水 作 用 を 有

す る こ と か ら 、組 織 構 造 の 維 持 あ る い は 関 節 間 の 潤 滑 作 用 を 有 す る 。MS の 呼 称

（ Meyer 1938） は 本 来 、 ラ テ ン 語 の muco（ 生 体 粘 膜 中 の 粘 質 性 分 泌 物 の 意 ）

に由来するが、現在ではアミノ糖を含有する多糖類と定義されている。

MS の 構 造 は 一 部 を 除 き 、二 糖 単 位 の 繰 り 返 し 構 造 か ら な る 枝 分 れ の な い 長 鎖

であり、その二糖単位の基本となる組み合わせとして、アミノ糖とウロン酸

（ uronic acid, UA）、 ま た ア ミ ノ 糖 と D-ガ ラ ク ト ー ス （ D-galactose, Gal ） の 2

種 類 が 多 く 認 め ら れ る 。 前 者 の 場 合 、 ア ミ ノ 糖 に は D- グ ル コ サ ミ ン

（ D-glucosamine, GlcN ）あ る い は D-ガ ラ ク ト サ ミ ン（ D-galactosamine, GalN ）、

UA と し て は D-グ ル ク ロ ン 酸 （ D-glucuronic acid, GluA ） あ る い は L-イ ズ ロ ン

酸 （ L-iduronic acid, IdoA） ま た は Gal が ア ミ ノ 糖 に 結 合 す る 。 一 方 、 後 者 の

場 合 、ア ミ ノ 糖 は GlcN で あ り 、Gal と GlcN の 二 糖 単 位 の 糖 鎖 骨 格 の み を 有 す

る MS と し て 、角 膜 /軟 骨 等 の 組 織 に 含 有 さ れ る ケ ラ タ ン 硫 酸（ keratan sulfate,

KS） が 知 ら れ て い る 。 こ れ ら の 基 本 構 造 に 加 え 、 各 糖 に 結 合 す る ア セ チ ル 基 あ

る い は 硫 酸 基 の 数 、 結 合 部 位 等 の 相 違 に よ り 各 MS の 特 性 は 変 化 し 、 そ れ ぞ れ

特徴のある生理活性を呈している。

工 業 的 あ る い は 商 業 的 な MS の 用 途 は 多 岐 に わ た り 、 健 康 食 品 、 化 粧 品 、 研

- 1-
究用試薬および医薬品等、多くの分野において世界中で流通している。後述す

る よ う に 、 MS の 種 類 は 様 々 で あ り 、 そ れ ら を 抽 出 /精 製 す る た め の 粗 原 料 も ま

た多様である。あまり知られていないが、粗原料の起源を遡ると、畜産資源で

ある牛、豚、羊では軟骨あるいは腸粘膜、また家鶏では鶏冠等、そして、水産

資源である鮫、イカでは軟骨等、という具合に、それぞれの食品加工時に生じ

る副産物に由来するものが大多数を占めている。

し か し 、 2 0 0 0 年 代 初 頭 に 発 生 し た 牛 海 綿 状 脳 症 （ bovine spongiform

encephalopathy, BSE）問 題 以 降 、牛 由 来 の 副 生 成 物 の 利 用 は 大 き く 制 限 さ れ 、

牛 由 来 の MS の 流 通 も 同 様 に 厳 し く 制 限 さ れ て い る 。近 年 で は 甲 殻 類（ Kitagawa

ら 1997）や 微 生 物（ Matsuda ら 1992）由 来 の MS に つ い て も 、糖 鎖 構 造 あ る

い は 生 理 活 性 や 有 効 利 用 等 に 関 す る 研 究 等 が 報 告 さ れ て お り 、 MS 粗 原 料 の 新

規開拓も期待されている。健康増進を目的とする健康食品の素材、あるいは表

皮 保 湿 を 目 的 と す る 化 粧 品 の 素 材 と な る MS と し て 、N-ア セ チ ル -D-ガ ラ ク ト サ

ミ ン （ N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc） と UA の 二 糖 を 基 本 骨 格 と し た コ

ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 （ chondroitin sulfate, CS ）、 そ し て GlcNAc と GluA の 二 糖

を 基 本 骨 格 と し た ヒ ア ル ロ ン 酸 （ hyaluronic acid, HA ） が 挙 げ ら れ る 。 工 業 的

に は 、前 者 は 豚 、鮫 お よ び イ カ の 軟 骨 、後 者 は 鶏 冠 か ら 製 造 さ れ る こ と が 多 い 。

食 品 あ る い は 化 粧 品 の 分 野 に お け る MS の 認 知 度 は 高 い が 、 実 は 医 療 分 野 に

お い て 生 物 由 来 の 医 薬 品 原 料 と し て 流 通 し て い る MS も 多 い 。 例 え ば 、 前 述 し

た CS は 、 外 科 領 域 で は 腰 痛 症 、 関 節 痛 お よ び 感 音 性 難 聴 等 の 疾 患 の 治 療 薬 と

して、また、眼科領域では角膜表層保護を目的とした治療薬として使用されて

い る 。一 方 、HA は 、外 科 領 域 で は 変 形 性 膝 関 節 症 お よ び 関 節 リ ウ マ チ に お け る

膝関節痛等の治療に使用され、眼科領域では角結膜上皮障害等の疾患における

- 2-
治 療 薬 と し て 使 用 さ れ て い る 。 特 に 、 日 本 国 内 で の CS の 歴 史 は 古 く 、 す で に

昭 和 初 期 か ら CS 分 解 酵 素 の 研 究 成 果 も 報 告 さ れ て お り（ Soda と Egami 1938）、

後に頭痛薬として研究が進められ、医薬品として販売された経緯は興味深い。

2. 血 液 透 析 療 法 で 使 用 さ れ る ヘ パ リ ン

ヘ パ リ ン （ heparin, HP） は 、 主 に GlcN と UA の 二 糖 を 基 本 骨 格 と し た MS

で あ り 、 そ の 血 液 凝 固 阻 止 作 用 が 良 く 知 ら れ て い る 。 ま た 、 BSE 問 題 が 発 生 す

る以前は、その粗原料として、牛 、 豚 お よ び 羊 腸 を 用 い た 天 然 ケ ー シ ン グ 製 造

の初期段階において、残留する内容物を洗浄した後に削ぎ落とされる腸内粘膜

が 利 用 さ れ て き た が 、 現 在 で は ほ ぼ 豚 腸 粘 膜 の み が 利 用 さ れ て い る 。 HP は 、

CS や HA と は 異 な り 、食 品 や 化 粧 品 と し て の 利 用 例 は ほ と ん ど 無 い が 、医 療 分

野において血液透析療法などの体外循環装置使用時における血液凝固の防止の

ために使用される。血液透析とは腎機能の低下に伴って血液中に蓄積する老廃

物および過剰水分等を人工的に除去する臨床医療のひとつであり、具体的には

ダイアライザと呼ばれる透析膜を充填した人工腎臓内に血液を送り込み、透析

膜外に老廃物や過剰水分を排出する治療方法である。血液透析療法の際には、

体 外 循 環 時 に 血 液 が 凝 固 し な い よ う に 、 合 成 品 あ る い は HP の よ う な 生 物 由 来

の血液凝固阻止剤が使用される。

日本透析医学会による「慢性透析患者数の推移に関する調査（日本透析医学

会 2013）」に よ れ ば 、日 本 国 内 の 慢 性 透 析 患 者 数 は 2005 年 頃 ま で 年 間 約 1 万 人

ず つ 増 加 し 、 2011 年 末 に 30 万 人 を 超 え （ 304,856 人 ）、 ま た 、「 治 療 方 法 別 抗

凝 固 薬 の 種 類 に 関 す る 調 査 （ 日 本 透 析 医 学 会 2004）」 に よ れ ば 、 血 液 透 析 、 血

液 濾 過 透 析 お よ び 血 液 吸 着 透 析 等 の 透 析 療 法 の 種 類 に よ ら ず 、HP 製 品 の 使 用 例

- 3-
が 過 半 数 を 超 え て い る 。重 度 の 腎 不 全 の 場 合 、透 析 は 月 当 た り 10～ 15 回 前 後 行

われ、その毎に血液凝固阻止剤の使用が必須であることから、血液透析におけ

る 血 液 凝 固 阻 止 剤 と し て 、HP 製 品 は か な り 高 頻 度 で 使 用 さ れ て い る こ と に な る 。

HP 製 品 の 主 原 料 と な る HP 原 薬 に は ，以 下 に 述 べ る 未 分 画 HP と 低 分 子 HP が

ある。

未 分 画 HP（ unfractionated heparin, UFH ）

HP は 、 1916 年 に イ ヌ 肝 臓 か ら 、 血 液 凝 固 阻 害 作 用 を も つ 物 質 と し て 発 見 さ

れ （ Mclean 1916）、 そ の 後 、 哺 乳 動 物 の 種 に よ ら ず 、 ま た 肝 臓 以 外 の 器 官 に も

存 在 （ Charles と Scott 1933） す る こ と が 報 告 さ れ た 。 血 液 循 環 に 関 す る 疾 患

等 で 、HP の 臨 床 使 用（ Murray ら 1937, Murray 1940）が な さ れ て 以 来 、医 療

分野で世界的に広く普及し、血液透析時の血液凝固阻止および血栓塞栓症予防

等の目的で使用されている。

HP 糖 鎖 の 基 本 骨 格 は GlcNAc あ る い は N- ス ル フ ェ ー ト -D- グ ル コ サ ミ ン

（ N-sulfate-D-glucosamine, GlcNS） と UA（ GluA あ る い は IdoA） の 繰 り 返

し 二 糖 で 構 成 さ れ て い る 。HP は 、血 中 の 血 液 凝 固 イ ン ヒ ビ タ ー の ひ と つ で あ る

ア ン チ ト ロ ン ビ ン Ⅲ（ a n t i t h r o m b i n Ⅲ , ATⅢ ）と 結 合 す る こ と に よ り 、元 来 AT

Ⅲが有する血液凝固阻害作用を著しく増強する作用があることが報告された

（ Damus ら 1973）。 こ の 阻 害 作 用 の 本 質 は 、血 中 の 血 液 凝 固 因 子 の 一 連 の 連

鎖反応（凝固カスケード）によって引き起こされる血液凝固反応の中で、その

下 流 に 位 置 す る Xa お よ び Ⅱ a（ ト ロ ン ビ ン ） 因 子 の 両 者 を 強 く 阻 害 す る こ と に

より、Ⅰ（フィブリノーゲン）因子のフィブリン化を抑制することである。

工 業 的 に は 、HP は 食 用 獣 で あ る 牛 、豚 お よ び 羊 等 の 屠 畜 後 の 副 生 物 か ら 製 造

さ れ る 生 理 活 性 物 質 で あ り 、 主 に 肺 、 肝 お よ び 腸 組 織 か ら 抽 出 さ れ る （ Pearce

- 4-
ら 1968）。 基 本 的 に は 、 各 組 織 を 破 砕 し て 調 製 し た 懸 濁 液 の 酵 素 処 理 を 行 い 、

吸 着 剤 処 理（ Roden と Dorfman 1959）に よ っ て 得 ら れ た 粗 HP（ crude heparin,

CHP） を 用 い て 、 い く つ か の 精 製 工 程 を 経 た 後 に 最 終 製 品 と な る 。 し か し 厳 密

に は 、 製 造 メ ー カ ー に よ っ て HP の 製 造 方 法 は 異 な っ て お り 、 そ の 製 造 方 法 の

相 違 に よ り 、 化 学 構 造 や 生 理 活 性 が 変 動 す る こ と も 指 摘 さ れ て い る （ Coyne

1 9 7 7 ）。前 述 の と お り 、BSE 問 題 以 降 、医 薬 品 原 料 と し て の HP 製 造 に お い て 、

そ の 粗 原 料 と し て 用 い ら れ る CHP は 、 ほ ぼ 豚 腸 粘 膜 由 来 で あ る 。 CHP は 、 HP

に 加 え 、 主 に ヘ パ ラ ン 硫 酸 （ heparan sulfate, HS） お よ び コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸

フ ァ ミ リ ー （ chondroitin sulfate family, CSF ） を 含 有 し て い る （ Griffin ら

1995）。各 製 造 メ ー カ ー 、ま た 個 々 の 製 造 ロ ッ ト に よ っ て 若 干 の 差 異 は あ る も の

の 、 HP 最 終 製 品 中 に は CHP に 由 来 す る こ れ ら の MS が 不 純 物 と し て 残 留 し て

い る 場 合 も あ っ た た め 、 HP は 未 分 画 HP（ unfractionated heparin, UFH） と

も 呼 称 さ れ て き た 。HS 糖 鎖 の 基 本 骨 格 は GlcNAc あ る い は GlcNS と UA

（ GluA

あ る い は IdoA） の 繰 り 返 し 二 糖 で 構 成 さ れ 、 HP と 似 た 構 造 で あ る が 硫 酸 基 の

数 や 結 合 位 置 が HP と は 異 な り （ Toida と L i n h a r d t 1998）、 血 液 凝 固 阻 害 作 用

は HP よ り も 弱 い こ と が 知 ら れ て い る（ Ishihara と Ono 1998）。ま た 、CSF は 、

そ の 天 然 型 と し て 、 主 に 五 つ の 型 （ CS-A, CS-B, CS-C, CS-D お よ び CS-E） に

分 類 さ れ て き た （ Bernardi ら 1957, Meyer と Chaffee 1941, Meyer ら 1936,

Suzuki 1960, Kawai ら 1966 ）。 ま た 、 CS-B は デ ル マ タ ン 硫 酸 （ dermatan

sulfate, DS）と も 呼 称 さ れ て い る 。こ れ 以 外 の CSF と し て 、近 年 で は ヌ タ ウ ナ

ギ 由 来 の CS-H（ Akiyama と Seno 1973）お よ び カ ブ ト ガ ニ 由 来 の CS-K（ Seno

と Murakami 1982） も 注 目 さ れ て き て い る 。 CSF 糖 鎖 の 基 本 骨 格 は GalNAc

と UA の 繰 り 返 し 二 糖 で 構 成 さ れ て お り 、 特 に ア ミ ノ 糖 が GalNAc で あ る こ と

- 5-
が HP や HS と は 大 き く 異 な っ て い る 。 豚 腸 粘 膜 中 の HP 以 外 の MS は 、 主 に

HS、 CS-B（ DS） お よ び CS-C で あ る 。 抽 出 方 法 に よ り 変 動 す る も の の 、 通 常

CHP 中 に は 、 特 に 高 分 子 MS と し て CS-B（ DS） が 5～ 20％ 程 度 含 有 さ れ て い

る 場 合 が 多 い 。そ の た め 、CS-B（ DS）含 量 は し ば し ば HP の 精 製 度 の 指 標 と な

る 。こ れ ら CHP 中 に 含 有 さ れ る HP 以 外 の MS も ま た 、分 画 あ る い は 化 学 修 飾

されて食品、研究用試薬、あるいは医薬品などとして有効利用されている（奥

山 ら 1979）。 HP と 同 様 に そ の ア ミ ノ 糖 組 成 が 主 に GlcNAc あ る い は GlcNS で

あ る HS と 異 な り 、 ア ミ ノ 糖 組 成 が 主 に GalNAc で あ る CSF は 、 UFH 中 に お

よ そ 0～ 5％ 前 後 が 残 留 し て い る こ と は こ れ ま で に も 確 認 さ れ て い た 。 し か し 、

CSF の 残 留 に 起 因 す る 重 篤 な 副 作 用 の 報 告 例 は 少 な く 、 こ れ ま で 特 別 な 対 策 が

取られることなく臨床使用されてきた経緯がある。

低 分 子 HP（ Low molecular weight heparin , LMWH）

HP の 臨 床 使 用 時 に お け る 副 作 用 と し て 、そ の 血 液 凝 固 阻 害 作 用 と い う 生 理 活

性上の特性により、出血時間の延長、すなわち出血傾向の助長が挙げられる。

こ れ は HP が 結 合 し た ATⅢ に よ り 、 血 液 凝 固 因 子 で あ る 第 Ⅹ a 因 子 お よ び 第 Ⅱ

a 因子が強力に阻害されることにより惹き起されるものである。通常、組織か

ら 抽 出 さ れ た HP は 単 一 物 質 で は な く 、 不 均 一 な 分 子 量 分 布 を 有 す る 多 分 散 の

混 合 物 質 で あ る が 、高 分 子 領 域 に 分 布 す る HP は 第 Ⅹ a 因 子 活 性・第 Ⅱ a 因 子 活

性 の い ず れ も 阻 害 す る の に 対 し て 、低 分 子 領 域 に 分 布 す る HP は 第 Ⅹ a 因 子 を よ

り選択的に阻害し、第Ⅱa 因子を阻害する作用は前者より弱いことが明らかに

な っ た（ Andersson ら 1976）。さ ら に 精 査 が 進 み 、ATⅢ と 結 合 す る た め に 必 要

な HP 糖 鎖 の 最 少 単 位 は 五 糖 で あ る こ と が 報 告 さ れ た （ Thunberg ら 1982）。

ま た 、 出 血 傾 向 の 助 長 を 含 め た 多 く の 副 作 用 が HP の 分 子 量 の 低 下 に 伴 っ て 低

- 6-
減 さ れ る こ と が 注 目 さ れ て 以 来 、HP を 化 学 的 、あ る い は 酵 素 的 に 分 解 す る 方 法

の 研 究 が 進 み 、 低 分 子 HP（ Low molecular weight heparin, LMWH ） が 開 発 さ

れ た 。そ の 種 類 、ま た 解 重 合 の 方 法 は 多 様 で あ る が（ Linhardt ら 1990）現 在 、

日 本 国 内 で 流 通 し て い る 血 液 透 析 適 応 の LMWH に つ い て 、ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ

ウ ム（ dalteparin sodium, DN ）、レ ビ パ リ ン ナ ト リ ウ ム（ reviparin sodium, RN ）

は 亜 硝 酸 分 解 、 パ ル ナ パ リ ン ナ ト リ ウ ム （ parnaparin sodium, PN ） は 過 酸 化

水 素 等 を 用 い た ラ ジ カ ル 分 解 に よ っ て HP を 低 分 子 化 す る こ と に よ り 製 造 さ れ

ている。

3. HP 製 剤 中 に 混 入 し た 不 純 物 に よ る 有 害 事 象

このように、その組成や製造原料に由来する不純物についても既知であり、

ま た 、 重 篤 な 副 作 用 の 報 告 も 僅 か で 、 世 界 中 で 古 く か ら 使 用 さ れ て き た HP で

あ る が 、 2008 年 初 頭 、 米 国 、 ド イ ツ な ど で HP 製 剤 の 急 速 静 注 投 与 が 原 因 と 思

わ れ る 死 亡 お よ び 他 の 副 作 用 に つ い て 、ア メ リ カ 食 品 医 薬 局 か ら 緊 急 報 告 が な

さ れ た （ U.S. F o o d a n d D r u g A d m i n i s t r a t i o n , F D A 2 0 0 8 ）。 使 用 さ れ た HP

製剤および原薬について、分析調査した結果、本来原薬中に大量に混入する可

能 性 が な い 過 硫 酸 化 コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 （ over-sulfated chondroitin sulfate ,

OSCS）が 確 認 さ れ た（ Guerrini ら 2008, Beyer ら 2008, Kishimoto ら 2008）。

ま た い く つ か の 薬 理 試 験 の 結 果 か ら 、 最 終 的 に 有 害 事 象 の 原 因 は OSCS に よ る

も の と 判 断 さ れ た 。 日 本 国 内 に お い て HP 製 剤 の 原 薬 は 、 す べ て 海 外 か ら 輸 入

さ れ て お り 、国 内 生 産 は 行 わ れ て い な い 。速 や か に 安 全 性 確 保 の た め 、HP の 純

度 試 験 法 お よ び 確 認 試 験 法 が 検 討 さ れ （ 橋 井 ら 2008a , 橋 井 ら 2008b , 掛 樋 ら

2008, 川 崎 ら 2008, 栫 ら 2009, 橋 井 ら 2010）、混 入 物 質 で あ る OSCS と CS-B

- 7-
（ DS）の 確 認 /純 度 試 験 と し て 1 H-NMR、イ オ ン 交 換 お よ び 逆 相 ク ロ マ ト グ ラ フ

ィ ー 等 の 実 施 が 薬 事 法 で 法 令 化 さ れ（ 厚 生 労 働 省 2008, 厚 生 労 働 省 2010）、最

終的な原薬の規格試験として義務づけられた。各原薬メーカーはこの規格試験

に 適 合 す る 原 薬 を 製 造 す る た め に 、 今 ま で 以 上 に 製 造 /分 画 方 法 の 至 適 化 、 ま た

各工程での品質管理の徹底が喫 緊 の 課 題 となった。

安 全 性 の 高 い HP 原 薬 を 製 造 す る た め に は 、
「各工程で目的外物質の基準値を

設 定 し 、上 述 の 試 験 に よ っ て 検 査 を 行 い 、適 合 し た 中 間 体 を 次 工 程 に 移 行 す る 」

こ と が 最 も 確 実 な 方 法 で あ る と 考 え ら れ る が 、上 述 の 各 試 験 法 は 頻 雑 で あ る 上 、

外注試験を行った場合はコストが高くなり、ひいては原薬価格の高騰にも繋が

る こ と が 懸 念 さ れ る 。そ の た め 、各 原 薬 メ ー カ ー で 、粗 原 料 で あ る CHP の 受 入

か ら 最 終 的 な HP 原 薬 の 粉 体 充 填 ま で の 各 工 程 に お い て 、 こ れ ら の 試 験 を す べ

て 実 施 す る こ と は 事 実 上 困 難 で あ る と い え る 。 ま た 、 Figure 1 に 示 す と お り 、

MS 製 造 メ ー カ ー 、特 に CHP の よ う な 粗 原 料 か ら 製 造 す る メ ー カ ー に お い て は 、

1 種 類 の MS の み を 製 造 す る こ と は 稀 で あ り 、 基 本 的 に 、 1） 異 種 生 物 由 来 の 粗

原 料 か ら 特 定 の MS を 個 別 に 製 造 す る （ Figure 1A）、 あ る い は 2） 粗 原 料 中 の

MS を 分 画 し て 何 種 類 か の MS を 製 造 す る 場 合（ Figure 1B）が 多 い 。そ の た め 、

粗原料あるいは中間体の取り違え、また製造工程におけるラインおよび各機器

の 洗 浄 不 良 等 に よ っ て は 、 目 的 と す る MS 中 に 目 的 外 の MS が 混 入 す る 可 能 性

が 常 に あ る こ と を 理 解 し な け れ ば な ら な い 。 特 に 、 HP と 同 種 同 効 薬 で あ る

LMWH に は 、 現 在 上 述 の 試 験 、 あ る い は そ れ に 代 わ る 確 認 / 純 度 試 験 は 義 務 づ

け ら れ て い な い 。こ の こ と か ら 、HP と 同 一 工 場 、す な わ ち 同 一 生 産 ラ イ ン を 使

用 す る 頻 度 が 高 い LMWH に つ い て は 、HP と 同 様 に 安 全 性 を 担 保 、あ る い は 向

上 さ せ る た め の 何 ら か の 工 程 管 理 の 手 段 が 必 要 で あ る 。 そ し て 、 HP お よ び

- 8-
LMWH 中 に 目 的 外 の MS の 残 留 を 低 減 す る よ う な 精 製 /分 画 方 法 を 製 造 工 程 に

導 入 す る こ と に よ り 、高 純 度 の HP お よ び LMWH を 安 定 供 給 で き る 製 造 管 理 法

を確立することが喫 緊 の 課 題 である。

4. 本 研 究 の 目 的

本論文では、医療分野で世界的に広く普及し、血液透析時の血液凝固防止お

よ び 血 栓 塞 栓 症 予 防 等 の 目 的 で 用 い ら れ て い る HP お よ び LMWH 製 品 の 安 全 性

確 保 と 安 定 供 給 を 目 的 と し て 、よ り 簡 便 な 純 度 確 認 法 お よ び エ タ ノ ー ル（ EtOH）

分画による効率的な原薬の精製法について研究を行った。

ま ず 、第 ２ 章 で は 、各 種 MS の 純 度 試 験 を 確 立 す る 目 的 で 、CHP、HP、LMWH、

お よ び HP と 同 様 に 、天 然 物 か ら 抽 出 し て 調 製 さ れ る MS で あ る CSF、KS お よ

び HS に つ い て 、ゲ ル ろ 過 HPLC 法 を 用 い て 、各 MS 溶 液 の 示 差 屈 折（ refractive

index, RI）と 紫 外 吸 収（ ultra violet, UV）測 定 を 行 い 、そ の 分 子 量 分 布 の 確 認 、

ま た 、 RI と UV の ク ロ マ ト グ ラ ム 形 状 の 比 較 を 行 っ た 。 ま た 、 そ れ ら の 亜 硝 酸

分解処理に対する反応性、すなわち分解処理前後での分子量分布の変化を確認

した。

第 ３ 章 で は 、 高 純 度 HP の 工 業 的 製 造 法 を 確 立 す る 目 的 で 、 試 験 用 お よ び 商

業 用 HP 原 薬 の EtOH 分 画 処 理 に よ る 高 純 度 化 に つ い て 検 討 し た 。ま た 、EtOH

分 画 に よ り 得 ら れ た 各 画 分 に つ い て 、 亜 硝 酸 分 解 処 理 /ゲ ル ろ 過 HPLC お よ び

1 H-NMR 分析を行って、それらの純度を確認した。

第 ４ 章 で は 、 高 純 度 LMWH の 工 業 的 製 造 法 を 確 立 す る 目 的 で 、 汚 染 モ デ ル

LMWH と し て 高 分 子 DS お よ び 高 分 子 OSCS を 添 加 し た 試 験 用 DN お よ び 商 業

用 DN 原 薬 の EtOH 分 画 処 理 に よ る 高 純 度 化 に つ い て 検 討 し た 。 ま た 、 得 ら れ

- 9-
Figure 1. Processing flow of MS products and OSCS contamination pathway to MS products.
(A), Products from specific raw-material. ; (B), Products from porcine intestinal mucosa.

-10-
た 各 画 分 を 亜 硝 酸 分 解 処 理 /ゲ ル ろ 過 HPLC お よ び 1 H-NMR 分 析 に よ り 、LMWH

の 確 認 /純 度 試 験 を 実 施 し た 。

-11-
第 2 章 各ムコ多糖の分子量分布および亜硝酸分解に対する

反応性の確認

緒言

MS は 、基 本 的 に 生 物 由 来 の 多 糖 類 で あ り 、そ の 多 く は 各 生 物 の 体 液 、ま た は

器 官 /組 織 中 に 存 在 す る 。 製 造 さ れ る MS に よ り 、 そ の 工 業 的 生 産 に 用 い ら れ る

粗原料は異なり、哺乳類である牛、豚、羊や家鶏等の家畜および鮫、イカ等の

水産物、そして甲殻類、微生物由来のものまで多岐に亘っている。それらの粗

原 料 か ら 抽 出 /製 造 さ れ た MS の 用 途 も 、 ま た 様 々 で 、 健 康 食 品 用 の サ プ リ メ ン

ト、化粧品の添加剤、研究試薬、そして医薬品等で広範囲に利用されている。

研 究 目 的 で 、 個 別 あ る い は そ の 対 照 と し て 数 種 類 の MS を 混 合 し た も の を 検 体

と し て 、 糖 鎖 構 造 あ る い は 構 成 糖 の 確 認 を 、 NMR、 COSY 等 を 用 い て 分 析 を 行

っ た 報 告 例 は 多 い 。 し か し な が ら 、 各 MS 製 造 工 程 時 の 品 質 管 理 、 す な わ ち 、

製 造 す る MS 製 品 に お け る 他 の MS の 残 留 の 度 合 い を 確 認 す る 目 的 で の 分 析 方

法 に 関 す る 報 告 は ほ と ん ど さ れ て い な い 。 各 MS 最 終 製 品 の 純 度 を 上 述 の 試 験

で確認することは可能であるが、製造工程毎にこれらの試験を実施することは

極 め て 煩 雑 で あ り 、ま た 各 製 品 の 高 コ ス ト 化 に 繋 が る 懸 念 が あ る 。し か し Figure

1 に 示 し た と お り 、 多 く の MS は 同 一 工 場 で 処 理 、 ま た 精 製 さ れ て い る 場 合 が

多 く 、 目 的 と す る MS 製 品 へ の 他 の MS の 混 入 に 対 す る リ ス ク 管 理 は 必 須 で あ

り 、こ れ は す べ て の MS 原 料 製 造 メ ー カ ー 、ま た 、MS 原 料 を 用 い た 最 終 製 品 を

製 造 /販 売 す る メ ー カ ー に と っ て 重 要 で あ る と 考 え ら れ る 。

MS の 酸 性 条 件 下 で の 亜 硝 酸 処 理 に 対 す る 挙 動 に つ い て 、特 に 、 HP は 分 解 さ

れ て 低 分 子 化 し 、 CSF は 分 解 さ れ な い こ と が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、 上 述 の 分

析 方 法 よ り も 、 簡 便 か つ 効 果 的 な 製 造 工 程 時 の 純 度 確 認 と し て 、 1) 各 MS の 酸

-12-
性 条 件 下 で の 亜 硝 酸 処 理 、そ し て 、2) ゲ ル ろ 過 HPLC 法 に よ る そ れ ら の 分 子 量

分 布 推 移 の 分 析 を 組 み 合 わ せ る こ と に よ り 、 各 MS 間 に 残 留 す る 他 の MS あ る

いは不純物を確認する方法が構築できるのではと考えられた。

そ こ で 本 研 究 で は 、HP 群（ HP 粗 原 料 で あ る CHP お よ び HP）と そ の 低 分 子

化 MS で あ る LMWH 群（ DN, PN お よ び RN）、さ ら に 、健 康 食 品 、化 粧 品 、試

薬および医薬品原料として使用される、主に哺乳動物と水産動物に由来する 7

種 類 の MS 高 純 度 品 （ CSF, KS お よ び HS）、 そ し て 、 異 な る MS か ら な る 2 種

類 の MS 混 合 品（ MS-I お よ び MS-Ⅱ ）に つ い て 、ゲ ル ろ 過 HPLC 法 を 用 い て 、

そ れ ら の 分 子 量 分 布 を 確 認 し た 。ま た 、LMWH 群 を 除 く 各 MS に つ い て 、ゲ ル

ろ 過 HPLC 法 を 用 い て 、そ れ ぞ れ の 亜 硝 酸 分 解 に 対 す る 反 応 性 の 確 認 を 行 っ た 。

-13-
実験材料と方法

1. 供 試 材 料

HP 群 の CHP-T（ 豚 腸 粘 膜 由 来 、主 な 夾 雑 MS と し て 、CS-B（ DS）を 約 17.8%

前 後 含 有 ）お よ び HP-T（ 豚 腸 粘 膜 由 来 、高 純 度 精 製 品 ）は 扶 桑 薬 品 工 業 株 式 会

社 よ り 供 与 さ れ た も の を 使 用 し た 。ま た 、LMWH 群 で あ る DN、PN お よ び RN

は 試 験 用 LMWH 原 薬（ い ず れ も 豚 腸 粘 膜 由 来 ）を 使 用 し た 。CSF の A、B、C、

D お よ び E 型（ CS-A , CS-B（ DS）, CS-C, CS-D, CS-E）の 5 種 類（ そ れ ぞ れ 、

ク ジ ラ 軟 骨 、 豚 皮 、 鮫 軟 骨 、 鮫 軟 骨 、 イ カ 軟 骨 由 来 ）、 KS（ 牛 角 膜 由 来 ） お よ

び HS（ 牛 腎 臓 由 来 ） は 、生 化 学 工 業 （ 株 ）か ら 購 入 し た （ 生 物 由 来 、 試 薬 特 級

品 ）。 ま た 、 MS 参 照 物 質 I（ MS- I） は 、 豚 小 腸 粘 膜 由 来 の 低 分 子 MS を 、 HS：

CS-B（ DS）： CS-C＝ 約 8:1.5:0.5（ 重 量 比 ）と な る よ う に 調 製 し 、MS 参 照 物 質

Ⅱ（ MS-Ⅱ ）は 牛 気 管 軟 骨 由 来 の MS 混 合 物（ CS-A：CS-C＝ 約 7:3）を 用 い た 。

そ の 他 の 試 薬 は 試 薬 特 級 品 、あ る い は そ れ 以 上 の も の（ 和 光 純 薬 工 業（ 株 ）製 ）

を用いた。

2. ム コ 多 糖 の 亜 硝 酸 分 解 処 理

あ ら か じ め 注 射 用 水 に 溶 か し た 各 検 体 溶 液 に 、 検 体 と NaNO 2 の 重 量 比 が 1 :

0.06 と な る よ う に NaNO 2 を 加 え て 攪 拌 し た 後 、 4mol/L HCl で pH を 約 1.5 に

調 整 し た 。30 分 間 攪 拌 し た 後 、2mol/L NaOH で pH を 5.0 に 調 整 し 、ゲ ル ろ 過

HPLC の 試 料 と し た 。 こ れ ら の 処 理 は す べ て 氷 冷 下 で 行 っ た 。

3. ゲ ル ろ 過 HPLC に よ る 分 子 量 分 布 の 確 認

HPLC 法 に よ る 各 試 験 物 質 の 分 子 量 分 布 の 確 認 は 、第 15 改 正 日 本 薬 局 方（ 厚

-14-
生 労 働 省 2006）に 記 載 さ れ て い る 方 法 の カ ラ ム 本 数 、試 料 を 秤 量 す る 量 お よ び

試料導入量等を一部改変した方法で行った。各分析試料は、移動相に溶解した

各 検 体 の 終 濃 度 が 1%（ w/v） に な る よ う に 調 製 し 、 島 津 製 作 所 （ 株 ） 製 の 分 析

機 器 を 使 用 し て RI お よ び UV シ グ ナ ル を 測 定 し た 。使 用 し た 機 器 お よ び 分 析 条

件 は 以 下 の 通 り で あ る 。 管 理 シ ス テ ム , LC solution； ポ ン プ , LC-10AV vp； 検

出 器 , 紫 外 吸 光 光 度 計 （ SPD-10AV vp ； 測 定 波 長 , 234nm ） お よ び 示 差 屈 折 計

（ RID-10A）
；カ ラ ム お よ び ガ ー ド カ ラ ム , TSKgel G-2000SWXL（ 5μ m, 7.8mm

I.D.×300mm, TOSO 製 （ 株 ）） , TSKgel guardcolumn SWXL （ 5μ m, 6.0mm

I.D.×40mm, TOSO 製 （ 株 ））； カ ラ ム 温 度 , 40 ℃ ； 移 動 相 , 0.2mol/L Na 2 SO 4

（ pH5.0）； 流 速 , 0.5mL/min； 試 料 導 入 量 , 25µL。

-15-
結果と考察

は じ め に 、 各 検 体 の RI と UV 測 定 に よ る HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム の ピ ー ク 形

状 を 比 較 し た 。分 析 結 果 に つ い て 、HP 群 お よ び LMWH 群 を Figure 2 に 、CSF

を Figure 3 に 、 そ し て HS、 KS、 MS-Ⅰ お よ び MS-Ⅱ を Figure 4 に そ れ ぞ れ

示した。

HP 群 お よ び LMWH 群 の RI ク ロ マ ト グ ラ ム の 結 果 （ Figure 2）、 す べ て の 試

料 で 24.0 分 付 近 に 塩 類 に 由 来 す る ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。ま た 、HP 群 の CHP-T

お よ び HP-T で は 保 持 時 間 10.0～ 23.0 分 に MS 糖 鎖 に 由 来 す る 主 要 ピ ー ク が 検

出 さ れ た 。し か し HP-T で は 15.1 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ ピ ー ク の み が 確 認

さ れ た の に 対 し て 、 CHP-T で は 、 10.8 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ 小 ピ ー ク が 1

つ 、 主 要 ピ ー ク と し て 、 13.0 分 付 近 お よ び 14.7 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ 2

ピ ー ク が 重 な り 合 っ て 確 認 さ れ た 。 高 純 度 に 精 製 さ れ た HP-T の ピ ー ク 頂 点 が

15.0 分 付 近 で あ る こ と か ら 、 10.8 分 お よ び 13.0 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を 有 す る

物 質 は HP-T よ り 高 分 子 の MS 由 来 の 物 質 で あ り 、 特 に 、 そ の RI 面 積 値 か ら 、

CHP-T 中 に 約 17.8%存 在 す る CS-B（ DS） お よ び 他 の 夾 雑 MS に 由 来 す る も の

であると推測した。

各 LMWH の ピ ー ク 頂 点 に つ い て は 、DN は 19.5 分 付 近 、PN は 20.4 分 付 近 、

そ し て RN は 20.7 分 付 近 で あ っ た 。 そ の 分 子 量 分 布 は い ず れ も 異 な っ て お り 、

各 保 持 時 間 か ら DN、 PN、 RN の 順 に 低 分 子 領 域 に 移 行 し て い る こ と が 確 認 さ

れ た 。こ れ は 各 LMWH の 出 発 物 質 、あ る い は 製 造 方 法 の 違 い に よ る も の と 考 え

ら れ た 。ま た 、DN で は 12.7 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を 有 す る 小 ピ ー ク を 確 認 し た 。

ま た 、 DN と RN で は 鋭 い 形 状 の ピ ー ク が 10 前 後 確 認 さ れ た が 、 PN で は 比 較

的 ブ ロ ー ド な ピ ー ク 形 状 で あ っ た 。 こ れ は DN と RN が 亜 硝 酸 分 解 法 に よ っ て

-16-
Figure 2. Chromatograms of HP and LMWH analyzed on HPLC equipped with RI and UV
detectors.

-17-
低 分 子 化 さ れ て 二 糖 単 位 の 糖 鎖 が 段 階 的 に 蓄 積 し た こ と 、一 方 、PN が 過 酸 化 水

素 等 を 用 い た 分 解 法 に よ っ て 比 較 的 ラ ン ダ ム に 分 解 /低 分 子 化 さ れ た 糖 鎖 が 蓄

積したことに起因すると推測した。

UV ク ロ マ ト グ ラ ム で は 、CHP-T で は 10.7 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ 小 ピ ー

ク 、主 要 な ピ ー ク と し て 12.3 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ ブ ロ ー ド な ピ ー ク 、そ

し て 23.7 分 付 近 に 比 較 的 高 い ピ ー ク 頂 点 を も つ ピ ー ク が 、そ れ ぞ れ 1 つ ず つ 確

認 さ れ た （ Figure 2）。 RI と UV ク ロ マ ト グ ラ ム を 全 体 的 に 比 較 し た 場 合 、 RI

と UV の ピ ー ク 面 積 値 お よ び ピ ー ク 高 さ に 相 関 性 は な い と 考 え ら れ た 。 検 出 法

の 違 い に よ る こ の ピ ー ク 形 状 の 差 異 に つ い て は 、CHP-T の 原 料 で あ る 豚 腸 粘 膜

に 由 来 す る プ ロ テ オ グ リ カ ン に よ り UV の 吸 収 が 増 加 し て い る も の と 考 え ら れ

た 。 特 に 、 保 持 時 間 15.0～ 24.0 分 付 近 の ピ ー ク に つ い て は 、 本 来 MS の 重 量 を

反 映 す る RI の 面 積 値 お よ び ピ ー ク 形 状 と 全 く 相 関 性 が 確 認 で き な い こ と か ら 、

「 HP に 結 合 、あ る い は 単 体 で 夾 雑 し て い た 粗 原 料 由 来 の 低 分 子 の ペ プ チ ド グ リ

カ ン 断 片 」、 あ る い は ペ プ チ ド 、 核 酸 、 そ の 他 の 成 分 に よ り 、 UV の 吸 収 が 増 加

したと考えられた。

HP-T に つ い て 、 保 持 時 間 10.0～ 20.0 分 に MS 糖 鎖 に 由 来 す る 主 要 ピ ー ク が

検 出 さ れ 、 そ の ピ ー ク 頂 点 は 15.0 分 付 近 で あ り 、 RI の 場 合 と か な り 近 い ピ ー

ク 形 状 を 得 た 。 こ れ は HP-T 中 に 共 雑 物 が 極 め て 少 な い こ と 、 ま た そ の 精 製 工

程において糖鎖の酸化還元処理等が均等に行われているためと考えられた。

各 LMWH の UV ク ロ マ ト グ ラ ム に お け る 主 な ピ ー ク 頂 点 は 、 DN は 19.3 分

付 近 、 PN は 21.8 分 付 近 、 そ し て RN は 21.4 分 付 近 に 確 認 さ れ た 。 こ れ ら は

RI ク ロ マ ト グ ラ ム で の 各 LMWH の ピ ー ク 頂 点 に 比 較 的 近 い 位 置 で あ っ た こ と

から、製造過程において均等に各分子量域の酸化還元処理等が行われたものと

-18-
考 え ら れ た 。し か し 、DN に つ い て は RI で 確 認 さ れ た よ う に 、12.7 分 付 近 に ピ

ー ク が 確 認 さ れ た こ と か ら 、MS に 由 来 す る 物 質 が 存 在 す る と 考 え ら れ た 。こ の

夾 雑 物 質 は 、DN の 原 料 で あ る HP に 由 来 す る 高 分 子 の ペ プ チ ド グ リ カ ン 、低 分

子 化 さ れ な か っ た HP、あ る い は CSF 等 の HP 以 外 の MS で あ る と 推 測 さ れ た 。

ま た 、 い ず れ の LMWH に お い て も RI と UV の ピ ー ク 面 積 値 お よ び ピ ー ク 高 さ

の 相 関 性 が 低 い こ と 、 ま た 、 RI で MS 糖 鎖 が 確 認 さ れ な い 保 持 時 間 に お い て も

UV 吸 収 を 有 す る ピ ー ク が 確 認 さ れ る こ と か ら 、 CHP-T と 同 様 に MS 糖 鎖 お よ

びその糖鎖骨格に由来しない物質も検出されると考えられた。すなわち、比較

的 純 度 の 低 い MS に つ い て 、MS 糖 鎖 以 外 の 共 雑 物 を 検 出 す る 場 合 に は 、物 質 量

（ 数 ） を 示 す UV は 有 効 で あ る が 、 HP 群 あ る い は LMWH 群 の よ う な 精 製 さ れ

た MS に つ い て 他 の MS 共 雑 物 を 確 認 し よ う と す る 場 合 、UV 検 出 法 で 得 ら れ る

ピ ー ク 面 積 値 は 必 ず し も 夾 雑 す る MS 糖 鎖 本 体 の 質 量 を 反 映 す る も の で は な い

と 考 え ら れ 、 UV で の MS 糖 鎖 本 体 の 確 認 は 困 難 で あ る と 考 え ら れ た 。

CSF の RI ク ロ マ ト グ ラ ム に つ い て は 、 す べ て の 試 料 で 24.0 分 付 近 に 塩 類 に

由 来 す る ピ ー ク が 検 出 さ れ た （ Figure 3 ）。 CS-A、 CS-B（ DS ）、 CS-C、 CS-D

お よ び CS-E の い ず れ も 保 持 時 間 10.0～ 15.0 分 に MS 糖 鎖 に 由 来 す る 主 要 ピ ー

ク が 検 出 さ れ 、そ れ ぞ れ の 主 な ピ ー ク 頂 点 は 、そ れ ぞ れ 13.1、13.5、12.4、12.4

お よ び 12.1 分 付 近 で あ り 、 ピ ー ク 形 状 も 比 較 的 均 質 で あ っ た 。 し か し 、 CS-B

（ DS） お よ び CS-E に つ い て は 、 主 ピ ー ク と は 別 に 、 CS-B（ DS） は 11.5 分 、

CS-E は 11.0 分 付 近 に 僅 か な ピ ー ク が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 UV ク ロ マ ト グ ラ ム

（ Figure 3） で は 、 CS-A、 CS-B（ DS）、 CS-C、 CS-D お よ び CS-E の い ず れ も

保 持 時 間 10.0～ 15.0 分 に MS 糖 鎖 に 由 来 す る と 思 わ れ る 主 要 ピ ー ク が 検 出 さ れ 、

そ れ ぞ れ の 主 な ピ ー ク 頂 点 は 、 そ れ ぞ れ 13.1、 13.7、 12.4、 12.5 お よ び 12.1

-19-
Figure 3. Chromatograms of CSF analyzed on HPLC equipped with RI and UV detectors.

-20-
分 付 近 で あ っ た 。し か し CS-B（ DS）に つ い て は 11.4 分 に 僅 か な ピ ー ク を 、CS-E

に つ い て は 10.5 分 付 近 に 主 要 ピ ー ク と ほ ぼ 同 様 の ピ ー ク 面 積 値 お よ び ピ ー ク 高

さ を も つ ピ ー ク が 確 認 さ れ 、さ ら に 15.0 分 以 降 に も ブ ロ ー ド な 2 ピ ー ク（ 17.4

分 お よ び 23.3 分 付 近 ） が 確 認 さ れ た 。 CS-B（ DS） お よ び CS-E そ れ ぞ れ の 、

保 持 時 間 11.4 分 お よ び 10.5 分 付 近 の ピ ー ク に つ い て は 、い ず れ も RI ク ロ マ ト

グ ラ ム で 確 認 さ れ た 保 持 時 間 11.5 分 お よ び 11.0 分 付 近 の ピ ー ク に 相 当 す る も

の で あ る と 考 え ら れ 、こ れ ら は 高 分 子 の MS 由 来 の 物 質 で あ り 、CS-B（ DS）に

つ い て は 豚 皮 、CS-E に つ い て は イ カ 軟 骨 の プ ロ テ オ グ リ カ ン の 残 留 に 起 因 す る

も の と 考 え ら れ た 。 し た が っ て 、 CSF に お い て も 、 CSF 中 の 他 の MS の 確 認 と

い う 目 的 に お い て 、UV で 得 ら れ る 値 は 必 ず し も MS 糖 鎖 本 体 の 質 量 を 反 映 す る

も の で は な い と 考 え ら れ 、UV で の MS 糖 鎖 本 体 の 確 認 は 困 難 で あ る と 判 断 し た 。

KS、 HS、 MS-Ⅰ お よ び MS-Ⅱ の RI ク ロ マ ト グ ラ ム に つ い て も 、 す べ て の 試

料 で 24.0 分 付 近 に 塩 類 に 由 来 す る ピ ー ク が 確 認 さ れ た （ Figure 4, RI）。 KS、

HS、MS-Ⅰ お よ び MS-Ⅱ の い ず れ も 保 持 時 間 10.0～ 23.0 分 に MS 糖 鎖 に 由 来 す

る 主 要 ピ ー ク が 検 出 さ れ 、 主 な ピ ー ク 頂 点 は 、 そ れ ぞ れ 13.8、 13.0、 21.7 お よ

び 13.5 分 付 近 で あ っ た 。そ し て MS-Ⅱ に つ い て は 、主 要 ピ ー ク と は 別 に 、22.8

分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を 有 す る ブ ロ ー ド な ピ ー ク が 確 認 さ れ た 。UV ク ロ マ ト グ ラ

ム（ Figure 4, UV） に つ い て は 、 各 主 要 ピ ー ク 以 外 に 、 KS で は 主 要 ピ ー ク と 重

な る ブ ロ ー ド な ピ ー ク を 、 HS で は 22.4 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ 鋭 い ピ ー ク

を 、 MS-Ⅰ で は 23.8 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ 、 主 要 ピ ー ク と 重 な る ブ ロ ー ド

な ピ ー ク を 、そ し て MS-Ⅱ に つ い て は 22.4 分 付 近 に 主 要 ピ ー ク と ほ ぼ 同 様 の ピ

ー ク 面 積 値 お よ び ピ ー ク 高 さ を も つ ピ ー ク が 重 な っ て 確 認 さ れ た 。 こ れ ら MS

の 場 合 、HP 群 や LMWH 群 の 場 合 と は 異 な り 、主 要 ピ ー ク よ り 前 の 保 持 時 間 で

-21-
Figure 4. Chromatograms of HS, KS and MS analyzed on HPLC equipped with RI and UV
detectors.

-22-
顕 著 な UV 吸 収 を も つ 物 質 が 確 認 さ れ な か っ た こ と か ら 、 高 分 子 プ ロ テ オ グ リ

カ ン の 夾 雑 は 少 な い が 、低 分 子 の ペ プ チ ド グ リ カ ン 断 片 、あ る い は ペ プ チ ド 、 核

酸 、 そ の 他 の 成 分 が 各 MS に 結 合 、 あ る い は 単 体 で 夾 雑 し て い た こ と に よ り 、

低 分 子 領 域 の UV の 吸 収 が 増 加 し た と 推 測 さ れ た 。し た が っ て 、KS、HS、MS-

Ⅰ お よ び MS-Ⅱ に お い て も 、試 料 中 に 夾 雑 す る MS の 確 認 と い う 目 的 に お い て 、

UV で 得 ら れ る 値 は 必 ず し も MS 糖 鎖 本 体 の 質 量 を 反 映 す る も の で は な い と 考

え ら れ 、 UV で の MS 糖 鎖 本 体 の 確 認 は 困 難 で あ る と 考 え ら れ た 。 ま た 、 CSF、

KS お よ び HS の UV ク ロ マ ト グ ラ ム に お い て 、 保 持 時 間 26.0 分 付 近 に 小 さ な

ピ ー ク を 確 認 し た が 、 こ れ ら は 各 MS 調 製 時 に 用 い た 有 機 溶 媒 に 由 来 す る も の

と推測された。

次 に 、LMWH 群 を 除 く 各 検 体 の 亜 硝 酸 分 解 処 理 を 行 っ た 後 、HPLC 分 析 を 行

っ た 。分 解 処 理 後 は 、さ ら に 、UV で の MS 確 認 が 困 難 に な る と 予 想 さ れ る こ と

か ら 、 RI ク ロ マ ト グ ラ ム の ピ ー ク 形 状 を 分 解 処 理 前 後 で 比 較 し た 。 分 析 結 果 に

つ い て 、 HP 群 を F i g u r e 5 に 、 C S F 、 K S お よ び H S を F i g u r e 6 に 、 そ し て

M S - Ⅰ と M S - Ⅱ に つ い て F i g u r e 7 に 示 し た 。C H P - T 、H P - T の い ず れ も 分 解

処 理 前 に 確 認 さ れ た 保 持 時 間 10.0～ 23.0 分 の MS 糖 鎖 に 由 来 す る 主 要 ピ ー ク が

減 少 し た （ Figure 5）。 す な わ ち 、 CHP-T の 主 要 2 ピ ー ク で あ っ た 13.0 分 付 近

お よ び 14.7 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ 重 な り 合 っ た 2 ピ ー ク の う ち 、14.7 分 付

近 の ピ ー ク は ほ ぼ 消 失 し た 。 ま た 、 13.0 分 付 近 の ピ ー ク は 分 解 さ れ ず 、 そ の ピ

ー ク 頂 点 が 分 解 処 理 後 に 13.1 分 付 近 に シ フ ト し た も の と 考 え ら れ た 。ま た 、分

解 処 理 前 に 確 認 さ れ た 10.8 分 付 近 の ピ ー ク も 分 解 処 理 後 に 10.9 分 付 近 に 確 認

さ れ た 。 こ れ ら 未 分 解 の ピ ー ク は 、 CHP-T 中 に 約 17.8%存 在 す る CS-B（ DS）

お よ び 他 の 夾 雑 MS に 由 来 す る も の で あ る と 推 測 さ れ た 。一 方 、HP-T に つ い て

-23-
Figure 5. Molecular weight shift of HP preparations de-polymerized with nitrous acid.

-24-
は CHP-T と 異 な り 、 13.0 分 付 近 に ピ ー ク は 確 認 さ れ な か っ た 。 ま た 、 保 持 時

間 18.0～ 24.0 分 の 間 に 、CHP-T お よ び HP-T で 、そ れ ぞ れ 23.3 分 、お よ び 22.9

分付近にそれぞれピーク頂点を有するに二糖単位のピークシフトを伴う分解に

よ り 低 分 子 化 さ れ た HP の 蓄 積 が 確 認 さ れ た 。こ の こ と か ら 、CS-B（ DS）の 存

在 に よ ら ず 、HP は 亜 硝 酸 分 解 処 理 に よ っ て 低 分 子 化 さ れ る と 考 え ら れ た 。ま た 、

24.0 分 付 近 に 塩 類 に 由 来 す る ピ ー ク 以 外 に 、26.0 分 付 近 に 新 た な ピ ー ク が 確 認

さ れ た が 、 こ れ は 未 反 応 の NaNO 2 等 に 由 来 す る ピ ー ク と 考 え ら れ た 。

CSF お よ び KS の R I ク ロ マ ト グ ラ ム の 結 果 （ Figure 6）、 い ず れ の 試 料 で も

分 解 処 理 前 に 確 認 さ れ た 保 持 時 間 10.0～ 15.0 分 に ピ ー ク 頂 点 を 有 す る 主 要 ピ ー

ク の ピ ー ク 形 状 は 、 ほ ぼ 変 動 せ ず 、 CHP-T お よ び HP-T の 場 合 の よ う に 二 糖 単

位 の ピ ー ク シ フ ト は 確 認 さ れ な か っ た 。 よ っ て 、 CSF お よ び KS は 亜 硝 酸 分 解

抵 抗 性 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。ま た 、 CS-B（ DS）お よ び CS-E の 主 要 ピ ー ク

の 前 に 確 認 さ れ た 小 ピ ー ク に つ い て は 、 保 持 時 間 に つ い て は CS-B（ DS） で は

11.5 分 か ら 11.2 分 付 近 に 、CS-E は 11.0 分 付 近 で 変 化 な く 、そ の ピ ー ク 形 状 に

も 大 き な 変 動 は 確 認 さ れ な か っ た 。 分 解 処 理 前 の UV ク ロ マ ト グ ラ ム の 結 果 を

併 せ て 考 え る と 、こ れ ら の ピ ー ク 成 分 は プ ロ テ オ グ リ カ ン の 状 態 で CS-B（ DS）

お よ び CS-E 中 に 残 存 し て い る 、亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 の MS で あ る と 推 測 さ れ た 。

ま た HS で は 、 分 解 処 理 前 の ピ ー ク 頂 点 は 13.0 分 で あ っ た が 、 分 解 処 理 後 の ピ

ー ク 頂 点 は 19.5 分 に シ フ ト し 、 ま た 、 保 持 時 間 12.0～ 24.0 分 に 二 糖 単 位 の ピ

ー ク シ フ ト を 伴 う 分 解 に よ り 低 分 子 化 さ れ た HS の 蓄 積 が 確 認 さ れ た （ Figure

6）。 こ の こ と か ら 、 HP と 同 様 に 、 HS は 亜 硝 酸 分 解 処 理 に よ っ て 低 分 子 化 さ れ

ると考えられた。

ま た 、MS 混 合 物 で あ る MS-Ⅰ お よ び MS-Ⅱ に つ い て 、MS-Ⅰ の R I ク ロ マ ト

-25-
Figure 6. Molecular weight shift of CSF, KS and HS de-polymerized with nitrous acid.
Upper charts show molecular distribution of intact MS and lower ones show that of de-
polymerized MS.

-26-
グ ラ ム の 結 果 、 HP 同 様 、 塩 類 お よ び 未 反 応 の NaNO 2 等 に 由 来 す る ピ ー ク が 確

認 さ れ た （ Figure 7）。 ま た 、 分 解 処 理 前 に 確 認 さ れ た 保 持 時 間 21.7 分 付 近 に

ピ ー ク 頂 点 を 有 す る 主 要 ピ ー ク が 減 少 し 、保 持 時 間 12.0～ 24.0 分 に 、23.6 分 付

近にピーク頂点を有する二糖単位のピークシフトを伴う分解により低分子化さ

れ た HS の 蓄 積 が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 18.5 分 付 近 に 、 MS-Ⅰ 調 製 時 に 添 加 し た

CS-B（ DS） お よ び CS-C が 未 分 解 の 状 態 で 確 認 さ れ た 。 こ の こ と か ら 、 HS は

他 の MS 存 在 下 に お い て も 、HS 単 体 の 場 合 と 同 様 に 亜 硝 酸 分 解 処 理 に よ っ て 低

分 子 化 さ れ る と 考 え ら れ た 。ま た 、牛 気 管 軟 骨 由 来 の CS-A お よ び CS-C 混 合 物

で あ る MS-Ⅱ の R I ク ロ マ ト グ ラ ム で は 、塩 お よ び NaNO 2 に 由 来 す る ピ ー ク を

除 き 、ピ ー ク 頂 点（ 13.0 分 付 近 ）お よ び ピ ー ク 形 状 に 変 動 が 確 認 さ れ な か っ た 。

これらのことから、ムコ多糖の起源である動物種は亜硝酸分解の感受性に大き

く影響しないことが示唆された。

-27-
Figure 7. Molecular weight shift of reference substances of MS de-polymerized with nitrous
acid.

-28-
要約

HP 群 （ CHP-T お よ び HP-T） と LMWH 群 （ DN, PN お よ び RN）、 ま た 、 由

来 の 異 な る 5 種 類 の CSF（ CS-A, CS-B（ DS） , CS-C, CS-D, CS-E） と KS お よ

び HS、 さ ら に MS 参 照 物 質 で あ る MS-I（ HS:CS-B： CS-C＝ 約 8:1.5:0.5）、

MS-Ⅱ（ CS-A：CS-C＝ 約 7:3）に つ い て ゲ ル ろ 過 HPLC 法 に よ り 、そ の 分 子 量

分 布 を RI お よ び UV 測 定 に よ り 確 認 し た 。 HP-T を 除 く す べ て の 検 体 で 、 RI

と UV ク ロ マ ト グ ラ ム 間 に 明 確 な 相 関 性 は 認 め ら れ な か っ た 。 ゲ ル ろ 過 HPLC

法 に お い て 、UV 測 定 に よ り MS 中 の そ の 他 の MS 夾 雑 物 を 確 認 す る 場 合 、精 製

が 不 十 分 あ る い は MS 以 外 の UV 吸 収 物 質 の 共 存 下 の 場 合 、UV 測 定 で は MS 糖

鎖 本 体 の 確 認 は 困 難 で あ り 、MS 糖 鎖 本 体 の 重 量 を 効 率 良 く 反 映 す る RI 測 定 に

よ る 確 認 が 有 効 で あ る と 考 え ら れ た 。LMWH 群 を 除 く 各 検 体 の 亜 硝 酸 分 解 処 理

を 行 っ た 後 、 HPLC 分 析 を 行 い 、 RI ク ロ マ ト グ ラ ム の ピ ー ク 形 状 を 分 解 処 理 前

後で比較した。

亜 硝 酸 分 解 処 理 に よ り 、 高 純 度 精 製 品 で あ る HP-T 中 の HP は す べ て 分 解 さ

れ た 。亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS は 確 認 さ れ な か っ た 。ま た 、夾 雑 物 質 と し て 、CS-B

（ DS） を 約 17.8%含 有 す る CHP-T で は 、 分 解 処 理 に よ っ て HP の み が 分 解 さ

れ 、 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS で あ る CS-B（ DS） は 分 解 さ れ ず 、 ピ ー ク と し て 検

出 可 能 で あ っ た 。こ の こ と か ら 、HP は 、単 体 あ る い は 他 の MS 存 在 下 に お い て

も、亜硝酸分解処理によって低分子化され、二糖単位のピークシフトを伴った

低 分 子 化 HP を 蓄 積 す る こ と が 確 認 さ れ た 。 CSF の す べ て の 型 お よ び KS は 亜

硝 酸 分 解 処 理 に よ り 分 解 し な か っ た の に 対 し 、HS で は 二 糖 単 位 の ピ ー ク シ フ ト

を 伴 う 分 解 と 低 分 子 化 が 確 認 さ れ た 。ま た 、MS 混 合 物 で あ る MS-Ⅰ お よ び MS-

Ⅱ に つ い て 、MS-Ⅰ 中 に 含 有 さ れ る HS は 、亜 硝 酸 分 解 処 理 に よ り 、二 糖 単 位 の

-29-
ピ ー ク シ フ ト を 伴 う 分 解 と 低 分 子 化 が 確 認 さ れ た が 、 他 の CS-B（ DS） お よ び

CS-C は 分 解 さ れ な か っ た 。 こ の こ と か ら 、 HS は 他 の MS 混 在 下 に お い て も 亜

硝 酸 分 解 に よ り 分 解 さ れ 、 そ の 反 応 性 は HS 単 体 の 場 合 と 変 わ ら な い こ と が 示

さ れ た 。 さ ら に 、 牛 気 管 軟 骨 由 来 の CS-A お よ び CS-C 混 合 物 の MS-Ⅱ に つ い

ては、ピーク形状は変動せず、亜硝酸分解抵抗性が確認された。これらのこと

から、ムコ多糖の起源である動物種は亜硝酸分解の感受性に大きく影響しない

ことが示唆された。

以 上 の こ と か ら 、 HP 中 の MS 不 純 物 、 例 え ば CSF あ る い は KS 等 を 確 認 す

る 場 合 、 亜 硝 酸 分 解 処 理 し た 検 体 に つ い て 、 ゲ ル ろ 過 HPLC 法 を 用 い て RI 測

定 を 行 い 、 分 子 量 分 布 の 推 移 、 す な わ ち 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS の 有 無 を 確 認 す

ることが有効であると考えられた。

-30-
第 3 章 エタノール分画処理によるヘパリンの精製、および

亜 硝 酸 分 解 と ゲ ル ろ 過 HPLC を 組 み 合 わ せ た 純 度 確

認試験の検討

緒言

第 2 章 で の 検 討 に お い て 、 CHP 中 の HP と HP 単 体 、 ま た 、 HS/CSF 混 合 物

と HS 単 体 は 亜 硝 酸 分 解 処 理 に よ っ て 二 糖 単 位 で 分 解 さ れ 、そ れ と 相 反 し て CSF、

ま た KS は 亜 硝 酸 分 解 に 対 し て 高 い 抵 抗 性 を 示 す こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 精

製 前 の CHP で も 確 認 さ れ た よ う に 、 ゲ ル ろ 過 HPLC 法 に よ り 、 亜 硝 酸 分 解 抵

抗 性 MS を 簡 便 に 検 出 で き る こ と も 確 認 さ れ た 。

2008 年 に 報 告 さ れ た OSCS 混 入 HP に よ る 有 害 事 象 の 発 生 以 降 、医 薬 品 と し

て 使 用 さ れ る HP 製 剤 の 原 料 と な る HP 原 薬 中 の 不 純 物 に 関 す る 規 定 は 厳 格 化

さ れ 、 そ の 他 の MS の 残 存 量 の 確 認 を 1 H-NMR 法 、 イ オ ン 交 換 お よ び 逆 相 ク ロ

マトグラフィー法等によって行い、各基準値をクリアすることが義務づけられ

た。

こ れ ま で 、HP 中 不 純 物 の 分 析 方 法 に 関 し て は 数 多 く 報 告 さ れ て い る が 、実 際

の 製 造 工 程 に お け る HP の 純 度 を 向 上 さ せ る た め の 検 討 に つ い て 、 ほ と ん ど 報

告 さ れ て い な い 。 そ の 理 由 と し て 、 基 本 的 に HP 製 品 の 製 造 方 法 は 製 造 メ ー カ

ー間で異なっており、その製造方法は各メーカーの秘匿事項となっている場合

が多い。したがって、共通の製造方法として基準化することが困難であり、各

製造メーカーが個別で対応しなければならないことが挙げられる。また、前述

の 各 試 験 は 、あ く ま で 最 終 的 な HP 原 薬 で の 試 験 設 定 で あ り 、HP の 製 造 工 程 毎 、

すなわち粗原料から各中間体の各段階で検査する場合には極めて煩雑であり、

-31-
ま た 、 工 程 管 理 上 の コ ス ト 上 昇 に も 繋 が る 。 し た が っ て 、 何 ら か の 理 由 で HP

製造工程時に不純物が混入した場合でも、最終製品へのキャリーオーバーが低

減 で き る HP の 調 製 方 法 、 ま た 各 製 造 工 程 に お い て 簡 便 に 不 純 物 の 確 認 が で き

る試験方法の確立が必要であると考えられる。

そ こ で 本 章 で は 、HP 中 の 不 純 物 を 効 率 良 く 除 去 す る 方 法 と し て 、エ タ ノ ー ル

（ 以 下 EtOH） 分 画 処 理 に よ る 精 製 に つ い て 検 討 し た 。 さ ら に 、 そ の 簡 便 な 評

価 方 法 と し て 、 第 2 章 で 確 認 し た 各 MS の 亜 硝 酸 分 解 に 対 す る 反 応 性 の 違 い を

利 用 し た 方 法 、 す な わ ち と 亜 硝 酸 分 解 と ゲ ル ろ 過 HPLC を 組 み 合 わ せ た 方 法 の

応用の可否についても検討した。

-32-
実験材料と方法

1. 供 試 材 料

OSCS 標 準 品 （ OSCS-STD） は （ 財 ） 医 薬 品 医 療 機 器 レ ギ ュ ラ ト リ ー サ イ エ

ン ス よ り 購 入 し た 。OSCS と CSF の 混 合 物 で あ る 粗 OSCS（ CSMS-CE1 お よ び

CSMS-CE2） は 、 日 本 バ ル ク （ 株 ） か ら 供 与 さ れ た 試 験 用 OSCS 含 有 UFH Na

塩 を 酸 加 水 分 解 後 に （ EtOH） で 再 結 晶 化 し 、 HP お よ び HS を 除 去 し た も の を

使 用 し た 。ま た 、 HP、 HS、CS-B（ DS）お よ び 約 12.5 %の OSCS を 含 有 す る

試 験 用 UFH Na 塩 （ OSHP-SH） は 、 CBC（ 株 ） よ り 供 与 さ れ た も の を 使 用 し

た 。 ま た 、 高 分 子 CS-B（ DS） 標 準 品 （ CS-B（ DS） -STD） は 、 自 家 調 製 し た

豚 小 腸 粘 膜 由 来 の MS 混 合 物 を 精 製 し た も の を 用 い た 。 分 画 試 験 で 用 い た 各

UFH に つ い て は 、 500g ス ケ ー ル で の 処 理 に 供 し た 試 験 用 UFH Na 塩

（ UFN-SP； 主 成 分 と し て HP を 、 ま た 他 の MS と し て HS、 CS-B（ DS） お よ

び CS-C を 含 有 ）は CBC（ 株 ）か ら の 供 与 品 を 用 い た 。ま た 、1g ス ケ ー ル で の

処 理 に 供 し た Na 塩 5 検 体 （ UFN1, UFN2, UFN3, UFN4, UFN5 ） お よ び Ca

塩 1 検 体 （ UFC） は 市 販 HP 製 剤 に 使 用 さ れ て い る 商 業 用 HP 原 薬 を 用 い た 。

な お 、 こ れ ら の 商 業 用 HP 原 薬 は す べ て 1 H-HMR 法 に よ る 純 度 確 認 試 験 に お い

て OSCS が 未 検 出 で あ っ た 。注 射 用 水 お よ び 生 理 食 塩 水 は 日 本 薬 局 方 適 合 品 を 、

ま た 、 EtOH を 含 む そ の 他 の 試 薬 は 試 薬 特 級 品 、 あ る い は そ れ 以 上 の も の （ 和

光純薬工業（株）製）を用いた。

2. ム コ 多 糖 の 亜 硝 酸 分 解 処 理

あ ら か じ め 注 射 用 水 に 溶 か し た 各 検 体 溶 液 に 、 検 体 と NaNO 2 の 重 量 比 が 1 :

0.06 と な る よ う に NaNO 2 を 加 え て 攪 拌 し た 後 、 4mol/L HCl で pH を 約 1.5 に

-33-
調 整 し た 。30 分 間 攪 拌 し た 後 、2mol/L NaOH で pH を 5.0 に 調 整 し 、ゲ ル ろ 過

HPLC の 試 料 と し た 。 こ れ ら の 処 理 は す べ て 氷 冷 下 で 行 っ た 。

3. ゲ ル ろ 過 HPLC に よ る 分 子 量 分 布 の 確 認

HPLC 法 に よ る 各 試 験 物 質 の 分 子 量 分 布 の 確 認 は 、第 15 改 正 日 本 薬 局 方（ 厚

生 労 働 省 2006）に 記 載 さ れ て い る 方 法 の カ ラ ム 本 数 、試 料 を 秤 量 す る 量 お よ び

試料導入量等を一部改変した方法で行った。各分析試料は、移動相に溶解した

各 検 体 の 終 濃 度 が 1%（ w/v） に な る よ う に 調 製 し 、 島 津 製 作 所 （ 株 ） 製 の 分 析

機 器 を 使 用 し て RI お よ び UV シ グ ナ ル を 測 定 し た 。使 用 し た 機 器 お よ び 分 析 条

件 は 以 下 の 通 り で あ る 。 管 理 シ ス テ ム , LC solution； ポ ン プ , LC-10AV vp； 検

出 器 , 紫 外 吸 光 光 度 計 （ SPD-10AV vp ； 測 定 波 長 , 234nm ） お よ び 示 差 屈 折 計

（ RID-10A）
；カ ラ ム お よ び ガ ー ド カ ラ ム , TSKgel G-2000SWXL（ 5μ m, 7.8mm

I.D.×300mm, TOSO 製 （ 株 ）） , TSKgel guardcolumn SWXL （ 5μ m, 6.0mm

I.D.×40mm, TOSO 製 （ 株 ））； カ ラ ム 温 度 , 40 ℃ ； 移 動 相 , 0.2mol/L Na 2 SO 4

（ pH5.0）； 流 速 , 0.5mL/min； 試 料 導 入 量 , 25µL。

4. 1H-NMR 法 に よ る ム コ 多 糖 の 確 認

1 H-NMR法 に よ る 各 試 験 物 質 の 確 認 は 、 厚 生 労 働 省 告 知 第 417号 （ 厚 生 労 働

省 2008）に 記 載 さ れ て い る 方 法 の 、試 料 濃 度 等 を 一 部 改 変 し て 次 の 条 件 で 行 っ

た 。 分 析 試 料 は 、 各 検 体 （ 25mg） を 、 3-ト リ メ チ ル シ リ ル プ ロ ピ オ ン 酸 ナ ト リ

ウ ム （ TSP ） -d 4 の 重 水 溶 液 （ 1→10000 ） 0.50mL に 溶 解 し て 調 製 し 、 ア ジ レ ン

ト テ ク ノ ロ ジ ー （ 株 ） の 分 析 機 器 を 使 用 し て 0～ 8ppmの シ グ ナ ル を 測 定 し た 。

使 用 し た 機 器 お よ び 分 析 条 件 は 以 下 の と お り で あ る 。 NMR 本 体

-34-
（ VNMRS-500PS ） , 分 析 ソ フ ト ウ ェ ア （ VnmrJ2.2C ） ； 温 度 ， 25 ℃ ； ス ピ ニ

ン グ ，オ フ ； デ ー タ ポ イ ン ト 数 ， 32768； ス ペ ク ト ル 範 囲 ， DHOの シ グ ナ ル を 中

心 に ± 6.0 ppm； パ ル ス 角 ， 90°； 繰 り 返 し パ ル ス 待 ち 時 間 ， 20秒 ； ダ ミ ー ス キ ャ

ン ， 4回 ； 積 算 回 数 ， HPの N-ア セ チ ル 基 の プ ロ ト ン の シ グ ナ ル の SN比 が 1000 以

上 得 ら れ る 回 数；ウ イ ン ド ウ 関 数 ，指 数 関 数（ Line broadening factor = 0.2Hz）。

5. エ タ ノ ー ル 分 画 処 理

U F N - S P の E t O H 分 画 処 理 は 、（ 八 藤 後 と 村 田 2 0 0 2 ） の 方 法 の 変 法 に よ

り 行 っ た 。U F N - S P 5 0 0 g を 1 0 L ホ ー ロ ー タ ン ク に 量 り 取 り 、生 理 食 塩 水 を

加 え て 5L と し た 後 、 EtOH 2.5L を 加 え て 激 し く 攪 拌 し た 。 白 濁 し た こ と

を 確 認 し た 後 、 室 温 で 24 時 間 静 置 し て 上 層 （ S1） お よ び 下 層 の コ ロ イ ド 状

沈 殿 物 （ P 1 ） の 二 層 に 分 配 し た （ F i g u r e 8 A , B ）。 回 収 し た S 1 を 別 の 3 0 L

ホ ー ロ ー タ ン ク に 移 し 、 さ ら に EtOH 20L を 加 え 、 激 し く 攪 拌 し た 。 一 方 、

P 1 は 別 の 3 0 L ホ ー ロ ー タ ン ク に 移 し 、生 理 食 塩 水 3 L を 加 え て 攪 拌 し た 後 、

再 度 、 EtOH 20L を 加 え て 激 し く 攪 拌 し た 。 い ず れ の 画 分 に つ い て も 24 時

間 静 置 し た 後 、タ ン ク 底 に 沈 殿 し た 白 色 沈 殿 物 を そ れ ぞ れ ブ フ ナ ー ロ ー ト 上

で 回 収 し 、 EtOH で 洗 浄 し た 後 、 五 酸 化 二 リ ン 存 在 下 、 室 温 に て 減 圧 乾 燥 し

た 。 乾 燥 後 に 得 ら れ た 白 色 粉 末 を HPLC お よ び NMR 分 析 に 供 し た 。

U F N 1 ～ 5 お よ び U F C に つ い て も 、同 様 に し て E t O H 分 画 処 理 を 行 い 、白

色 粉 末 を 回 収 し た（ F i g u r e 8 C ）。な お 、U F N 1 ～ 5 お よ び U F C に つ い て は 1 g

の 出 発 物 質 か ら 分 画 を 行 い 、 全 工 程 を 1/500 に ス ケ ー ル ダ ウ ン し て 実 施 し

た。

-35-
Figure 8. Fractionation of UFH by means of EtOH precipitation.
(A), appearance of UFN-SP after EtOH precipitation ; (B),
magnified view of the interface between the supernatant and the
precipitate ; (C), appearances of UFN1-5 and UFC after EtOH
precipitation.

-36-
結果と考察

は じ め に 、 OSCS を 含 有 す る 各 種 標 準 品 お よ び 参 照 物 質 の 亜 硝 酸 分 解 処 理 前

後 の HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム の ピ ー ク 形 状 を 比 較 し た 。 分 解 処 理 に 対 す る 挙 動 を

確 認 し た 結 果 を Figure 9 に 示 し た 。OSCS-STD の 亜 硝 酸 分 解 処 理 前 後 の ピ ー ク

頂 点 は 、 そ れ ぞ れ 保 持 時 間 14.5 分 付 近 お よ び 14.6 分 付 近 で あ っ た 。 ま た 、 分

解前後で、そのピーク形状はほぼ変動していないことから、本分解条件では、

OSCS-STD は 低 分 子 化 せ ず 、 亜 硝 酸 分 解 に 対 し て 抵 抗 性 で あ る こ と が 示 さ れ た

（ Figure 9, OSCS-STD）。そ れ に 対 し 、約 12.5 %の OSCS を 含 有 す る OSHP-SH

に つ い て （ Figure 9, OSHP-SH）、 分 解 処 理 前 は 、 第 ２ 章 で 確 認 し た HP-T と 比

較した場合、そのピーク形状とピーク頂点の保持時間は、ほぼ同様であった。

分 解 処 理 後 、保 持 時 間 22.5 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を 有 す る 二 糖 単 位 の ピ ー ク シ

フ ト を 伴 う 分 解 さ れ た HP の 蓄 積 が 確 認 さ れ た 。 し か し な が ら 、 こ の ピ ー ク と

は 別 に 、 保 持 時 間 11.8 分 、 お よ び 14.8 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を 有 す る 2 ピ ー ク

を 確 認 し た 。こ の 未 分 解 の ピ ー ク の う ち 、前 者 は 、第 2 章 の CHP-T 同 様 、UFH

中 に し ば し ば 残 存 す る CS-B （ DS ） と 推 測 し た 。 ま た 、 後 者 の ピ ー ク 形 状 は

OSCS-STD の そ れ と 似 て お り 、 未 分 解 物 の ピ ー ク の RI 面 積 値 は 分 解 前 の 約

12.1％ で あ っ た こ と か ら 、OSHP-SH 中 に 残 存 す る OSCS で あ る と 考 え ら れ た 。

そ れ ゆ え 、 OSCS は 、 CSF や KS と 同 様 に 、 他 の MS 混 在 下 で も 亜 硝 酸 分 解 抵

抗性を示し、ある程度定量的に検出可能であると考えられた。この結果は、分

解 方 法 の 相 異 よ る 低 分 子 ヘ パ リ ン 中 OSCS の 残 存 度 に つ い て 検 討 し た 報 告

（ Zhang ら 2008） と 一 致 し た 。

ま た 、 粗 OSCS に つ い て 、 CSMS-CE1 お よ び CSMS-CE2 の い ず れ も 亜 硝 酸

分 解 抵 抗 性 で あ る こ と が 確 認 さ れ た が 、 HPLC に お け る 未 分 解 物 の ピ ー ク は

-37-
CS-B（ DS） -STD に 近 い 分 子 量 を も ち 、 分 子 量 分 布 も そ れ と 似 て い た （ Figure

9, CS-B（ DS） -STD）。 こ れ ら の こ と か ら 、 粗 OSCS 中 の 未 分 解 物 ピ ー ク の 主

成 分 は 、し ば し ば UFH に 多 く 残 存 す る 、豚 腸 粘 膜 由 来 の 高 分 子 CS-B（ DS）で

あ る と 推 測 さ れ た 。ま た 、こ れ ら の 粗 OSCS 中 に 残 存 す る OSCS は CS-B（ DS）

と 比 較 し て 極 微 量 で あ っ た た め 、ピ ー ク と し て 確 認 で き な か っ た と 推 測 さ れ た 。

EtOH分 画 未 処 理 の UFN-SP、処 理 後 に 得 ら れ た 上 清（ S1）お よ び コ ロ イ ド 状

沈 殿 物 （ P1） 、 ま た S1を 再 度 EtOH分 画 し て 得 た 沈 殿 物 （ P2） を そ れ ぞ れ 再 結

晶 し て 得 た 白 色 粉 末 に つ い て の HPLC お よ び NMR 分 析 結 果 を Figure 10 に 示 し

た 。各 検 体 の HPLC分 析 の 結 果（ Figure 10, HPLC）、す べ て の 試 料 で 保 持 時 間

24.0分 付 近 に 塩 類 に 由 来 す る ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。 保 持 時 間 10〜 20分 に ピ ー ク

頂 点 を 有 す る MS糖 鎖 由 来 の ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。 未 処 理 の UFN-SPと 比 較 し て 、

P1画 分 で は ピ ー ク 頂 点 よ り 高 分 子 側 で の ピ ー ク の 立 ち 上 が り と テ ー リ ン グ の 減

少 が 確 認 さ れ た 。一 方 、S1画 分 で は 、保 持 時 間 13.5分 お よ び 16.0分 付 近 に 2つ の

ピ ー ク が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 P2画 分 で は 、 保 持 時 間 12.9分 付 近 の ピ ー ク の み が

確 認 さ れ た 。UFN-SPの NMR分 析 の 結 果（ Figure 10, NMR）、2.04ppmと 2.08ppm

の 2シ グ ナ ル を 確 認 し た 。 P1画 分 で は 2.04ppmの 1シ グ ナ ル の み が 確 認 さ れ た 。

ま た 、 S1で は 2.04ppmと 2.08ppmの 2シ グ ナ ル を 確 認 し た が 、 UFN-SPと 比 較 し

て 、2.04ppmの シ グ ナ ル に 対 す る 2.08ppmの シ グ ナ ル 強 度 が 増 加 し た 。さ ら に 、

P2画 分 で は 、 2.04ppmの シ グ ナ ル が 大 き く 減 少 し 、 2.08ppm が 主 要 な シ グ ナ ル

と な っ た 。今 回 の NMR分 析 条 件 で は 、2.04ppm付 近 に HPに 由 来 す る シ グ ナ ル が

得 ら れ 、 2.08ppm 付 近 に は DS に 由 来 す る シ グ ナ ル 、 そ し て 2.15ppm 付 近 に は

OSCSに 由 来 す る シ グ ナ ル が 得 ら れ る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 橋 井 ら 2008a）。

こ の こ と か ら 、 UFN-SPの EtOH分 画 処 理 に よ り 、HP以 外 の 物 質 の 多 く は S1に

-38-
Figure 9. Molecular weight shift of OSCS standard, OSCS-containing UFH and crude OSCS
resulting from nitrous acid de-polymerization.
(a), OSCS-STD ; (b), de-polymerized OSCS-STD ; (c), OSHP-SH ; (d), de-polymerized OSHP-
SH ; (e), de-polymerized CSMS-CE1 ; (f), de-polymerized CSMS-CE2 ; (g), CS-B (DS) -STD.

-39-
Figure 10. HPLC and NMR analysis of UFN-SP fractionated with EtOH precipitation.
(a), UFN-SP ; (b), colloidal precipitate (P1) ; (c), supernatant (S1) ; (d), purified supernatant
after re-fractionation using EtOH of the supernatant fraction shown in (c).

-40-
移 行 し 、 P1へ の 残 留 は 僅 か で あ る と 考 え ら れ た 。

さ ら に 、EtOH分 画 未 処 理 の UFN-SP、処 理 後 に 得 ら れ た 上 清（ S1）お よ び コ

ロ イ ド 状 沈 殿 物 （ P1） 、 ま た S1を 再 度 EtOH分 画 し て 得 た 沈 殿 物 （ P2） を そ れ

ぞれ再結晶して得た白色粉末をそれぞれ亜硝酸分解処理した検体についての

HPLCお よ び NMR分 析 結 果 を Figure 11に 示 し た 。す べ て の 試 料 で 、保 持 時 間 の

約 13.0分 付 近 に 分 解 抵 抗 性 MSの ピ ー ク が 確 認 さ れ た （ Figure 11, HPLC） 。 し

か し 、 UFN-SPと 比 較 し て 、 P1画 分 に お け る そ の ピ ー ク は 些 少 で あ っ た の に 対

し 、 S1画 分 で は ピ ー ク 面 積 の 増 加 が 確 認 さ れ た 。 P2 画 分 で は 、 分 解 抵 抗 性 MS

の ピ ー ク が 、 よ り 明 確 に 確 認 さ れ た 。 こ れ ら 試 料 の NMRシ グ ナ ル は 2.04ppmお

よ び 2.08ppmが 主 で あ り 、 亜 硝 酸 分 解 未 処 理 の 各 画 分 の デ ー タ （ Figure 10） と

類 似 し て い た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 亜 硝 酸 分 解 処 理 の 前 後 で 、 各 MSの NMR分

析 に お け る メ イ ン シ グ ナ ル に は 大 き な 変 動 は な い と 推 測 さ れ た 。 ま た 、 S1画 分

に 含 ま れ る 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MSの 、 0～ 6ppmに お け る NMRシ グ ナ ル は 、 CS-B

（ DS）- STDと 同 様 の シ グ ナ ル 形 状 を 示 し た（ デ ー タ 示 さ ず ）。こ の こ と か ら 、

UFN-SP中 の 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 物 質 は 高 分 子 CS- B（ D S） で あ る と 推 測 さ れ た 。

全 MSに 占 め る 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MSの ピ ー ク の RI面 積 値 は 、 UFN-SPで は 分

解 前 の 面 積 値 の 1.16％ で あ っ た の に 対 し 、EtOH分 画 処 理 後 に 得 ら れ た P1中 の 分

解 抵 抗 性 MSピ ー ク の RI面 積 値 は 、 分 解 前 の 面 積 値 の 約 0.09％ で あ っ た （ Table

1）。こ の こ と か ら 、EtOH分 画 処 理 に よ り HPの 純 度 が 大 幅 に 高 ま っ た こ と が 確

認 さ れ た 。 ま た 、 500gの UFN-SPを EtOH分 画 処 理 し て 回 収 し た P1画 分 を 再

結 晶 化 /乾 燥 し て 得 ら れ た 白 色 粉 末 の 重 量 は 418.2g（ 回 収 率 83.6%） で あ っ

た こ と も 含 め 、 今 回 検 討 し た HPの EtOH分 画 処 理 は 、 実 製 造 に お い て も 有 効 な

精製方法であると推測された。

-41-
Figure 11. HPLC and NMR analysis of nitrous acid de-polymerized fractions of UFN-SP.
(a), UFN-SP ; (b), colloidal precipitate (P1) ; (c), supernatant (S1) ; (d), purified supernatant
after re-fractionation using EtOH of the supernatant fraction shown in (c).

-42-
Ta b l e 1 . C h a n g e s o f R I a r e a o f M S † c o n t a i n e d i n t h e U F N - S P f r a c t i o n a t e d w i t h e t h a n o l

Nitrous acid de -polyme rization Co mposit io n of Ratio of

Ethanol
un-degraded MS un-degraded
precipitation Un-treated a
Trea ted b
(B/A) MS c
(A) (B)

Un-treat ment
2,942,810 ± 1,624 34,064 ± 711 1.16×10-2 1.00
(intact)

Supernatant 3,145,815 ± 1,954 152,882 ± 260 4.86×10-2 4.20

-2
Colloidal
3,056,740 ± 1,647 2,831 ± 137 9.26×10-4 8.00×10
precipitate

Va l u e s a r e m e a n s ± S D ( n = 6 ) .

† M S ,   m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

a , To t a l a r e a o f M S w i t h o u t n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n .

b, RI area of un-degraded MS with NaNO2 eluted from 10.0 to 20.0 min on HPLC.

c, Ratio of un-degraded MS in fractio nated UFN -SP to that in the intact materia l.

-43-
 UFN1～ 5 お よ び UFC に つ い て 、各 検 体 の 亜 硝 酸 分 解 物 を 比 較 し た HPLC 分

析 結 果 を Figure 12 に 示 し た 。EtOH 分 画 処 理 前 の 各 UFH を 亜 硝 酸 分 解 す る と 、

い ず れ の 試 料 で も 、 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS の ピ ー ク が 確 認 さ れ た 。上 清 お よ び

コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 に 含 有 さ れ る MS の 分 子 量 分 布 の パ タ ー ン は 、と も に UFN-SP

の場合と良く似ていた（データ示さず）。また、コロイド状沈殿物を亜硝酸分

解 処 理 す る と 、主 要 な ピ ー ク 成 分 は 分 解 し た 。し か し 、保 持 時 間 13.0 分 付 近 の

亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS の ピ ー ク も 、 僅 か な が ら 確 認 さ れ た 。

EtOH 分 画 処 理 前 後 で の 各 検 体 の NMR 分 析 結 果 を Figure 13 に 示 し た 。EtOH

分 画 処 理 後 に す べ て の 検 体 に お い て 、2.08ppm 付 近 の シ グ ナ ル 強 度 が 減 少 し た 。

ま た 、 UFN4 に お い て 、 2.09ppm 付 近 に 大 き く シ グ ナ ル が 確 認 さ れ た が 、 こ れ

は製造工程において添加された過マンガン酸カリウムによる影響と推測された。

HPLCク ロ マ ト グ ラ ム に お け る ピ ー ク 面 積 の 計 算 結 果 か ら 、 UFN1～ 5お よ び

UFCに は 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 の 不 純 物 が 、 お よ そ 0.01％ ～ 0.35％ 含 有 さ れ て い る

こ と が 示 さ れ た （ Table 2） 。 ま た 、 そ れ ら ピ ー ク 成 分 の RI面 積 値 は 、 分 画 前 の

原 料 UFHの RI面 積 値 の 10％ ～ 30％ 程 度 ま で 減 少 し て い た （ Table 3） 。

製 造 方 法 が そ れ ぞ れ 異 な る 6原 薬 す べ て に お い て 、亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 物 質 の 含

量 が 低 下 し て い た こ と か ら 、 今 回 検 討 し た EtOH 分 画 は HPの 純 度 向 上 に 有 効 で

あると考えられた。

以 上 の よ う に 、本 研 究 で は HP製 造 工 程 に お い て HP以 外 の MS共 雑 物 質 を 除 去

す る 方 法 と し て 、EtOH分 画 処 理 が 有 効 で あ る こ と を 確 認 し た 。こ の 方 法 で 得 ら

れ た 精 製 HPは 、 HP 製 剤 の み な ら ず 、 不 純 物 に よ る 副 反 応 お よ び 最 終 製 品 へ の

コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン を 低 減 し た 、 付 加 価 値 の 高 い 新 規 HP 化 合 物 や LMWHの 原

料となり得ると考えられた。この方法は室温付近での操作でも充分な分離能を

-44-
Figure 12. HPLC chromatogram of nitrous acid de-polymerized colloidal precipitate from the
sodium and calcium salts of UFH products.

-45-
Figure 13. NMR spectrum of sodium and calcium salts of UFH products purified by EtOH
precipitation.

-46-
 Ta b l e 2 . R I a r e a o f n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n - r e s i s t a n t M S † i n d r u g s u b s t a n c e s

Nitrous acid de -polyme rization

Co mposit io n of
Products§ un-degraded MS
Un-treated a
Trea ted b (B/A)
(A) (B)

UFN 1 3,139,209 ± 2,372 8,714 ± 228 2.78×10-3

UFN 2 3,225,737 ± 2,988 11,122 ± 145 3.45×10-3

UFN 3 3,167,162 ± 3,880 303 ± 48 9.57×10-5

UFN 4 3,191,825 ± 1,933 607 ± 66 1.90×10-4

UFN 5 3,223,922 ± 2,427 2,275 ± 41 7.06×10-4

UFC 3,218,608 ± 1,363 2,528 ± 128 7.85×10-4

Va l u e s a r e m e a n s ± S D ( n = 3 ) .

† M S ,   m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

§ UFN, un-fractionated heparin sodium salt; UFC, un -fractionated heparin calcium salt.

a , To t a l a r e a o f M S w i t h o u t n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n .

b, RI area of un-degraded MS with NaNO2 eluted from 10.0 to 20.0 min on HPLC.

-47-
Ta b l e 3 . R I a r e a o f n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n - r e s i s t a n t M S † i n c o l l o i d a l p r e c i p i t a t e
res ulting from ethanol precipitation of drug substances

Nitrous acid de -polyme rization

Co mposit io n of Ratio of
§
Products un-degraded MS un-degraded
c
Un-treated a
Trea ted b (B/A) MS
(A) (B)

-4 -1
UFN 1 3,331,957 ± 3,447 2,723 ± 236 8.17×10 2.94×10

-4 -2
UFN 2 3,265,393 ± 4,494 1,039 ± 87 3.18×10 9.23×10

-5 -1
UFN 3 3,248,345 ± 2,006 98 ± 37 3.02×10 3.15×10

-5 -1
UFN 4 3,341,219 ± 2,229 152 ± 25 4.55×10 2.39×10

-4 -1
UFN 5 3,437,141 ± 2,585 479 ± 31 1.39×10 1.97×10

-4 -1
UFC 3,386,020 ± 3,052 486 ± 59 1.44×10 1.83×10

Va l u e s a r e m e a n s ± S D ( n = 3 ) .

† M S ,   m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

§ A b b r e v i a t i o n s a r e t h e s a m e a s s h o w n i n Ta b l e 2 .

a , To t a l a r e a o f M S w i t h o u t n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n .

b, RI area of un-degraded MS with NaNO2 eluted from 10.0 to 20.0 min on HPLC.

c , R a t i o o f u n - d e g r a d e d M S i n p r e c i p i t a t e t o t h a t i n e a c h i n t a c t m a t e r i a l s h o w n i n Ta b l e 2 .

-48-
確 保 で き る こ と か ら 、 バ ッ チ 操 作 で の HP回 収 が 容 易 で あ る 。 し た が っ て 、 イ オ

ン交換あるいはゲルろ過等のカラムクロマトグラフィー操作と比較して、作業

効率の向上が見込まれることから、製造コストの低減にも寄与できると推測さ

れた。特に、本調製方法を製造工程の最終段階で実施すること、また各製造工

程 で 亜 硝 酸 分 解 /HPLC法 に よ る 純 度 検 査 を 行 う こ と で 、高 品 質 な HP原 薬 を 安 定

的 に 調 製 で き る と 予 測 さ れ た 。今 後 、こ の 知 見 を 応 用 し 、様 々 な HP製 品 に お け

る 純 度 試 験 を 行 い 、混 入 MSの 除 去 が 可 能 で あ る こ と を 確 認 す る 必 要 が あ る と 考

えられた。

-49-
要約

未 分 画 ヘ パ リ ン （ UFH） の 純 度 試 験 法 、 お よ び UFH 中 の ヘ パ リ ン （ HP） 以

外 の ム コ 多 糖 類 （ MS ） 夾 雑 物 の 工 業 的 除 去 方 法 に つ い て 検 討 し た 。 ま ず 、 エ

タ ノ ー ル （ EtOH） 分 画 に よ る UFN-SP か ら の 不 純 物 を 簡 便 か つ 効 率 良 く 除 去

す る 手 法 を 開 発 す る た め 、 HP の 純 度 に EtOH 分 画 処 理 が 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し

た 。 過 硫 酸 コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 （ OSCS） 、 HP 以 外 の MS、 お よ び そ れ ら の 混

合 不 純 物 を 含 有 す る UFH Na 塩 （ OSHP-SH） 、 HP 含 量 を 低 減 し た 粗 OSCS

（ CSMS-CE1 お よ び CSMS-CE2）に つ い て 亜 硝 酸 分 解 処 理 を 行 い 、HPLC 法 に

よ り 分 解 物 の 分 子 量 分 布 を 測 定 し た 。 OSCS-STD は 分 解 処 理 前 後 で 分 子 量 分 布

の 変 動 は な く 、 分 解 抵 抗 性 で あ っ た 。 OSHP-SH 中 の 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 物 質 の

分 子 量 分 布 は OSCS-STD と 近 か っ た が 、 粗 OSCS 中 の 分 解 抵 抗 性 物 質 は

CSMS-CE1 お よ び CSMS-CE2 の 分 子 量 分 布 は コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 B 標 準 品

（ CS-B（ DS） -STD） に 近 か っ た 。 一 方 、 UFH Na 塩 （ UFN-SP） 、 商 業 用 の

UFH Na 塩 お よ び Ca 塩 に つ い て 、EtOH 分 画 処 理 を 行 っ た 。各 分 画 物 を HPLC

法 と 1 H-NMR 法 に よ り 分 析 し た 結 果 、す べ て の 検 体 で 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 物 質 は

上 清 に 移 行 し 、 HP は コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 と し て 濃 縮 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、

UFH の 調 製 工 程 に お い て 亜 硝 酸 分 解 / ゲ ル ろ 過 H P L C 法 に よ る 純 度 検 査 を 行

い 、 さ ら に 、 EtOH 分 画 処 理 を 実 施 す る こ と で 、 高 品 質 HP 原 料 を 安 定 的 に 調

製できると考えられた。

-50-
第 4 章 エタノール分画処理による低分子ヘパリンの精製、

お よ び 亜 硝 酸 分 解 と ゲ ル ろ 過 HPLC を 組 み 合 わ せ た

純度確認試験の検討

緒言

第 3 章 で の 検 討 に お い て 、EtOH 分 画 処 理 を 用 い る こ と に よ り 、HP 中 の 不 純

物 、特 に CS-B（ DS）を 効 率 良 く 除 去 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。

ま た 、そ の 評 価 方 法 と し て 、亜 硝 酸 分 解 / ゲ ル ろ 過 HPLC 法 が 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性

物 質 で あ る CS-B（ DS） あ る い は OSCS を 簡 便 に 検 出 す る 方 法 と し て 有 効 で あ

る こ と も 確 認 さ れ た 。前 述 の と お り 、HP の 純 度 試 験 、す な わ ち HP 中 の MS 不

純 物 に 関 す る 確 認 試 験 と し て 、米 国 、欧 州 お よ び 日 本 の 各 薬 局 方 で 1 H-NMR 法 、

イ オ ン 交 換 /逆 相 ク ロ マ ト 法 等 が 設 定 さ れ て い る 。 し か し な が ら 、 主 に HP を 原

料 と し て 製 造 さ れ る LMWH に つ い て は 、こ れ ら の 試 験 は 設 定 さ れ て い な い 。現

在 ま で に 、 HP/LMWH の 品 質 保 証 に 関 す る 日 米 E U 医 薬 品 規 制 調 和 国 際 会 議

（ I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c e o n H a r m o n i s a t i o n o f Te c h n i c a l R e q u i r e m e n t s

for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, ICH） に お い て も 、

HP/LMWH の 純 度 確 認 の た め の 検 討 、 ま た 今 後 の 検 討 項 目 に つ い て も 議 論 が な

さ れ て い る（ 石 井 ら 2011）。ま た 、OSCS お よ び CSF 等 の MS に 関 す る 各 試 験

に 加 え 、 HP 標 準 品 （ 橋 井 ら 2011）、 HP 中 の 核 酸 /タ ン パ ク 質 の 限 度 試 験 等 も

検 討 /報 告 さ れ て い る （ 橋 井 ら 2012）。 し か し HP 同 様 、 LMWH に お い て も 製

品の純度向上を目的とした製造方法の見直し、また、各製造工程の品質管理を

目 的 と し た MS 不 純 物 の 確 認 試 験 に 関 し て は 、 ほ と ん ど 報 告 さ れ て い な い 。 そ

の 理 由 と し て 、基 本 的 に HP お よ び LMWH 製 品 の 製 造 方 法 は 製 造 メ ー カ ー 間 で

-51-
異 な っ て お り 、そ の 製 造 方 法 は 各 メ ー カ ー の 秘 匿 事 項 と な っ て い る 場 合 が 多 い 。

したがって、共通の製造方法として基準化することが困難であり、各製造メー

カ ー が 個 別 で 対 応 し な け れ ば な ら な い こ と が 挙 げ ら れ る 。LMWH は 基 本 的 に 各

薬 局 方 の 試 験 に 合 格 し た HP を 原 料 と し て 、 化 学 処 理 あ る い は 酵 素 処 理 後 に 再

精 製 し て 製 造 さ れ る 場 合 が 多 い（ Linhardt と Gunay 1999）。そ の た め 、

「 LMWH

に MS 不 純 物 が 残 留 す る 可 能 性 は 低 い 」 と 考 え ら れ 、 他 の MS の 混 入 に 関 す る

確認試験については規格として設定されていない場合が多い。しかしながら、

HP と 同 様 に 豚 小 腸 粘 膜 中 に 存 在 す る CSF の よ う に 同 一 の 出 発 原 料 に 由 来 す る

MS に 対 す る 残 留 リ ス ク と 、OSCS の よ う に HP 以 外 の MS を 化 学 修 飾 し た 半 合

成 品 の MS の 混 入 リ ス ク は 、 ま た 別 の 問 題 と し て 捉 え る べ き で あ る 。 実 際 、 海

外 に お い て 、 OSCS 混 入 HP の よ う に 、 死 亡 事 例 を 含 む 有 害 事 象 の 報 告 は 無 い

が 、LMWH の 一 つ で あ る エ ノ キ サ パ リ ン ナ ト リ ウ ム（ enoxaparin sodium, EN）

製 剤 に つ い て 、 1 H-NMR 法 に よ る 分 析 の 結 果 、 ご く 微 量 の OSCS 様 の シ グ ナ ル

が 検 出 さ れ た こ と が 報 告 さ れ て お り（ U.K. Medicines and Healthcare products

Regulatory Agency, MHRA 2008）、 不 純 物 混 入 に 関 す る リ ス ク 管 理 は HP と 同

様 に 考 え る べ き で あ る 。現 状 で は LMWH 中 の MS 不 純 物 が 規 格 試 験 と し て 設 定

さ れ て い な い こ と も 鑑 み 、そ の 品 質 管 理 は LMWH の 各 製 造 工 程 中 で 確 実 に 行 う

必要がある。

そ こ で 本 章 で は 、LMWH 中 の 不 純 物 を 効 率 良 く 除 去 す る 方 法 と し て 、第 3 章

で 検 討 し た HP の EtOH 分 画 処 理 に よ る 精 製 方 法 、 ま た 、 そ の 簡 便 な 精 製 度 の

評 価 方 法 と し て 、 第 2 章 お よ び 第 3 章 で 検 討 し た HP の 亜 硝 酸 分 解 /ゲ ル ろ 過

HPLC 法 に よ る 純 度 確 認 法 に つ い て 、LMWH へ の 応 用 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し

た。

-52-
実験材料と方法

1． 供 試 材 料

DN 標 準 品 （ DN-W; 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 物 質 の 含 量 が 0.01%以 下 ） は 、 豚 腸 粘

膜 由 来 HP を 亜 硝 酸 分 解 し た も の を 粗 原 料 と し て 、抽 出 /精 製 し た も の を 用 い た 。

精 製 検 討 用 に 用 い た 高 分 子 DS の Na 塩 （ DSH） は 、 豚 小 腸 粘 膜 由 来 の MS 混

合 物 か ら 抽 出 /精 製 し た も の を 用 い た 。精 製 検 討 用 高 分 子 OSCS の Na 塩（ OSH）

（ 今 成 ら 1999）を 一 部 改 変 し 、三 酸 化 硫 黄 化 合 物 を 用 い て 鮫 軟 骨 由 来 の CSF
は、

を 過 硫 酸 化 処 理 し て 調 製 し た 。さ ら に 、精 製 検 討 用 DN（ DN-C）は DN-W に 、

DSH お よ び OSH を DN-W:DSH:OSH＝ 98.5:1.0:0.5（ 重 量 比 ）と な る よ う に 混

合 調 製 し た 。他 の DN 検 体（ DNG 1～ 3）は 市 販 DN 製 剤 に 使 用 さ れ て い る 商 業

用 DN 原 薬 を 用 い た 。 注 射 用 水 は 日 本 薬 局 方 適 合 品 を 、 ま た 、 塩 類 、 有 機 溶 媒

等 の そ の 他 の 試 薬 は 試 薬 特 級 品 、あ る い は そ れ 以 上 の も の（ 和 光 純 薬 工 業（ 株 ））

を用いた。

2. ゲ ル ろ 過 HPLC に よ る ム コ 多 糖 の 分 子 量 分 布 の 確 認

HPLC 法 に よ る 各 試 験 物 質 の 分 子 量 分 布 の 確 認 は 、第 16 改 正 日 本 薬 局 方（ 厚

生 労 働 省 2011）に 記 載 さ れ て い る 方 法 の カ ラ ム 本 数 、試 料 を 秤 量 す る 量 お よ び

試 料 導 入 量 等 を 一 部 改 変 し た 方 法 で 行 っ た 。 分 析 試 料 は 、 各 検 体 50mg を 量 り

取 り 、 そ れ ぞ れ を 移 動 相 1.0mL に 溶 解 し て 調 製 し 、 島 津 製 作 所 （ 株 ） 製 の 分 析

機 器 を 使 用 し て RI お よ び UV シ グ ナ ル を 測 定 し た 。使 用 し た 機 器 お よ び 分 析 条

件 は 以 下 の 通 り で あ る 。 管 理 シ ス テ ム , LC solution； ポ ン プ , LC-10AV vp； 検

出 器 , 紫 外 吸 光 光 度 計 （ SPD-10AV vp ； 測 定 波 長 , 234nm ） お よ び 示 差 屈 折 計

（ RID-10A）
；カ ラ ム お よ び ガ ー ド カ ラ ム , TSKgel G-2000SWXL（ 5μ m, 7.8mm

-53-
I.D.×300mm, TOSO 製 （ 株 ）） , TSKgel guardcolumn SWXL （ 5μ m, 6.0mm

I.D.×40mm, TOSO 製 （ 株 ））； カ ラ ム 温 度 , 40 ℃ ； 移 動 相 , 0.2mol/L Na 2 SO 4

（ pH5.0）； 流 速 , 0.5mL/min； 試 料 導 入 量 , 25µL。

3. 1H-NMR 法 に よ る ム コ 多 糖 の 確 認

1 H-NMR 法 に よ る 各 試 験 物 質 の 確 認 は 、 第 16 改 正 日 本 薬 局 方 （ 厚 生 労 働 省

2011）に 記 載 さ れ て い る 方 法 の 、試 料 濃 度 等 を 一 部 改 変 し て 次 の 条 件 で 行 っ た 。

分 析 試 料 は 、 各 検 体 （ 20mg） を 、 3-ト リ メ チ ル シ リ ル プ ロ ピ オ ン 酸 ナ ト リ ウ ム

（ TSP ） -d 4 の 重 水 溶 液 （ 1→10000 ） 0.60mL に 溶 解 し て 調 製 し 、 ア ジ レ ン ト テ

ク ノ ロ ジ ー （ 株 ） の 分 析 機 器 を 使 用 し て 0～ 8ppm の シ グ ナ ル を 測 定 し た 。 使 用

し た 機 器 お よ び 分 析 条 件 は 以 下 の と お り で あ る 。NMR本 体（ VNMRS-500PS）,

分 析 ソ フ ト ウ ェ ア （ VnmrJ2.2C） ； 温 度 ， 25℃ ； ス ピ ニ ン グ ， オ フ ； デ ー タ ポ

イ ン ト 数 ，32768； ス ペ ク ト ル 範 囲 ，DHOの シ グ ナ ル を 中 心 に ± 6.0 ppm； パ ル ス

角 ， 90°； 繰 り 返 し パ ル ス 待 ち 時 間 ， 20秒 ； ダ ミ ー ス キ ャ ン ， 4回 ； 積 算 回 数 ，

HPの N-ア セ チ ル 基 の プ ロ ト ン の シ グ ナ ル の SN比 が 1000以 上 得 ら れ る 回 数；ウ イ

ン ド ウ 関 数 ， 指 数 関 数 （ Line broadening factor = 0.2Hz） 。

4. エ タ ノ ー ル 分 画 処 理 に よ る ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 精 製 （ 予 備 検 討 ）

各 検 液 の 調 製 は 、ま ず DN-W、DSH お よ び OSH を 終 濃 度 が 10%（ w/v）に な

る よ う に 0.2mol/L NaCl 溶 液 に 溶 解 し た 。 次 に DN-W/DSH 混 合 液 は 、 DN-W

に 対 し て DSH が 重 量 比 で 5%（ DN-W:DSH＝ 95.0:5.0）、 1.0%（ DN-W:DSH＝

99.0:1.0） お よ び 0.1%（ DN-W:DSH＝ 99.9:0.1） に な る よ う に 、 そ れ ぞ れ 混 合

調 製 し た 。ま た 、DN-W/OSH 混 合 液 は 、DN-W に 対 し て OSH が 重 量 比 で 0.5%

-54-
（ DN-W:OSH ＝ 99.5:0.5 ）、 0.1% （ DN-W:OSH ＝ 99.9:0.1 ） お よ び 0.01%

（ DN-W:OSH ＝ 99.99:0.01 ） に な る よ う に 、 そ れ ぞ れ 混 合 調 製 し た 。 そ し て 、

こ れ ら 溶 液 量 の 0.5 等 量（ v/v）に な る よ う に EtOH を 添 加 し 、激 し く 攪 拌 し た

ものを検液として、その性状を確認した。

さ ら に 、EtOH 添 加 量 の 増 加 が DN-W/DSH 混 合 液 の EtOH に よ る DN あ る い

は DS の 分 画 に 及 ぼ す 影 響 を 確 認 す る た め 、DN-W に 対 し て DSH が 重 量 比（ w/w）

で 1.0%（ DN-W:DSH＝ 99.0:1.0） に な る よ う に 調 製 し た DN-W/DSH 混 合 液 に

つ い て 、最 終 的 な EtOH 添 加 量 が 0.525、0.575、0.625 お よ び 0.675 等 量（ v/v）

に な る よ う EtOH を 更 に 添 加 し て 、 激 し く 撹 拌 後 、 室 温 お よ び 4˚C で そ れ ぞ れ

24 時 間 静 置 し た も の を 検 液 と し て 、 そ の 性 状 を 確 認 し た 。

5. エ タ ノ ー ル 分 画 処 理 に よ る ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 精 製 （ 本 検 討 ）

DN-C の EtOH 分 画 処 理 は 、（ 八 藤 後 と 村 田 2002） を 一 部 改 変 し 、 2 段 階 の

処 理 を 行 っ た 。 第 1 段 階 と し て 、 DN-C 50g を 1000mL ス ト レ ー ジ ボ ト ル に 量

り 取 り 、 0.2mol/L NaCl 溶 液 を 加 え て 500mL と し た 後 、 EtOH 250mL を 加 え

て 激 し く 攪 拌 し た 。白 濁 し た こ と を 確 認 し た 後（ Figure 14, 写 真 A）、遠 沈 管 に

移 し て 室 温 で 24 時 間 静 置 し た 後 、 遠 心 分 離 （ 2,000×g, 10min） に よ り 、 上 層

（ S1）お よ び 下 層 の コ ロ イ ド 状 沈 殿 物（ P1）の 二 層 に 分 配 し た（ Figure 14, 写

真 B）。 S1 は 別 の 1000mL ス ト レ ー ジ ボ ト ル に 回 収 し た 。

第 2 段 階 の 分 画 で は 、 回 収 し た S1 に 対 し 、 最 終 的 な EtOH 添 加 量 が 0.625 等

量 に な る よ う に 、61.5mL の EtOH を さ ら に 加 え 、激 し く 攪 拌 し た（ Figure 14,

写 真 C）。 白 濁 し た こ と を 確 認 し た 後 、 遠 沈 管 に 移 し 、 4℃ で 24 時 間 静 置 し た 。

そ の 後 、遠 心 分 離 （ 2,000×g, 10min）に よ り 上 層（ S2）お よ び 下 層 の コ ロ イ ド

-55-
状 沈 殿 物 （ P2） の 二 層 に 分 配 し た （ Figure 14, 写 真 D）。

各 画 分 に つ い て の HPLC お よ び NMR 分 析 試 料 の 調 製 は 以 下 の よ う に 行 っ た 。

P1 に つ い て は 、コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 を 0.2mol/L NaCl 溶 液 10mL に 再 溶 解 し た 後 、

90mL の EtOH を 加 え て 激 し く 撹 拌 し て 室 温 で 24 時 間 静 置 し 、白 色 沈 殿 物 を 再

沈 殿 さ せ た 。 S1 に つ い て は 、 ス ト レ ー ジ ボ ト ル か ら 7 m L を 50mL 遠 沈 管 に

採 取 し 、43mL の EtOH を 加 え て 激 し く 撹 拌 、室 温 で 24 時 間 静 置 し 、白 色 析 出

物 を 沈 殿 さ せ た 。 S2 に つ い て は 、 5L の ガ ラ ス 製 ビ ー カ ー に 移 し 、 4L の EtOH

を 加 え 、激 し く 攪 拌 し て 室 温 で 24 時 間 静 置 し 、白 色 沈 殿 物 を 沈 殿 さ せ た 。ま た 、

P2 は 0.2mol/L NaCl 溶 液 に 溶 か し て 500mL と し た 溶 液 に 4.5L の EtOH を 加

え 、激 し く 攪 拌 し て 室 温 で 24 時 間 静 置 し 、白 色 沈 殿 物 を 再 沈 殿 さ せ た 。こ れ ら

の 白 色 沈 殿 物 を 遠 心 分 離 （ 2,000×g, 10min） で そ れ ぞ れ 回 収 し 、 EtOH で 洗 浄

した後、五酸化二リン存在下、室温にて減圧乾燥した。乾燥後に得られた白色

粉 末 を HPLC お よ び NMR 分 析 に 供 し た 。 一 連 の 工 程 の 概 略 お よ び 分 析 の 流 れ

を Figure 14 に 示 し た 。

DNG 1～ 3 に つ い て も 、 同 様 に し て EtOH 分 画 処 理 を 行 い 、 白 色 粉 末 を 回 収

し た 。な お DNG 1～ 3 に つ い て は 1g の 出 発 物 質 か ら 分 画 を 行 い 、 全 工 程 を 1/50

にスケールダウンして実施した。

6. ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム の エ タ ノ ー ル 分 画 物 の 亜 硝 酸 分 解 処 理

DN-W と 、DN-C、DNG 1～ 3 お よ び こ れ ら の EtOH 処 理 画 分 の 亜 硝 酸 分 解 処

理は、第 3 章で実施した亜硝酸分解処理の方法を一部改変して行った。すなわ

ち 、 注 射 用 水 に 溶 か し た 各 検 体 溶 液 に 、 25% NaNO 2 溶 液 （ w/v） を 100μL/g 検

体 と な る よ う に 加 え て 攪 拌 し た 後 、 1mol/L HCl で pH を 約 1.5 に 調 整 し 、 さ ら

-56-
Figure 14. Schematic diagram for remove and analysis of impurities in DN-C by means of EtOH
precipitation.
Photographs: (A) appearances of DN-C solution at 1st EtOH precipitation, (B) separated fraction after
centrifugation, (C) appearances of S1 fraction at 2nd EtOH precipitation and (D) separated fraction
after centrifugation.

-57-
に 60 分 間 攪 拌 し た 。そ の 後 、1mol/L NaOH を 用 い 約 5.0 へ pH 調 整 を 行 っ た 。

こ の 試 料 溶 液 に 2mol/L Na 2 SO 4 （ pH5.0） を 100μL 加 え 、 HPLC に 供 し た 。 な

お、亜硝酸分解処理はすべて氷冷下で行った。

-58-
結果と考察

DN-W、 DSH お よ び OSH の HPLC と NMR 分 析 結 果 を （ Figure 15, HPLC）

に 示 し た 。各 MS の HPLC 分 析 の 結 果 、す べ て の 試 料 で 24.0 分 付 近 に 塩 類 に 由

来 す る ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。さ ら に 、保 持 時 間 10～ 23 分 に MS 骨 格 に 由 来 す る

主 要 ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。 DN-W で は 、 保 持 時 間 19.8 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を

も つ ピ ー ク （ 以 後 、 ピ ー ク A） の み が 確 認 さ れ 、 DSH お よ び OSH で は 、 保 持

時 間 12.5 分 か ら 13 分 付 近 に ピ ー ク 頂 点 を も つ ピ ー ク （ 以 後 、 ピ ー ク B） の み

が 確 認 さ れ た 。 今 回 の NMR 分 析 条 件 で は 、 2.05ppm 付 近 に HP に 由 来 す る シ

グ ナ ル が 得 ら れ 、 2.08ppm 付 近 に は DS に 由 来 す る シ グ ナ ル 、 そ し て 2.15ppm

付 近 に は OSCS に 由 来 す る シ グ ナ ル が 得 ら れ る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 橋 井 ら

2008a）。 各 MS の 1 H-NMR で の 1.9～ 2.2ppm 間 の シ グ ナ ル を 測 定 し た 結 果 、

DN-W、DSH お よ び OSH で も 同 様 に 、そ れ ぞ れ 特 徴 的 な 2.052ppm 、2.077ppm

お よ び 2.153ppm の シ グ ナ ル を 確 認 す る こ と が で き た （ Figure 15, NMR）。

次 に DN-W、お よ び DN-W 中 の DSH お よ び OSH の EtOH に 対 す る 反 応 性 に

つ い て 予 備 検 討 を 行 っ た 結 果 を Figure 16 お よ び Figure 17 に 示 し た 。 DN-W

コントロール溶液では、白色析出物およびコロイド状沈殿物は生じなかった。

DSH 添 加 検 液 に つ い て も 同 様 に 、0.1～ 5%（ w/v）の い ず れ の 濃 度 に お い て も 白

色 析 出 物 お よ び コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 は 生 じ な か っ た 。一 方 、 OSH 添 加 検 液 で は 今

回 実 験 を 行 っ た 最 小 濃 度 0.01%（ w/v）に お い て も 白 色 析 出 物 が 生 じ た（ Figure

16）。こ の 白 色 析 出 物 は 、濃 度 依 存 的 に 増 加 し て い る こ と が 目 視 で 確 認 で き た こ

と か ら 、 0.5 等 量 の EtOH を 加 え て 撹 拌 し た 際 に DN 原 薬 に 白 色 析 出 物 が 生 じ

た 場 合 は 、OSH す な わ ち 高 分 子 OSCS の 残 留 と 判 定 で き る と 考 え ら れ た 。比 較

的 似 た 分 子 量 お よ び HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム を 有 す る DSH と OSH（ Figure 15,

-59-
Figure 15. Typical HPLC chromatogram and NMR chart of DN-W and references of DSH
and OSH.

-60-
HPLC） に お い て EtOH に 対 す る 挙 動 が 異 な る 理 由 は 、 そ れ ぞ れ の 糖 鎖 に 結 合

す る 硫 酸 基 数 の 違 い に よ る も の で は な い か と 推 測 さ れ た 。し た が っ て 、DN 原 薬

中 に 高 分 子 OSCS が 混 入 し た 場 合 は 、 目 視 に よ る 確 認 お よ び 比 較 的 容 易 な 除 去

が可能と考えられた。

次 に DN-W と DSH の 分 離 に つ い て 追 加 し て 行 っ た 検 討 結 果 を Figure 17 に

示 し た 。DN-W コ ン ト ロ ー ル 溶 液 お よ び 1% DSH 添 加 検 液 の い ず れ に つ い て も 、

0.525 等 量 で は 変 化 は 見 ら れ な か っ た が 、0.575 等 量 以 上 の EtOH 濃 度 で は 白 色

析 出 物 お よ び コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 が 生 じ た （ Figure 17 A）。 0.525、 0.575 お よ び

0.625 等 量 で 生 じ た 各 コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 を 回 収 し て そ れ ぞ れ 再 結 晶 し 、得 ら れ た

白 色 粉 末 に つ い て HPLC に よ る 確 認 を 行 っ た 。 EtOH 添 加 量 が 0.575 お よ び

0.625 等 量 で は ピ ー ク A の み が 確 認 さ れ 、 0.675 等 量 で は ピ ー ク A お よ び ピ ー

ク B が 確 認 さ れ た （ デ ー タ 示 さ ず ）。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 DN-W は EtOH 添 加

量 が 0.525～ 0.575 等 量 で 析 出 を 開 始 し 、 DSH は EtOH 添 加 量 が 0.625～ 0.675

等 量 で 析 出 を 開 始 す る と 考 え ら れ た 。 ま た 、 0.625 等 量 の EtOH を 添 加 し て 処

理 し た 1% DSH 添 加 検 液 2 mL（ DN-W 含 有 量 は 198.0mg） か ら 回 収 し た 白 色

粉 末 の 重 量 は 55.7 mg（ 回 収 率 ； 28.1%） で あ り 、 0.675 等 量 の EtOH を 添 加 し

て 処 理 し た 場 合 、同 様 に し て 回 収 し た 白 色 粉 末 の 重 量 は 115.5 mg で あ っ た（ 回

収 率；53.3%）。こ れ ら の 条 件 下 で は DN-W の 析 出 量 が 不 十 分 で あ り 、か つ 、DSH

も析出していることから、より効率的な分離条件を検討する必要性が認められ

た。

一 般 的 に 、 水 /有 機 溶 媒 系 中 の MS の 溶 解 度 は 、 液 温 の 低 下 に 伴 っ て 低 く な る

こ と が 知 ら れ て い る 。そ こ で 、DN-W と DSH の 分 離 に 及 ぼ す 分 離 温 度 の 影 響 に

つ い て 検 討 し た 。先 の 場 合 と 同 様 に 、0.525～ 0.675 等 量 の EtOH を 添 加 し た 1%

-61-
Figure 16. Appearances of DN-W contaminated with several ratio of DSH or OSH after EtOH
precipitation.
DN-W + DSH treated with same concentrations of EtOH.

-62-
DSH 添 加 検 液 を 激 し く 撹 拌 し た 後 、 4˚C で 24 時 間 静 置 し た 。 こ の 条 件 下 に お

い て は 、 コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 の 生 成 を 確 認 で き た （ Figure 17 B） た め 、 沈 殿 物 を

回 収 、 再 結 晶 し 、 得 ら れ た 白 色 粉 末 に つ い て HPLC に よ る 確 認 を 行 っ た 。 そ の

結 果 、 EtOH 添 加 量 が 0.525～ 0.625 等 量 で は ピ ー ク A の み が 確 認 さ れ 、 DSH

で 確 認 さ れ た ピ ー ク B は 確 認 さ れ な か っ た（ デ ー タ 示 さ ず ）。 ま た 、 0.625 等 量

の EtOH を 添 加 し て 処 理 し た 1% DSH 添 加 検 液 2mL

（ DN-W 含 有 量 は 198.0mg）

か ら 回 収 し た 白 色 粉 末 の 重 量 は 、 163.2 mg （ 回 収 率 ； 82.4% ） で あ っ た こ と か

ら 、 DN-W と DSH を 分 離 す る 場 合 は 4˚C で の EtOH 分 画 処 理 が 有 効 で あ る と

考 え ら れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、 DN-W 中 の DSH お よ び OSH を 除 去 す る 調 製

方 法 と し て 、 ま ず 室 温 下 の EtOH 処 理 で OSH を コ ロ イ ド 状 沈 殿 と し て 除 去 し 、

次 い で 、 得 ら れ た 上 清 に EtOH を 追 加 し て 4˚C で 静 置 後 に DSH が 存 在 す る 上

清 を 除 き 、 コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 と し て DN-W を 回 収 す る 2 段 階 の 調 製 方 法 が 望 ま

しいと考えられた。

以 上 の 結 果 か ら 、 Figure 14 に 示 し た と お り 、DN-C に つ い て 2 段 階 の EtOH

分 画 処 理 を 実 施 す る こ と と し た 。 そ れ ぞ れ の 段 階 で 得 ら れ た 上 清 （ S1, S2） お

よ び コ ロ イ ド 状 沈 殿 物（ P1, P2）を 再 結 晶 し 、得 ら れ た 白 色 粉 末 と 分 画 前 の DN-C

に つ い て の HPLC お よ び NMR 分 析 結 果 を Figure 18 に 示 し た 。

DN-W と OSH、 DSH の 混 合 品 で あ る DN-C に つ い て 、 HPLC で は DN-W で

確 認 さ れ た ピ ー ク A に 加 え 、OSH お よ び DSH で 確 認 さ れ た ピ ー ク B も 確 認 さ

れ た 。ピ ー ク A と ピ ー ク B の お よ そ の ピ ー ク 面 積 比（ B/A）は 約 1.30×10 - 2 で あ

っ た 。NMR 分 析 で も 、そ れ ぞ れ に 特 徴 的 な 2.05ppm、2.08ppm お よ び 2.15ppm

付 近 の 3 シ グ ナ ル が 確 認 で き た 。 ま た DN-C お よ び す べ て の 画 分 の NMR 分 析

で は 2.10ppm 付 近 に シ グ ナ ル が 確 認 さ れ た が 、こ れ は 製 造 工 程 に お け る 酸 化 還

-63-
Figure 17. Appearances of DN-W contaminated with DSH after EtOH precipitation.
DN-W + DSH treated at RT with different concentrations of EtOH. (B) DN-W + DSH
treated at 4˚C with different concentration of EtOH.

-64-
元 処 理 に よ る 影 響 と 推 測 さ れ た 。 P1 画 分 で は 、 DN-C と 同 様 に 、 HPLC に お い

て ピ ー ク A と ピ ー ク B が 確 認 さ れ た が 、 そ の ピ ー ク 面 積 比 は 約 1.03 と 、 ピ ー

ク B の 面 積 が 大 幅 に 増 加 し て い た 。 ま た 、ピ ー ク A の 頂 点 は 高 分 子 側 に シ フ ト

し て お り 、DN-W の 高 分 子 部 分 が P1 画 分 に 回 収 さ れ た も の と 考 え ら れ た 。ま た

NMR で は 、 2.15ppm 付 近 に 最 大 シ グ ナ ル が 確 認 さ れ 、 2.05ppm 付 近 に 僅 か な

シ グ ナ ル が 確 認 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 P1 画 分 の 主 成 分 は OSH で あ り 、 僅

か に 高 分 子 の DN-W が 含 ま れ て い る と 考 え ら れ た 。S1 画 分 で は 、HPLC で は ピ

ー ク A と ピ ー ク B が 確 認 さ れ 、 そ の 面 積 比 は 約 9.08×10 - 3 で あ り 、 DN-C に 比

べ 、 ピ ー ク B が 僅 か に 減 少 し て い た 。 ま た 、 NMR で は 2.05ppm、 2.08ppm 付

近 に 2 シ グ ナ ル を 確 認 し た が 、 OSH に 特 徴 的 な 2.15ppm の シ グ ナ ル は 確 認 出

来 な か っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 第 一 段 階 の EtOH 処 理 で 得 ら れ る コ ロ イ ド 状 沈

殿 画 分 （ P1） に OSH が 移 行 /濃 縮 さ れ て お り 、 上 清 （ S1） に は DN-W と DSH

が含まれていることが確認された。

S2 画 分 に つ い て は 、 HPLC に お い て ピ ー ク A と ピ ー ク B が 確 認 さ れ た 。 し

か し ピ ー ク A の 頂 点 の 保 持 時 間 は 20.5 分 と DN-W の 保 持 時 間 19.8 分 よ り も 長

く 、低 分 子 側 に シ フ ト し て い た こ と か ら 、S2 画 分 で は DN-W の 低 分 子 部 分 が 回

収 さ れ た と 推 測 さ れ た 。ピ ー ク A と B の 面 積 比 は 約 2.36×10 - 1 で あ り 、S1 に 比

較 し て ピ ー ク B が 増 加 し て い た 。ま た 、NMR で は 2.05ppm お よ び 2.08ppm 付

近 の 2 シ グ ナ ル が 確 認 で き た 。一 方 、P2 画 分 で は 、HPLC で は ピ ー ク B の ピ ー

ク は ほ と ん ど 確 認 出 来 ず 、 NMR に お い て も 2.05ppm 付 近 が 主 要 な シ グ ナ ル と

な り 、 2.08ppm 付 近 の ピ ー ク は 確 認 で き な か っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 第 2 段 階

の EtOH 処 理 で 得 ら れ る 上 清（ S2）に DSH が 残 留 し 、コ ロ イ ド 状 沈 殿 画 分（ P2）

に DN-W が 高 純 度 で 濃 縮 さ れ た と 考 え ら れ た 。 最 終 的 に 、 DN-C 50g（ DN-W

-65-
Figure 18. HPLC and NMR analyses of DN-C fractionated with EtOH precipitation.
Charts in each figure show the results of DN-W, DN-C, P1, S1, S2 and P2.

-66-
49.25g）を EtOH 分 画 し て 得 ら れ た P1、P2 お よ び S2 画 分 を 再 結 晶 し て 得 た 白

色 粉 末 の 重 量 は 、そ れ ぞ れ 0.54g と 43.62g お よ び 3.15g で あ っ た 。最 も 純 度 が

高 い P2 画 分 に お け る 回 収 率 は 87.2%で あ っ た こ と か ら 、DN 原 薬 の 実 製 造 へ の

応用も十分可能であると考えられた。

LMWH の 純 度 確 認 試 験 に つ い て 、 第 3 章 で は 、 DS や OSCS は 亜 硝 酸 分 解 に

対 し て 抵 抗 性 を 示 す の に 対 し 、HP は 亜 硝 酸 分 解 に よ り 二 糖 単 位 の ピ ー ク シ フ ト

を 伴 う 分 解 と 低 分 子 化 を 示 す こ と に 基 づ き 、 亜 硝 酸 分 解 に 引 き 続 く HPLC 分 析

に よ り 、MS の 純 度 確 認 が 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た 。そ こ で 、本 研 究 で は 亜 硝

酸 分 解 /HPLC 法 を LMWH に 適 用 し 、不 純 物 確 認 法 と し て の 有 用 性 を 検 討 し た 。

DN-C、 S1 お よ び P2 そ れ ぞ れ の 亜 硝 酸 分 解 処 理 を 行 い 、 HPLC 分 析 お よ び

NMR 分 析 を 行 っ た 。 得 ら れ た HPLC ク ロ マ ト チ ャ ー ト を フ ル ス ケ ー ル で 記 載

し た 場 合 、 ピ ー ク B を 確 認 す る こ と が 困 難 で あ る 。 そ こ で 、 Figure 19 で は フ

ル ス ケ ー ル 表 記 に 加 え て 、各 HPLC ク ロ マ ト チ ャ ー ト 上 に 、ピ ー ク B を 確 認 し

や す い 保 持 時 間 （ 10.5～ 15.5 分 ） の 拡 大 ク ロ マ ト チ ャ ー ト を 追 記 す る 。 HPLC

（ Figure 19, HPLC） で は 、 す べ て の 検 体 で ピ ー ク A は 分 解 、 消 失 し 、 ピ ー ク

B は 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS と し て 検 出 さ れ た 。し か し 、DN-C、S1 と 比 較 し て 、

P2 の ピ ー ク B は 僅 少 で あ っ た 。 一 方 、 NMR 分 析 の 結 果 に お い て 、 DN-C で は

2.04ppm、2.08ppm お よ び 2.15ppm 付 近 の シ グ ナ ル が 明 確 に 確 認 さ れ た が 、OSH

が 除 去 さ れ た S1 で は 2.15ppm、 DSH が 除 去 さ れ た P2 で は 2.08ppm の シ グ ナ

ル が 非 常 に 弱 く な っ た （ Figure 19, NMR）。 HPLC 分 析 の 結 果 か ら 、 全 MS に

占 め る 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS の ピ ー ク の RI 面 積 値 の 割 合 を 算 出 し た と こ ろ 、

DN-C で は 分 解 前 の 面 積 値 の 1.52%で あ っ た の に 対 し 、 S1 中 の 分 解 抵 抗 性 MS

ピ ー ク の RI 面 積 値 は 1.06%、P2 中 の 分 解 抵 抗 性 MS ピ ー ク の RI 面 積 値 は 0.04%

-67-
Figure 19. HPLC and NMR analyses of fractions of DN-C de-polymerized with nitrous acid.
Charts in each figure show the results of DN-W, DN-C,  S1,  and  P2.  Charts  of    “Peak  B  (RT:  10.5
～15.5  min)”  are  magnified  to  show  the  peak  clearly.

-68-
Ta b l e 4 . C h a n g e s o f R I a r e a o f M S † c o n t a i n e d i n t h e D N - C f r a c t i o n a t e d w i t h e t h a n o l

Nitrous acid de-polyme rization Co mposit io n of Ratio of

Ethanol
un-degraded MS un-degraded
precipitation Un-treated a
Trea ted b
(B/A) MS c
(A) (B)

Un-treat ment - 2
15,465,799 ± 4,561 235,567 ± 395 1.52×10 1.00
(intact)

1st supernatant - 2
15,835,359 ± 6,530 167,362 ± 96 1.06×10 0.69
(S1)

- 2
2nd precipitant
15,296,567 ± 4,821 6,388 ± 82 4.18×10 - 4 2.71×10
(P2)

Va l u e s a r e m e a n s ± S D ( n = 3 ) .

† M S ,   m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

a , To t a l a r e a o f M S w i t h o u t n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n .

b, RI area of un-degraded MS with NaNO2 eluted from 10.0 to 20.0 min on HPLC.

c, Ratio of un-degraded MS in fractio nated DN-C to that in the intact materia l.

-69-
と 、 段 階 的 に 減 少 し て い た （ Table 4）。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 2 段 階 の EtOH 分

画 処 理 に よ り 、 DN-C か ら 高 分 子 の MS 不 純 物 が 除 去 さ れ 、 純 度 が 大 幅 に 高 ま

っ た こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 亜 硝 酸 分 解 /ゲ ル ろ 過 HPLC 法 は LMWH 中 の 高

分 子 MS や OSCS の 存 在 を 感 度 良 く 検 出 し て い る こ と か ら 、 本 法 は LMWH の

各製造工程の品質管理における純度確認試験法として適用可能であることが示

された。

一 方 で 、OSH が 除 去 さ れ て い る S1 お よ び P2 画 分 の 何 れ に お い て も 、亜 硝 酸

分 解 処 理 前 に は 認 め ら れ な か っ た 2.15ppm 付 近 の シ グ ナ ル が 、亜 硝 酸 分 解 処 理

後 に 確 認 さ れ た （ Figure 19, NMR）。 ま た 、 そ の シ グ ナ ル の 発 生 と と も に 、 近

接 し た 2.18ppm 付 近 に み ら れ る 未 同 定 シ グ ナ ル の 強 度 の 減 少 も 確 認 さ れ た 。こ

れ は 、第 ２ 章 で の UFH の 亜 硝 酸 分 解 前 後 の シ グ ナ ル 推 移 と 同 様 の 挙 動 で あ っ た 。

精 製 し た OSH お よ び DSH で は こ の 現 象 は 確 認 さ れ な か っ た （ デ ー タ 示 さ ず ）

こ と か ら 、 こ の シ グ ナ ル 推 移 は HP 糖 鎖 、 あ る い は 、 そ の 糖 鎖 に 結 合 し た 他 の

物 質 に 由 来 す る も の と 考 え ら れ 、HP に 何 ら か の 化 学 処 理 を し た 場 合 、そ の 条 件 、

例 え ば pH、温 度 、試 薬 あ る い は 処 理 後 に 残 留 す る 物 質 に よ っ て 生 じ る も の と 考

え ら れ た 。 以 上 の こ と か ら 化 学 処 理 の 内 容 に よ っ て は 、 HP/LMWH を NMR 分

析 し た 場 合 、 2.15ppm 付 近 の シ グ ナ ル は 必 ず し も OSCS に 特 異 的 で は な い 可 能

性 が 示 さ れ た 。HP 原 薬 の NMR 分 析 に お け る 、2.12～ 3.00ppm の 未 同 定 シ グ ナ

ル の 解 析 報 告 も ふ ま え （ Lee ら 2011）、 こ れ ら の シ グ ナ ル 推 移 の 挙 動 に つ い て

は、今後詳細な検討が必要であると考えられた。

ま た 、 商 業 用 DN 原 薬 の 試 験 的 精 製 に つ い て 、 DNG 1～ 3 に つ い て 2 段 階 の

EtOH 分 画 処 理 を 行 い 、 分 画 処 理 前 お よ び 2 段 階 目 の EtOH 分 画 処 理 後 に 得 ら

れ た P2 画 分 を 再 結 晶 し て 得 ら れ た 白 色 粉 末 に つ い て 、 そ れ ぞ れ 亜 硝 酸 分 解 し 、

-70-
HPLC 分 析 お よ び NMR 分 析 で 純 度 を 確 認 し た 結 果 を Figure 20 に 示 し た 。

HPLC に よ る 分 析 の 結 果 （ Figure 20, HPLC）、 EtOH 分 画 処 理 前 の 各 DNG を

亜 硝 酸 分 解 す る と 、 DN-C の 場 合 と 同 様 に 、 い ず れ の 試 料 で も ピ ー ク B に 相 当

するピーク成分は分解されなかった。これらピークの立ち上がり部分のスロー

プ 形 状 は 分 解 前 後 で 変 化 し て い な か っ た こ と か ら 、 こ れ ら の ピ ー ク は DN の 原

料 に 由 来 す る 未 分 解 の HP で は な く 、 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS の ピ ー ク で あ る と

考えられた。

一 方 、 NMR に よ る 分 析 の 結 果 （ Figure 20, NMR）、 EtOH 分 画 処 理 前 の す べ

て の 検 体 に お い て DN に 由 来 す る 2.05ppm の シ グ ナ ル が 確 認 さ れ 、 DNG 1 で

は 2.08ppm 付 近 の シ グ ナ ル が 確 認 で き た 。 し か し 、 DNG 2 お よ び DNG 3 に つ

い て は DN 由 来 の GlcNAc の シ グ ナ ル と 重 な り 、 2.08ppm の シ グ ナ ル を 明 確 に

確 認 で き な か っ た 。 ま た 、 2.10ppm 付 近 に シ グ ナ ル が 確 認 さ れ た が 、 こ れ は 製

造工程における酸化還元処理による影響と推測された。

EtOH 分 画 処 理 前 の DNG に つ い て の HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム に お け る 各 MS

のピーク面積の計算結果から、これらの原薬には亜硝酸分解抵抗性の不純物が

0.2%～ 0.8% 程 度 含 有 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ た （ Table 5）。 そ し て 、 EtOH

分 画 処 理 後 で は 、 そ れ ら ピ ー ク 成 分 の RI 面 積 値 は 、 分 画 前 の RI 面 積 値 の 4%

～ 10%（ DN 中 の 含 量 と し て 0.02～ 0.04%程 度 ） ま で 減 少 し て い た （ Table 6）。

DNG 1～ 3 の 原 薬 粉 末 1g か ら 白 色 粉 末 と し て 得 ら れ た P2 画 分 の 重 量 は 、 そ れ

ぞ れ 0.834、0.852 お よ び 0.827g で あ り 、製 造 方 法 が そ れ ぞ れ 異 な る 3 原 薬 で 、

す べ て 80%以 上 の 高 い 収 量 が 得 ら れ た 。こ れ ら の こ と か ら 、今 回 検 討 し た EtOH

分 画 は LMWH の 純 度 向 上 に 有 効 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。

以 上 、本 研 究 で は DN 製 造 工 程 に お い て 、DN 以 外 の MS 夾 雑 物 質 を 除 去 す る

-71-
Figure 20. HPLC and NMR analyses of commercial DN products (above) and the purified DN
with EtOH precipitation (below).
Samples of HPLC are de-polymerized with nitrous acid. Charts in each figure show the results of
DNG1, DNG2, and DNG3 respectively.

-72-
Ta b l e 5 . R I a r e a o f n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n - r e s i s t a n t M S † i n d r u g s u b s t a n c e s

Nitrous acid de -polyme rization

Co mposit io n of
Products un-degraded MS
Un-treated a
Trea ted b (B/A)
(A) (B)

DNG1 15,267,154 ± 7,415 108,920 ± 739 7.13×10 - 3

DNG2 15,318,865 ± 1,015 34,722 ± 645 2.27×10 - 3

DNG3 15,585,305 ± 2,178 120,381 ± 1,231 7.72×10 - 3

Va l u e s a r e m e a n s ± S D ( n = 3 ) .

† M S ,   m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

a , To t a l a r e a o f M S w i t h o u t n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n .

b, RI area of un-degraded MS with NaNO2 eluted from 10.0 to 20.0 min on HPLC.

-73-
 Ta b l e 6 . R I a r e a o f n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n - r e s i s t a n t M S † i n 2 n d c o l l o i d a l
precipitate (P2) res ulting from ethanol precipitation of drug substances

Nitrous acid de -polyme rization Co mposit io n

Ratio of
of un-degraded
Products§ un-degraded
MS c
Un-treated a
Trea ted b MS
(B/A)
(A) (B)

- 4 - 2
DNG 1 15,492,070 ± 5,294 5,249 ± 195 3.34×10 4.82×10

- 4 - 2
DNG 2 15,039,313 ± 17,551 3,143 ± 95 2.09×10 9.05×10

- 4 - 2
DNG 3 15,415,894 ± 10,082 5,386 ± 218 3.48×10 4.46×10

Va l u e s a r e m e a n s ± S D ( n = 3 ) .

† M S ,   m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

§ A b b r e v i a t i o n s a r e t h e s a m e a s s h o w n i n Ta b l e 5 .

a , To t a l a r e a o f M S w i t h o u t n i t r o u s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n .

b, RI area of un-degraded MS with NaNO2 eluted from 10.0 to 20.0 min on HPLC.

c , R a t i o o f u n - d e g r a d e d M S i n p r e c i p i t a t e t o t h a t i n e a c h i n t a c t m a t e r i a l s h o w n i n Ta b l e 5 .

-74-
方 法 と し て 、 室 温 お よ び 4˚C で の 2 段 階 の EtOH 分 画 処 理 が 有 効 で あ る こ と が

示 唆 さ れ た 。EtOH 分 画 処 理 を 加 え る こ と に よ り 製 造 工 程 数 が 増 加 す る も の の 、

イ オ ン 交 換 /ゲ ル ろ 過 カ ラ ム を 含 む 他 の MS の 製 造 ラ イ ン と の 共 用 頻 度 も 抑 え ら

れ る こ と か ら 、 よ り コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン を 低 減 し た 、 高 品 質 な DN を 供 給 す る

ことが可能であると考えられた。

ま た 、亜 硝 酸 分 解 /ゲ ル ろ 過 HPLC 法 に よ る MS 確 認 試 験 法 に つ い て は 、本 法

は NMR 法 と 同 等 の 評 価 が 可 能 な LMWH 検 査 方 法 と な り 得 る こ と が 示 さ れ た 。

特 に 各 DNG の 分 析 に お い て 、残 留 す る 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 物 質 の 不 均 一 性 が 示 さ

れ た こ と 、 お よ び そ の 確 認 に お い て 混 入 量 が 微 量 の 場 合 、 HPLC 法 で は 亜 硝 酸

分 解 抵 抗 性 物 質 と し て 確 認 可 能 で あ る が 、NMR で は 確 認 が 困 難 で あ る こ と を 示

唆するものである。よって、粗原料から粉体化までの一連の工程管理の要所に

お い て 、 こ の 方 法 で 検 査 を 実 施 す る こ と で 、 NMR/ イ オ ン 交 換 / 逆 相 ク ロ マ ト 法

が 規 格 化 さ れ て い る HP と 、同 等 の 品 質 が 確 保 で き る も の と 考 え ら れ る 。HPLC

法 が LMWH の 分 子 量 測 定 法 と し て 古 く か ら 各 国 の 薬 局 方 に 収 載 さ れ 、国 内 外 で

多 く の 原 薬 / 製 剤 メ ー カ ー に も 普 及 し て い る 分 析 手 法 の １ つ で あ る （ Dedem と

Nielsen 1991） こ と 、 HP と 同 様 に 、 LMWH 原 薬 /製 剤 調 製 時 の 工 程 管 理 に お い

て 、本 報 中 の MS 確 認 方 法 を 適 用 す る こ と は 、比 較 的 容 易 で あ る と 考 え ら れ る 。

-75-
要約

低 分 子 ヘ パ リ ン（ LMWH）で あ る ダ ル テ パ リ ン ナ ト リ ウ ム（ DN）の 純 度 試 験

法 と 、 そ の 中 の 他 の ム コ 多 糖 類 （ MS） 夾 雑 物 （ デ ル マ タ ン 硫 酸 （ DS）） お よ び

過 硫 酸 化 コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸（ OSCS）の 工 業 的 除 去 方 法 に つ い て 検 討 し た 。高

純 度 の DN（ DN-W） に 高 分 子 DS（ DSH） お よ び 高 分 子 OSCS（ OSH） を 添

加 し て 粗 DN（ DN-C） を 調 製 し た 。 次 に 、 DN-C に 対 し 2 段 階 の エ タ ノ ー ル

（ EtOH）分 画 処 理 を 行 い 、各 不 純 物 の 挙 動 と DN の 精 製 度 を 確 認 し た 。そ の 結

果 、 DN-C で は 第 １ 段 階 の EtOH 分 画 で OSH が コ ロ イ ド 状 沈 殿 物 中 に 濃 縮 /除

去 さ れ た 。 次 に 、 残 っ た 上 清 画 分 に 対 し て 第 ２ 段 階 の EtOH 分 画 を 行 う と 、 コ

ロ イ ド 状 沈 殿 物 中 に 高 純 度 の DN-W が 濃 縮 さ れ 、 DS は 上 清 画 分 に 留 ま っ た 。

加 え て 、 商 業 用 DN に つ い て も 同 様 の EtOH 分 画 処 理 を 行 い 、 MS 夾 雑 物 質 除

去 に お け る EtOH 分 画 処 理 の 有 効 性 を 確 認 し た 。 こ れ ら 分 画 物 の 純 度 を 、 亜 硝

酸 分 解 抵 抗 性 不 純 物 を 高 感 度 で 検 出 で き る 亜 硝 酸 分 解 /HPLC 法 、 お よ び 公 定 的

な 確 認 試 験 法 で あ る 1 H-NMR（ NMR） 法 に よ り 確 認 し た 結 果 、 2 段 階 EtOH 分

画 処 理 を 行 っ た す べ て の 検 体 で DN の 純 度 が 向 上 し た 。 ま た 、 本 試 験 で 用 い た

商 業 用 DN 中 の 高 分 子 MS 不 純 物 は 、主 に 高 分 子 DS で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。

以 上 の 結 果 か ら 、 LMWH の 調 製 工 程 に お い て 亜 硝 酸 分 解 / HPLC 法 に よ る

純 度 検 査 を 行 い 、 さ ら に 、 MS 夾 雑 物 質 を 含 む LMWH 原 薬 に つ い て 2 段 階 の

EtOH 分 画 処 理 を 実 施 す る こ と で 、高 品 質 な LMWH 原 料 を 安 定 的 に 調 製 で き る

と結論した。

-76-
第 5章 総括

生 物 由 来 物 質 で あ る MS の 工 業 的 あ る い は 商 業 的 な 利 用 状 況 は 多 岐 に わ た り 、

健 康 食 品 、化 粧 品 、研 究 用 試 薬 お よ び 医 薬 品 と し て 世 界 中 で 流 通 し て い る 。MS

の 種 類 は 様 々 で あ り 、 そ れ ら を 抽 出 /精 製 す る た め の 製 造 原 料 も ま た 多 様 で あ る 。

その起源を遡ると、畜産資源および水産資源の食品加工時に生じる、本来なら

ば廃棄されていた副産物に由来するものが大多数を占めており、これらの利用

が長期的かつ持続的に行われることは、限りある資源の有効利用、また環境保

護の観点からも極めて有意義であるといえる。

近 年 の 健 康 食 品 ブ ー ム で 注 目 さ れ て い る MS と し て は CS や HA が 挙 げ ら れ る

が、食品分野のみならず、医療分野においても、医薬品原料として流通してい

る MS は 多 い 。 HP や LMWH に つ い て は 、 CS お よ び HA と 異 な り 食 品 お よ び

化 粧 品 の 分 野 で の 利 用 例 は ほ と ん ど 無 い が 、 血 液 凝 固 阻 害 作 用 を 有 す る MS と

して、医療分野において血液透析その他の体外循環装置使用時の血液凝固の防

止 の 目 的 で 使 用 さ れ て い る 。日 本 国 内 の 慢 性 透 析 患 者 数 は 、2011 年 末 に 日 本 国

内 の 慢 性 透 析 患 者 数 は 30 万 人 を 超 え て い る が 、血 液 透 析 時 に 用 い る 血 液 凝 固 阻

止 剤 と し て 、HP お よ び LMWH の 使 用 例 は 過 半 数 を 超 え 、多 く の 患 者 に 高 頻 度

で使用されているのである。

2000 年 代 初 頭 に 発 生 し た BSE（ bovine spongiform encephalopathy ）問 題 は

食 肉 の み な ら ず 、MS の 流 通 に も 大 き な 影 響 を 及 ぼ し た 。例 え ば 、そ れ ま で MS

製 造 に 利 用 さ れ て き た 牛 由 来 の 器 官 /軟 骨 等 の 使 用 が 制 限 さ れ た こ と に よ り 、 そ

のもの自体の大量廃棄の問題、また、これまでそれらを粗原料として製造され

て き た MS に つ い て は 、 こ れ ま で 製 造 し た 製 品 の 在 庫 管 理 の 問 題 、 ま た 代 替 粗

-77-
原料の確保、そして最終製品の同等性の担保等が喫 緊 の 課 題 となった。特に、

CSF に つ い て は 、 そ の 粗 原 料 が 牛 由 来 の も の か ら 豚 、 鮫 お よ び イ カ 等 由 来 に 、

ま た 、HP お よ び LMWH に つ い て も 、牛 由 来 の も の は ほ ぼ 豚 腸 粘 膜 由 来 に 転 換

さ れ た 。HP お よ び LMWH の 粗 原 料 で あ る CHP 中 に は 、主 に HS、CS-B（ DS）

お よ び CS-C が 含 ま れ 、特 に 高 分 子 MS で あ る CS-B（ DS）が 5～ 20％ 程 度 含 有

さ れ て い る 場 合 が 多 い 。 HP 中 に も こ れ ら の MS が 、 お よ そ 0～ 5％ 前 後 が 残 留

していることは確認されていたが、その残留に起因する重篤な副作用の報告例

は 少 な く 、ま た 、HP の 低 分 子 化 処 理 に よ り 、出 血 時 間 の 延 長 等 の 副 作 用 を 低 減

し た LMWH に つ い て も 、 HP と 同 様 に 世 界 中 で 古 く か ら 使 用 さ れ て き た 。

2008 年 初 頭 、 米 国 、 ド イ ツ な ど で 発 生 し た 、 HP 製 剤 の 急 速 静 注 投 与 が 原 因

と 思 わ れ る 死 亡 お よ び 他 の 副 作 用 の 事 例 に つ い て 、 使 用 さ れ た HP 製 剤 お よ び

原 薬 を 分 析 調 査 し た 結 果 、 半 合 成 MS で あ る OSCS が 確 認 さ れ た 。 日 本 国 内 に

お い て HP 製 剤 の 原 薬 は す べ て 海 外 か ら 輸 入 さ れ て お り 、 国 内 生 産 は 行 わ れ て

い な い 。速 や か な 安 全 性 確 保 の た め 、HP の 純 度 試 験 法 お よ び 確 認 試 験 法 が 検 討

さ れ 、混 入 物 質 で あ る OSCS と DS の 確 認 /純 度 試 験 と し て 1 H-NMR、イ オ ン 交

換および逆相クロマトグラフィー等の実施が義務づけられた（厚生労働省

2011） が 、 こ れ ら の 試 験 は 頻 雑 で あ る こ と 、 ま た 、 精 製 さ れ た 最 終 製 品 の 試 験

で あ る こ と か ら 、粗 原 料 で あ る CHP の 受 入 か ら 最 終 的 な HP 原 薬 の 粉 体 充 填 ま

での一連の工程すべてにおいて実施することは、事実上困難である。特に、多

用 途 /多 品 目 の MS を 製 造 す る メ ー カ ー に お い て は 、 粗 原 料 の 取 り 違 え 、 ま た 製

造 工 程 に お け る ラ イ ン お よ び 各 機 器 の 洗 浄 不 良 等 に よ っ て は 、 目 的 と す る MS

中 に 目 的 外 の MS が 混 入 す る 可 能 性 が 常 に 存 在 す る 。ま た 、HP と 同 種 同 効 薬 で

あ り 、 ま た 、 HP と 同 一 の 工 場 で 製 造 さ れ る こ と が 多 い LMWH に つ い て は 、 こ

-78-
れ ら の 試 験 、 あ る い は そ れ に 代 替 す る 試 験 は 義 務 づ け ら れ て い な い 。 BSE 問 題

発 生 時 に 生 じ た 牛 由 来 粗 原 料 を 用 い て 製 造 さ れ た MS 製 品 の 大 量 廃 棄 問 題 と 同

様 に 、今 回 の OSCS 問 題 で も 、HP 関 連 製 品 に 限 定 的 で は あ っ た も の の 、1 H-NMR

分 析 に よ り 2.15ppm 付 近 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 原 薬 、ま た そ れ を 用 い た 製 剤

が 大 量 廃 棄 さ れ 、 ま た 、 HP 原 薬 価 格 の 高 騰 に も 繋 が っ た 。 こ の こ と か ら 、 HP

お よ び LMWH 中 の 目 的 外 MS の 残 留 を 効 率 良 く 低 減 す る よ う な 精 製 /分 画 方 法 、

また工程管理における簡便な純度確認方法を確立することは、屠畜副産物の効

率的な再資源化を長期的かつ持続的に行う上で必須であると考えられる。

本 研 究 で は 、医 薬 品 原 料 と し て 用 い ら れ て い る 2 種 類 の MS、す な わ ち HP お

よ び LMWH に つ い て 、 他 の MS と の 効 率 的 な 分 離 ・ 精 製 方 法 と し て EtOH 分

画法の適用を検討した結果、本法が工業的な製造方法として有効であることを

確 認 し た 。 さ ら に 、 そ の 製 造 工 程 に お い て 、 亜 硝 酸 分 解 と ゲ ル ろ 過 HPLC を 組

み合わせた分析方法を検討した結果、簡便な純度確認方法として有効であるこ

とも確認した。逆説的に考えれば、これらの精製方法および分析方法は、例え

ば OSCS、 CSF あ る い は KS 等 の 亜 硝 酸 分 解 抵 抗 性 MS の 精 製 方 法 、 ま た 分 析

方 法 と し て も 有 効 で あ る と 推 測 さ れ た 。HP 製 品 に お い て 、そ の 中 の 他 の MS は

不 純 物 で あ る が 、他 の MS 製 品 に お い て は HP が 不 純 物 と な る か ら で あ る 。 MS

製 品 の 純 度 に つ い て は 、 例 え ば 、 CSF を 配 合 し た 健 康 食 品 に つ い て も 、 表 示 内

容 と 製 品 内 容 と の 整 合 性 が と れ て い な い ケ ー ス が 報 告（ 戸 井 田 ら 2011）さ れ て

い る 。 MS 製 品 の 中 で も 、 HP と 同 様 に CSF は 医 薬 品 原 料 と し て 日 本 薬 局 方 外

医 薬 品 規 格 に も 収 載 さ れ て い る こ と か ら 、MS 製 品 間 で の 安 全 性 基 準 の 整 合 性 を

と る 意 味 も 含 め 、HP 以 外 の MS 製 品 に つ い て も 、高 純 度 化 お よ び 製 造 工 程 に お

ける簡便な純度確認方法の検討が必要ではないかと考えられた。

-79-
 本 研 究 で は 、 HP お よ び LMWH 中 の MS 不 純 物 を OSCS お よ び CSF と 設 定

し て 各 検 討 を 実 施 し た 。 特 に 、 OSCS は 死 亡 例 を 含 む 重 篤 な 有 害 事 象 を 惹 き 起

す 原 因 物 質 で あ る と さ れ て い る 。し か し 、MS 中 の 不 純 物 は 必 ず し も 特 定 の MS

に限定されるものではない。有害事象の程度、また発生頻度は不明であるが、

M S 製 造 に お い て 混 入 す る 可 能 性 の あ る 不 純 物 、 例 え ば 、 1) 由 来 組 織 の 保 存

時 に 用 い る チ モ ー ル 等 の 防 腐 剤 、2) 粗 MS を 抽 出 す る 際 に 用 い る 塩 化 セ チ ル ピ

リ ジ ニ ウ ム 等 の 吸 着 剤 、3) MS の 分 解 /修 飾 時 に 用 い る 試 薬 、4) 溶 液 か ら MS を

回 収 す る 際 に 用 い る EtOH/MeOH 等 の 有 機 溶 媒 等 、 5) 各 種 の タ ン パ ク 質 /ペ プ

チ ド /ア ミ ノ 酸 /塩 類 等 が 挙 げ ら れ る 。そ し て こ れ ら は 、各 MS 製 品 の 粗 原 料 、ま

た 製 造 方 法 に よ っ て 変 動 す る こ と か ら 、MS 製 造 に お け る 工 程 管 理 に お い て 、今

後 何 ら か の プ ロ フ ァ イ リ ン グ が 必 要 で あ る と 考 え ら れ た 。 す な わ ち 、 HP お よ

び L M W H を 含 む M S 製 品 の 安 全 性 の 担 保 、ま た 安 定 供 給 の 確 保 の た め 、M S

以 外 の 物 質 で 製 品 中 に 混 入 す る 可 能 性 の あ る 物 質 に つ い て も 、効 率 的 に 除 去

す る 精 製 方 法 お よ び そ れ ら の 簡 便 な 検 出 方 法 を 開 発 す る こ と も 、今 後 の 検 討

課題であると考えられた。

以 上 の こ と か ら 、 本 研 究 で は 、 屠 畜 副 産 物 で あ る 腸 粘 膜 由 来 HP 等 の 安 全 性

向上を目指し、製造工程において実施可能な簡便かつ高感度の純度確認試験法

を 開 発 す る と と も に 、実 際 の 製 造 工 場 に お い て も 実 施 可 能 な 精 製 法 を 提 案 し た 。

これらの成果は医療現場に高品質な薬剤を持続供給することを可能にし、ひい

ては食肉製造副産物の円滑な再資源化に資するものであると考えられた。

-80-
Summary

F r o m t h e v i e w p o i n t o f t h e r e s o u r ce s r e c y c l i n g , i t i s im p o r t a n t t o u s e

b y - p r o d u c t s o f m e at p r o d u c t i o n a n d p ro c e s s i n g s u c h a s o f f a l a n d b o n e a s

recycled resources.

M S s ( M u c o p ol y s a c c h a r i d e s ) a r e b i o p o l y m e r s t h a t a r e f o u n d i n

animal tissues and organs, and it is involved in variety biological

a c t i v i t i e s i n vi vo . Specifically, MS would play important roles i n cell

proliferation, differentiation, and adhesion of cells to matrices. There

a r e v a r i o u s k i n d s of M S p r o d u c ts i n ma r k e t , a n d t h o s e r aw m a t e r i a l s a r e

a l s o f r o m v a r i o u s k i n d s o f a n i m a l c a r ca s s . MSs are used as health foods,

c o s m e t i c s , c h e m i c al r e a g e n t s a n d p h a r m a c e u t i c a l a g e n t s a l l o v e r t h e

world. Heparin (HP) and low molecular weight heparin (LMWH) are

m a d e m a i n l y f r o m cr u d e h e p a r i n ( C H P ) p r e p a r e d f r o m p o rc i n e i n t e s t i n a l

mucosa. Both HP and LMWH are widely used as injectable

anticoagulant agents.

In early 2008, side effects of intravenous HP product, including

d e a d c a s e s , w e r e r ep o r t e d f r o m t h e U n i t e d S t a t e s a n d G e rm a n y. Then, a

semi-synthetic oversulfated chondroitin sulfate (OSCS) was found in the

HP products, and it was concluded that the OSC S would cause the side

effect of the HP products through the severe anaphylactic reaction.

A f t e r w a r d s , a n a l y t i c a l m e t h o d s o f O S C S t o c o n f i r m i de n t i f i c a t i o n a n d

p u r i t y o f H P p r o d u c t s w e r e e x a m i n e d i n t h e m a j o r c o u n t r i e s o f t h e w o r l d,

-81-
and specification tests using 1H-NMR and ion exchange chromatography

a n d r e v e r s e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h y w e r e m a d e o b l i g a t o r y. However

these tests are difficult to do by each step of HP manufacturing because

those methods are expensive and troublesome. Moreover there is little

information about industrial purification method of HP to remove

contaminants from the bulk. Therefore the objective of this study was

( 1 ) t o e s t a b l i s h a n a n a l y t i c a l m e t h o d f o r d e t e c t i n g M S c o nt a m i n a n t s s u c h

a s O S C S a n d c h o n dr o i t i n s u l f a t e f a m i l y ( C S F ) i n H P a n d L M W H , a n d ( 2 )

t o d e v e l o p a l o w - c os t p u r i f y i n g p r o c e s s i n g o f b u l k s o f H P a n d L M W H t o

e n a b l e t o s u p p l y h i g h - q u a l i t y H P p r o d u c t s c o n t i n u o u s l y. I focused on

the reactive property of OSCS and CSF to de-polymerization with nitrous

acid and the difference of solubility of each MS in organic solvent to solve

these problems.

In the chapter 2, I investigated the reactive property of various MS

to de-polymerization with nitrous acid. H P, L M W H , O S C S , C S F ( t y p e - A ,

B , C , D a n d E ) , k e r a t a n s u l f a t e ( K S ) a n d h e p a r i n s u l f a t e ( H S ) w e re

de-polymerized with nitrous acid . Then molecular weight distribution s of

i n t a c t M S s a n d t h o s e d e g r a d e d p r o d u c t s w e r e m e a s u r e d an d c o m p a r e d b y

u s e o f a g e l p e r m e at i o n h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h e q u i p p e d

w i t h a d i f f e r e n t i a l r e f r a c t i v e i n d e x de t e c t o r. A s a r e s ul t , H P, L M W H

and HS were degraded with the accumulation of disaccharide units. On

the other hand, OSCS, all types of CSF and KS were resistant to

de-polymerization with nitrous acid. Furthermore the nitrous acid

-82-
de-polymerization / gel permeation HPLC method was able to detect

c o n t a m i n a n t s a t 0 . 0 1 % l e v e l o f H P, w h e r e a s t h e d e t e c t i o n l i m i t o f

1H-NMR m e t h o d w a s 0 . 1 % o r m o r e. This method is quite simple ,

economical and sensitive. T h e r e f o r e I c o n c l u d e d t h a t t h e p r o p o s ed

m e t h o d , i . e . , n i t r ou s a c i d d e - p o l y m e r i z a t i o n o f M S f o l l o w e d b y g e l

permeation HPLC, is the best method for detecting MS contaminated the

b u l k s o f H P a n d LM W H a t e a c h s t a g e s o f m a n u f a c t u r i n g p r o c e s s of M S

products.

I n t h e c h a p t e r 3 , I t r i e d t o de v e l o p a p u r i f i c a t i o n m e t h o d f o r

i n d u s t r i a l m a n u f a c t u r i n g o f H P p r o d uc t s f r om H P b u l k ba s e d o n e t h a n o l

precipitation (EtOH). F i n a l l y, p u r i f i e d H P w a s p r e c i pi t a t e d f r o m H P

b u l k a f t e r E t O H p re c i p i t a t i o n a t f i n a l E t O H c o n c e n t r a t i o n o f 3 3 % . The

r e c o v e r y r a t i o o f p u r i f i e d H P w a s 8 3 . 6% o f t o t a l H P b u l k , a n d t h e c o n t e n t

of impurities d e cr e a s e d to about 0.09% from 1.16% through this

purification process.

In the chapter 4, I also tried to develop a purification method for

LMWH from model LMWH bulks contaminat ed with OSCS and dermatan

sulfate (DS). I t w a s s h ow n t h a t th e t w o - s t e p p r o c es s i n g o f E t O H

fractionation was necessary to purify LMWH, i.e., OSCS was removed as

c o l l o i d a l p r e c i p i t a t e a t f i r s t E t O H f r ac t i o n a t i o n a n d D S w a s r e m o v e d i n

supernatant at the second fractionation. The content of impurities in

the purified LMWH decreased to about 0.04% from about 1.52% in this

process. M o r e o v e r, t h e r e c o v e r y r a t i o o f t h e p u r i f i e d L MW H w a s 8 7 . 2 % .

-83-
 T h e E t O H f r ac t i o n a t i o n p r o c e s s i n g , f o l l o w e d b y p u ri t y a n a l y s i s b y

g e l p e r m e a t i o n H P L C a f t e r n i t r o u s ac i d d e - p o l y m e r i z a t i o n o f M Ss , i s

q u i t e s i m p l e a n d lo w - c o s t . I n a d d i t io n , t h i s m e t h o d d oe s n o t n e e d t o

install any specialized equipment. Therefore I concluded that the

m e t h o d s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y c o u ld b e a n ef f e c t i v e w a y t o p r o d u c e

h i g h - q u a l i t y H P p r o d u c t s f r o m b u l k s o f H P a n d L M W H in t h e i n d u s t r i a l

manufacturing. In addition, this manufacturing process also could be

a p p l i c a b l e t o p r o d u c t i o n o f o t h e r M S s u c h a s C S F. Producing highly

p u r i f i e d M S p r o d uc t s w o u l d r es u l t i n s u p p l y i n g n o t o n l y s a f e r m e d i c a l

agents to medical front but also safer cosmetics and health foods to

general consumers. Continuous consumption of h ig h - q u a l i t y MS

p r o d u c t s c o u l d e n s u r e t h e s u s t a i n a b l e u t i l i z a t i o n o f b y - p r o d u c t s f r om

animal carcass.

-84-
謝 辞

本研究の遂行にあたり、終始御懇篤なる御指導と御鞭撻を賜り、さらに御高

閲の労をお取り戴きました宮崎大学農学部応用生物科学科 河原聡准教授に対

し、心より感謝致します。また、本研究を行う間、数々の御指導と御高閲の労

をお取り戴きました宮崎大学 六車三治男名誉教授に心より感謝申し上げます。

さ ら に 、御 高 閲 の 労 を 戴 き ま し た 宮 崎 大 学 農 学 部 入 江 正 和 教 授 、森 田 哲 夫 教 授

に 心 よ り 感 謝 申 し 上 げ ま す 。ま た 、諸 便 宜 を ご 配 慮 戴 き ま し た 農 学 部 芦 澤 幸 二

教 授 、工 学 部 鈴 木 祥 広 教 授 に 心 よ り 感 謝 申 し 上 げ ま す 。そ し て 、本 研 究 の 立 ち

上げに際し、御高閲の労を戴きました伊藤ハム株式会社 前々中央研究所所長

中村豊朗氏に深く感謝申し上げます。

本研究を進めるにあたり、扶桑薬品工業株式会社 代表取締役社長 戸田幹雄

氏 、取 締 役 研 究 開 発 セ ン タ ー 所 長 戸 田 隆 雄 氏 、研 究 開 発 セ ン タ ー 部 長 植 村 英

俊氏、研究開発センター課長 山本啓一氏、研究開発センター課長 松久明生氏

には大学院入学の機会を与えて戴き、さらに研究上の諸便宜もご配慮戴きまし

た。そして生物由来生理活性物質の抽出方法、修飾方法および国内外の臨床利

用例について多くのご教示ご指導戴きました故奥山 隆先生に心から御礼申し

上げます。

また、御協力・御支援戴きました宮崎大学農学部応用生物科学科畜産食品科

学研究室の学生の皆様方、そして、扶桑薬品工業株式会社研究開発センターの

皆様方に深く感謝致します。

-85-
参考文献

A k i y a m a F. , S e n o N . 1 9 7 3 . S t u d i e s o n t h e m u c o p o l y s a c c h a r i d e s f r o m

h a g f i s h s k i n . N a r ur a l s c i e nc e r e p o r t , O c ha no m i zu U ni v e r s i t y, 2 3 ,

79-100.

A n d e r s s o n L . - O . , Ba r r o w c l i f f e T. W. , H o l m e r E . , J o h m s o n E . A . , S i m G . E . C .

1976. Anticoagulant properties of heparin fractionated by affinity

chromatography on matrix-bound antithrombin III and by gel

f i l t r a t i o n . Thr o m b o s i s Re s e a r c h , 9 , 5 75 - 5 8 3 .

B e r n a r d i G . , H a pp e y F. , N a y l o r A . 1 9 5 7 . M u c o p o l y s a c c h a r i d e s f r o m

c a r t i l a g e a n d n u c l e u s p u l p o s u s . N a t ure , 1 8 0 , 1 3 4 1 - 1 3 4 2 .

B e y e r T. , D i e h l B. , R a n d e l G . , H um p f e r E . , S c h a f e r H . , S pr a u l M . ,

Schollmayer C., Holzgrabea U. 2008. Quality assessment of

unfractionated heparin using 1H nuclear magnetic resonance

s p e c t r o s c o p y. J o ur na l o f Pha r m a c e ut i c a l a nd Bi o m e d i c a l Ana l ys i s ,

48, 13-19.

C h a r l e s A . F. , S c o t t D . A . 1 9 3 3 . S t u d i e s o n h e p a r i n I I h e p a r i n i n v a r i o u s

t i s s u e s . The J o ur na l o f Bi o l o gi c a l Che m i s t r y , 1 0 2 , 4 3 1 - 4 3 5 .

Coyne E. 1977. Heparin manufacturing processes. Fe d e r a t i o n

Pr o c e e d i ngs , 3 6 , 3 2 .

D a m u s P. S . , H i c k s M . , R o s e n b e r g R . D . 1 9 7 3 . A n t i c o a g u l a n t a c t i o n o f

h e p a r i n . N a t ur e , 2 4 , 3 5 5 - 3 5 7 .

D e d e m G . V, N i e l s en J . I . 1 9 9 1 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e m o l e c u l a r m a s s o f

-86-
 l o w m o l e c u l a r m a s s （ L M W ） h e p a r i n . Pha r m e ur o p a , 3 , 2 0 2 - 2 1 8 .

G r i f f i n C . C . , L i n h a r d t R . J . , G o r p C . L . V. , To i d a T. , H i l e m a n R . E . ,

Schubert R.L.II., Brown S.E. 1995. Isolation and characterization of

h e p a r a s u l f a t e f r om c r u d e p o r c i n e i n te s t i n a l m u c o s a l p ep t i d e g l y c a n

h e p a r i n . Ca r b o h yd r a t e Re s e a r c h , 2 7 6 , 1 8 3 - 1 9 7 .

G u e r r i n i M . , B e c c a t i D . , S h r i v e r Z . , N a g g i A . , Vi s w a n a t h a n K . , B i s i o A . ,

Capila I., Lansing J.C., Guglieri S., Fraser B., Al -Hakim A., Gunay

N . S . , Z h a n g Z . , R o b i n s o n L . , B u h s e L . , N a s r M . , Wo o d c o c k J . , L a n g e r

R., Ve n k a t a r a m a n G., Linhardt R.J., Casu B., To r r i 1 G.,

Sasisekharan R. 2008. Oversulfated chondroitin sulfate is a

contaminant in heparin associated with adverse clinical events.

N a t ur e Bi o t e c hno l o gy , 2 6 , 6 6 9 - 6 7 5 .

橋井則貴, 川崎ナナ, 高倉大輔, 伊藤さつき, 川原信夫, 正田卓司, 杉本直

樹, 蓜島由二, 品川麻衣, 榛葉信久, 宮田一義, 塚本秀樹, 千秋和久,

長谷川秦介, 河合健蔵, 余田光, 木下充弘, 栫直孝, 木下充弘, 掛樋一

晃 , 合 田 幸 弘 , 奥 田 晴 宏 , 棚 元 憲 一 , 山 口 照 英 . 2008a. ヘ パ リ ン 純 度 試

験 に 関 す る 研 究 （ 第 一 報 ） 1H-NMR に よ る ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 純 度 試

験 に 関 す る 研 究 . 医 薬 品 研 究 , 39, 651-659.

橋井則貴, 川崎ナナ, 高倉大輔, 伊藤さつき, 福原潔, 品川麻衣, 榛葉信久,

有 村 雅 俊 , 辰 巳 昌 史 , 奥 田 晴 宏 , 山 口 照 英 . 2008b. ヘ パ リ ン 純 度 試 験

に 関 す る 研 究 （ 第 二 報 ） 1H-NMR に よ る ヘ パ リ ン カ ル シ ウ ム 純 度 試 験

に 関 す る 研 究 . 医 薬 品 研 究 , 39, 660-664.

橋井則貴, 川崎ナナ, 正田卓司, 福原潔, 品川麻衣, 榛葉信久, 嶋村英雄,

-87-
 河 合 健 蔵 , 余 田 光 , 奥 田 晴 宏 , 山 口 照 英 . 2010. ヘ パ リ ン 純 度 試 験 に 関

す る 研 究 （ 第 五 報 ） 1H-NMR に よ る ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 確 認 試 験 及 び

純 度 試 験 に 関 す る 研 究 . 医 薬 品 医 療 機 器 レ ギ ュ ラ ト リ ー サ イ エ ン ス , 41,

469-476.

橋 井 則 貴 , 川 崎 ナ ナ , 秦 艶 , 山 口 照 英 . 2 0 11 . ヘ パ リ ン 純 度 試 験 に 関 す る 研

究（ 第 六 報 ）日 局 医 薬 品 各 条 ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 確 認 試 験 及 び 純 度 試 験

の改正に伴うヘパリンナトリウム標準品の品質確保に関する研究. 医

薬 品 医 療 機 器 レ ギ ュ ラ ト リ ー サ イ エ ン ス , 42, 827-835.

橋 井 則 貴 , 蛭 田 葉 子 , 石 井 明 子 , 鈴 木 琢 雄 , 夏 賀 徹 ,鈴 木 律 子 , 杉 山 和 喜 , 渡

部沙木絵, 中川ゆかり, 板東綾, 関本裕子, 宮田一義, 大津卓磨, 宮澤

亜矢子, 近藤匠, 藤田祐司, 宮永直幸, 嶋田徳彦, 石賀肇, 余田光, 嶋

村 英 雄 , 川 崎 ナ ナ . 2012. ヘ パ リ ン 純 度 試 験 に 関 す る 研 究 （ 第 七 報 ） 日

本薬局方各条ヘパリンナトリウム及びヘパリンカルシウムのタンパク

質及び核酸純度試験法に関する研究. 医薬品医療機器レギュラトリー

サ イ エ ン ス , 43, 1050-1058.

Ishihara M., Ono K. 1998. Structure and Function of Heparin and

Heparan Sulfate; Heparinoid Library and Modification of

F G F - A c t i v i t i e s . Tr e nd s i n G l yc o s c i e nc e a nd G l yc o t e c hn o l o gy , 1 0 ,

223-233.

石 井 明 子 , 橋 井 則 貴 , 鈴 木 琢 雄 , 川 崎 ナ ナ . 2 0 11 . ヘ パ リ ン 製 剤 の 品 質 確 保

に関する国際的動向. －第 4 回ヘパリン製剤の品質評価に関するワー

ク シ ョ ッ プ 報 告 － . 医 薬 品 医 療 機 器 レ ギ ュ ラ ト リ ー サ イ エ ン ス , 42 ,

448-464.

-88-
今 成 登 志 男 , 戸 井 田 敏 彦 , Linhardt R.J. 1999. 過 硫 酸 化 コ ン ド ロ イ チ ン 硫

酸, その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤,

特 開 平 11-166001.

掛樋一晃, 栫直孝, 木下充弘, 橋井則貴, 川崎ナナ, 寺尾敏光, 河合健蔵,

余 田 光 , 山 口 照 英 . 2008. ヘ パ リ ン 純 度 試 験 に 関 す る 研 究 （ 第 三 報 ） キ

ャピラリー電気泳動法によるヘパリンナトリウム不純物の分析. 医薬

品 研 究 , 39, 713-720.

栫 直 孝 , 木 下 充 弘 , 川 崎 ナ ナ , 山 口 照 英 , 早 川 堯 夫 , 掛 樋 一 晃 . 2009. 日 本 薬

局方医薬品各条ヘパリンナトリウム純度試験へのキャピラリー電気泳

動 法 の 適 用 に つ い て . 薬 学 雑 誌 , 129, 1255-1264.

K a w a i Y. , S e n o N. , A n n o K . 1 9 6 6 . C h o n d r o i t i n p o l y s u l f a t e o f s q u i d

c a r t i l a g e . J o ur na l o f Bi o c he m i s t r y , 6 0 , 3 1 7 - 3 2 1 .

川崎ナナ, 橋井則貴, 杉本直樹, 高倉大輔, 秦艶, 細山沙織, 戸井田敏彦,

山 口 照 英 . 2008. ヘ パ リ ン 純 度 試 験 に 関 す る 研 究 （ 第 四 報 ） 合 成 過 硫 酸

化コンドロイチン硫酸の日局標準品としての適用性の評価. 医薬品研

究 , 39, 721-729.

K i s h i m o t o T. K . , Vi s w a n a t h a n K . , G a n g u l y T. , E l a n k u m a r a n S . , S m i t h S . ,

Pelzer K., Lansing J.C., S r i r an g a n a t h a n N., Zhao G.,

Galcheva-Gargova, Z., Al-Hakim A., Bailey G.S., Fraser B., Roy S.,

R o g e r s - C o t r o n e T. , B u h s e L . , W h a r y M . , F o x J . , N a s r M. , D a l P a n

G . J . , S h r i v e r Z . , L a n g e r R . S . , Ve n k a t a r a m a n G . , A u s t e n K . F. ,

Wo o d c o c k J. Sasisekharan R. 2008. Contaminated heparin

a s s o c i a t e d w i t h a d ve r s e c l i n i c a l e v e n t s a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o n t a c t

-89-
 s y s t e m . The N e w Engl a nd J o ur na l o f M e d i c i ne , 3 5 8 , 2 4 5 7 - 2 4 6 7 .

K i t a g a w a H . , Ta n a k a Y. , Ya m a d a S. , S e n o N . , S t u a r t M. , H a s l a m S . M . ,

Morris H.R., Dell A., Sugahara K. 1997. A novel pentasaccharide

sequence

GlcA(3-sulfate)(beta1-3)GalNAc(4-sulfate)(beta1-4)(Fucalpha1-3)Gl

c A ( b e t a 1 - 3 ) G a l N A c ( 4 - s u l f a t e ) i n t h e ol i g o s a c c h a r i d e s i s o l a t e d f r o m

king crab cartilage chondroitin sulfate K and its differential

s u s c e p t i b i l i t y t o c ho n d r o i t i n a s e s a n d h y a l u r o n i d a s e . Bi o c he m i s t r y ,

36, 3998-4008.

厚 生 労 働 省 . 2008. 厚 生 労 働 省 告 知 第 417 号 .

厚 生 労 働 省 . 2010. 厚 生 労 働 省 告 示 第 322 号 .

厚 生 労 働 省 . 2006. パ ル ナ パ リ ン ナ ト リ ウ ム . 第 15 改 正 日 本 薬 局 方 , pp.

855-856.

厚 生 労 働 省 . 2 0 11 . パ ル ナ パ リ ン ナ ト リ ウ ム . 第 1 6 改 正 日 本 薬 局 方 , p p .

1042-1044.

厚 生 労 働 省 . 2 0 11 . ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム . 第 1 6 改 正 日 本 薬 局 方 , p p .

1247-1249.

Lee S.E., Chess E.K., Rabinow B., Ray G.J., Szabo C.M., Melnick B.,

Miller R . L . , N a i r L . M . , M o o r e E . G . 2 0 11 . N M R o f h ep a r i n A P I :

investigation of unidentified signals in the USP-specified range of

2.12–3.00ppm. An a l yt i c a l a nd B i o a na l yt i c a l Che m i s t r y , 399,

651-662.

L i n h a r d t R . J . , L o g a n a t h a n D . , A l - H a k i m A . , Wa n g H - M . , Wa l e n g a J . M . ,

-90-
 Hoppenstead D., Fareed J. 1990. Oligosaccharide mapping of low

molecular weight heparins: Structure and activity differences.

J o ur na l o f M e d i c i n a l Che m i s t r y , 3 3 , 1 6 3 9 - 1 6 4 5 .

Linhardt R.J., Gunay N.S. 1999. Production and chemical processing of

low molecular w ei g h t heparins. S e m i na r s in t hr o mb o s i s a nd

he m o s t a s i s , 2 5 , s u p p l , 3 , 5 - 1 6 .

M a t s u d a M . , W o r aw a t t a n a m a t e e k u l W . , O k u t a n i K . 1 9 92 . S i m u l t a n e o u s

production of m uc o - and sulfated polysaccharides by Marine

Ps e ud o m o na s . 日 本 水 産 学 会 誌 , 5 8 , 1 7 3 5 - 1 7 4 1 .

M e y e r K . , P a l m e r J . W. w i t h t h e a s s i s t a n c e o f S m y t h E M . 1 9 3 6 . O n

glycoproteins: II. T h e p o l y s a c c h a r i d e s o f v i t r e o u s h u mo r a n d o f

u m b i l i c a l c o r d . The J o ur na l o f Bi o l o g i c a l Che m i s t r y , 11 4 , 6 8 9 - 7 0 3 .

Meyer K. 1938. The chemistry and biology of mucopolysaccharides and

glycoproteins. Co l d S p r i ng Harbor S ym p o s i a on Qua nt i t a t i v e

Bi o l o g y , 6 , 9 1 - 1 0 2 .

M e y e r K . , C h a f f e e E . 1 9 4 1 . T h e m u c o p o l y s a c c h a r i d e s o f s k i n . The J o ur na l

o f Bi o l o gi c a l C he m i s t r y , 1 3 8 , 4 9 1 - 4 9 9 .

M c l e a n J . 1 9 1 6 . T h e t h r o m b o p l a s t i c a c t i o n o f c e p h a l i n . A m e r i c a n J o ur na l

o f Phys i o l o g y , 4 1 , 2 5 0 - 2 5 7 .

M u r r a y D . W. G . , J a q u e s L . B . , P e r r e t t T. S . , B e s t C . H . 1 9 37 . H e p a r i n a n d

t h e t h r o m b o s i s o f ve i n s f o l l o w i n g i n j u r y. S ur ge r y , 2 , 1 6 3 - 1 8 7 .

M u r r a y G . D . W. 1 94 0 . H e p a r i n i n t h r o m b o s i s a n d e m b o l i s m . Br i t i s h

J o ur na l o f S ur ge r y , 2 7 , 3 2 4 - 3 3 6 .

-91-
日 本 透 析 医 学 会 .:

日本透析医学会統計調査委員会: 図説わが国の慢性透析療法の現況

(2012 年 12 月 31 日 現 在 ). 日 本 透 析 医 学 会 , 東 京 , 2013.

＜ h t t p : / / d o cs . j s d t . or. j p / o v e r v i e w / p d f 2 0 1 3 / p 0 0 3 . p d f ＞ c r e at e d o n 2 6

Jun. 2013.

日 本 透 析 医 学 会 .:

日本透析医学会統計調査委員会: 図説わが国の慢性透析療法の現況

(2003 年 12 月 31 日 現 在 ). 日 本 透 析 医 学 会 , 東 京 , 2004

＜ h t t p : / / d o c s . j s d t . or. j p / o v e r v i e w / p d f 2 0 0 4 / p 3 8 . p d f ＞ c r e at e d o n 2 4

Aug. 2004.

奥 山 隆 , 佐 々 木 勧 , 村 田 克 己 , 吉 澤 善 作 監 修 . 1979. ヘ パ リ ノ イ ド の 化 学 と

薬 理 , 「 ヘ パ リ ン 」 ,（ 講 談 社 , 東 京 ） , 234-235.

P e a r c e R . H . , M a th i e s o n J . M . , G r i mm e r B . J . 1 9 6 8 . F r a c t i o n a t i o n o f

anionic glycosaminoglycans by ion -exchange c h r o m a t o g r a p h y.

Ana l yt i c a l Bi o c he m i s t r y , 2 4 , 1 4 1 - 1 5 6 .

R o d e n L . , D o r f m a n A . 1 9 5 9 . T h e a c id m u c o p o l y s a c c h a r i d e s o f F u r t h ’s

m a s t o c y t o m a i n t h e m o u s e . Ac t a Che m i c a S c a nd i na vi c a , 1 3 , 2 1 2 1 .

Suzuki S. 1960. Isolation of novel disaccharides f r om chondroitin

sulfates. The J o u r na l o f Bi o l o gi c a l C he m i s t r y , 2 3 5 , 3 5 8 0 - 3 5 8 8 .

S e n o N . , M u r a k a m i K . 1 9 8 2 . S t r u c t u re o f d i s u l f a t e d d i s ac c h a r i d e s f r o m

c h o n d r o i t i n p o l y s u l f a t e s , c h o n d r o i t i n s u l f a t e D a n d K . Ca r b o hyd r a t e

Re s e a r c h , 1 0 3 , 1 9 0 - 1 9 4 .

Soda T., Egami F. 1938. Glucosulfatase. XX. Separation of

-92-
 chondrosulfatase coexisting with glucosulfatase in the liver of

C h a r i o n a l a m p a s a n d o n t h e n a t u r e o f t h i s e n z y m e . J o u r na l o f t he

Che m i c a l S o c i e t y o f J a p a n , 5 9 , 1 2 0 2 - 1 2 1 1 .

戸 井 田 敏 彦 . 2 0 11 . 日 本 及 び 米 国 の 健 康 食 品 に 配 合 さ れ た コ ン ド ロ イ チ ン 硫

酸 の 品 質 評 価 . 日 本 食 品 科 学 工 学 会 誌 , 1 8 , 3 5 - 4 2 2 0 11 .

To i d a T. , L i n h a r d t R . J . 1 9 9 8 . S t r u c t u r a l a n a l y s i s o f h e p a r a n s u l f a t e a n d

heparan sulfate oligosaccharides. Tr e nd s in G l yc o s c i e nc e a nd

G l yc o t e c hno l o g y , 1 0 , 1 2 5 - 1 3 6 .

Thunberg L., Backstrom G., Lindahl U. 1982. Further characterization of

the antithrombin-binding sequence in heparin. Ca r b o hyd r a t e

Re s e a r c h , 1 0 0 , 3 9 3 - 4 1 0 .

U.K. Medicines and Healthcare products Regulatory Agency （ MHRA） .:

＜ h t t p : / / w w w. m h r a . g o v. u k / P u b l i c a t i o n s / S a f e t y w a r n i n g s / D r u g A l e r t s /

CON017989＞ , cited on 06 Jun. 2008.

U . S . F o o d a n d D r ug A d m i n i s t r a t i o n （ F D A ） . :

＜ h t t p / / w w w. f d a . g o v / c d e r / d r u g / i n f o p a g e / h e p a r i n / d e f a u l t . htm . ＞ ,

cited on 28 Feb. 2008.

八 藤 後 武 美 , 村 田 浩 志 . 2002. 低 分 子 量 ヘ パ リ ン の 製 造 法 , 特 開

2002-293804.

Z h a n g Z . , We ï w e r M. , L i B . , K e m p M . M. , D a m a n T. H . , L i n h a r d t R . J . 2 0 0 8 .

O v e r s u l f a t e d c h o n d r o i t i n s u l f a t e : Im p a c t o f a h e p a r in i m p u r i t y,

a s s o c i a t e d w i t h a dv e r s e c l i n i c a l e v e n t s , o n l o w - m o l e cu l a r- w e i g h t

h e p a r i n p r e p a r a t i o n . J o u r n a l o f M e d i c in a l C h e m is t r y , 5 1 , 5 4 9 8 - 5 5 0 1 .

-93-