Machine Translated by Google

19
BÀI TẬP

VI TRÙNG HỌC Định lượng vi khuẩn:

Số lượng tấm tiêu chuẩn

các ống có đường lactoza được cấy mẫu nước, và mẫu của
Kết quả học tập các ống có axit và khí được so sánh với các bảng thống kê
cung cấp số lượng có thể có của các dạng coli hiện diện.
Sau khi hoàn thành bài tập này, bạn sẽ có thể 1. Giải
Bạn sẽ sử dụng quy trình này trong Bài tập 59 để kiểm tra
thích các phương pháp khác nhau được sử dụng để đếm vi nước xem có vi khuẩn coliform hay không. Phương pháp MPN
khuẩn.
được giới hạn để thử nghiệm khi các bảng thống kê đã

2. Thực hiện đếm đĩa tiêu chuẩn để xác định số lượng được thiết lập cho một tham số tăng trưởng cụ thể.

vi khuẩn trong mẫu.

Đếm đĩa tiêu chuẩn (SPC) Đĩa tiêu chuẩn, hoặc số lượng
3. Sử dụng máy đo quang phổ để đo sự gia tăng độ đục khả thi, là một trong những phương pháp phổ biến nhất để
của dịch nuôi cấy bằng cách xác định mật độ quang.
xác định số lượng vi khuẩn trong mẫu. Một mẫu được pha
4. Liên hệ kết quả xác định độ đục với số lượng đĩa tiêu loãng trong một loạt các khoảng trống pha loãng, như thể
chuẩn của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. hiện trong hình 19.1. Các phần dịch pha loãng sau đó được
mạ lên môi trường và số lượng khuẩn lạc được đếm sau
khi ủ từ 24 đến 48 giờ. Người ta cho rằng các tế bào vi

Việc xác định số lượng vi khuẩn trong một mẫu thường khuẩn được pha loãng đến điểm kết thúc khi một tế bào đơn
lẻ phân chia, tạo ra một khuẩn lạc có thể nhìn thấy trên đĩa.
rất cần thiết. Ví dụ, việc phân loại sữa dựa trên số
Số lượng vi khuẩn trong mẫu ban đầu được xác định bằng
lượng vi khuẩn có mặt. Việc bệnh nhân có bị nhiễm trùng
cách nhân số lượng khuẩn lạc với hệ số pha loãng. Tuy
bàng quang hay không phụ thuộc vào một ngưỡng nhất định
nhiên, giả định rằng một khuẩn lạc đại diện cho một ô duy
của vi khuẩn có trong mẫu nước tiểu. Đôi khi điều quan
nhất không phải lúc nào cũng đúng vì các tế bào trong một
trọng là phải biết có bao nhiêu vi khuẩn có trong thực
chuỗi, chẳng hạn như Streptococcus, cũng sẽ tạo ra một
phẩm hoặc nước để đảm bảo an toàn. Một số phương pháp
khuẩn lạc trên đĩa. Do không chắc chắn về số lượng tế bào
khác nhau có thể được sử dụng để xác định số lượng tế
thực sự tạo thành một khuẩn lạc, số lượng của SPC được
bào vi khuẩn và mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và
báo cáo là các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).
nhược điểm riêng. Việc sử dụng một phương pháp này so
Chỉ những con số từ 30 đến 300 CFU mới được coi là hợp
với phương pháp khác sẽ được quyết định bởi mục đích của
lệ về mặt thống kê. Nếu CFU lớn hơn 300, có khả năng xảy
nghiên cứu. Sau đây là một số phương pháp trực tiếp để
ra tình trạng quá tải trên
xác định số lượng vi khuẩn:

Đếm bằng kính hiển vi Một mẫu có thể được pha loãng và
các tế bào trong mẫu có thể được đếm với sự trợ giúp của
kính hiển vi. Các slide đặc biệt, chẳng hạn như buồng
Petroff-Hauser, tạo điều kiện thuận lợi cho việc đếm vì
slide có dạng lưới và lượng mẫu được đưa vào lưới được 1ml 1ml 1ml
biết trước. Các mẫu sữa có thể được đếm bằng kính hiển Một b c
vi với độ tin cậy và độ tin cậy cao. 99 ml 99 ml 99 ml
Văn hoá 1:100 1:10.000 1:1.000.000
Most Probable Number (MPN) Số lượng vi khuẩn trong một
mẫu có thể được xác định bằng mối quan hệ của một số tham
số tăng trưởng với xác suất thống kê. Độ an toàn của 0,1ml 0,1ml
nước uống phụ thuộc vào việc nước uống không bị nhiễm
bẩn do nước thải và điều này được kiểm tra bằng phương 1:100.000 1:10.000.000

pháp MPN. Vi khuẩn chỉ thị được gọi là coliforms, được 1,0ml 1,0ml
tìm thấy trong ruột của người và động vật máu nóng, lên
men đường sữa để tạo ra axit và khí. Sự hiện diện của 1:10.000 1:1.000.000

những vi khuẩn này trong mẫu nước cho thấy khả năng gây
bệnh. Một loạt các Hình 19.1 Quy trình mạ định lượng.

139
Machine Translated by Google

BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn

tấm có thể đã ức chế một số tế bào phát triển. làm nguội đến 50C, sau đó được đổ vào từng đĩa. Sau khi thạch
Ít hơn 30 CFU có thể liên quan đến lỗi lấy mẫu và đánh giá dinh dưỡng đông lại, các đĩa được ủ trong 24 đến 48 giờ và
thấp các con số. Phương pháp SPC chỉ xác định các tế bào khả
được kiểm tra. Một đĩa có từ 30 đến 300 khuẩn lạc được chọn
thi, trong khi số lượng vi thể xác định cả tế bào sống và tế để đếm. Từ số đếm, việc tính toán số lượng sinh vật trên mỗi

bào chết. Ngoài ra, phương pháp SPC bị sai lệch vì các điều mililit của môi trường nuôi cấy ban đầu là một vấn đề đơn
kiện và môi trường cụ thể được sử dụng và những yếu tố này giản. Cần chỉ ra rằng có thể đạt được độ chính xác cao hơn
có thể loại trừ một số vi khuẩn nhất định trong số lượng. Ví bằng cách đổ hai đĩa cho mỗi độ pha loãng và lấy trung bình
dụ, SPC sẽ đánh giá thấp số lượng vi khuẩn trong một mẫu đất các số đếm. Người hướng dẫn của bạn sẽ tư vấn nếu thực hiện
vì các điều kiện và môi trường được sử dụng để đếm có thể mạ trùng lặp.
ủng hộ các vi khuẩn dị dưỡng phát triển hiếu khí ở các giá
trị pH trung tính. Những điều kiện này không cho phép sự phát
triển của vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hóa dưỡng hoặc vi khuẩn Xử lý pipet Thành công

có thể phát triển ở mức độ pH quá cao. trong thí nghiệm này phụ thuộc đáng kể vào kỹ thuật pipet
thích hợp. Pipet có thể có sẵn cho bạn trong hộp kim loại hoặc
trong phong bì riêng lẻ; chúng có thể dùng một lần hoặc tái
Phương pháp gián tiếp Đôi khi người ta chỉ muốn biết liệu sử dụng. Do các nguy cơ tiềm ẩn, không được phép hút pipet
các tế bào có đang phát triển hay không và do đó, có tăng về bằng miệng và do đó, tất cả việc hút pipet đều được thực hiện
số lượng hay không. Sự tăng trưởng có thể liên quan đến một bằng cách sử dụng dụng cụ hỗ trợ pipet. Người hướng dẫn của
số thông số tăng lên cùng với sự phân chia tế bào. Các tế bào bạn sẽ chỉ ra các kỹ thuật sẽ chiếm ưu thế trong phòng thí nghiệm này.
đang phát triển làm tăng hàm lượng protein, axit nucleic và Nếu đây là lần đầu tiên bạn sử dụng pipet vô trùng, hãy tham
khối lượng vì các tế bào đang phân chia. Do đó, các phép đo khảo hình 19.2, lưu ý những điểm sau:
protein, DNA và trọng lượng khô có thể được sử dụng để theo
• Khi lấy một pipet vô trùng ra khỏi hộp đựng, hãy làm như
dõi sự tăng trưởng. Tương tự như vậy, môi trường nuôi cấy
vậy mà không làm nhiễm bẩn đầu của các pipet khác bằng
sẽ trở nên đục hơn khi các tế bào phân chia và độ đục của môi
ngón tay của bạn. Điều này có thể được thực hiện bằng
trường nuôi cấy có thể được xác định và liên quan đến sự
cách nhẹ nhàng di chuyển ống đựng từ bên này sang bên kia
phát triển. Độ đục của tế bào có thể được đo bằng máy đo
để cố gắng cách ly một pipet với phần còn lại. • Sau khi
quang phổ, đo độ hấp thụ hoặc mật độ quang của môi trường
tháo pipet, hãy đậy nắp hộp để duy trì tính vô trùng của các
nuôi cấy. Thông thường, một đường cong chuẩn được xây dựng
pipet còn lại.
liên quan đến mật độ quang học với số lượng vi khuẩn thực tế
được xác định bởi SPC. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng cả tế bào
• Không dùng ngón tay chạm vào thân pipet hoặc đặt pipet
sống và tế bào chết đều góp phần làm cho dịch nuôi cấy bị đục,
xuống bàn trước hoặc sau khi sử dụng. Giữ pipet đó vô
đây cũng là nhược điểm của phương pháp này.
trùng cho đến khi bạn sử dụng xong và không làm nhiễm bẩn
bàn hoặc chính bạn sau khi bạn sử dụng. • Luôn sử dụng
Trong bài tập sau, bạn sẽ sử dụng SPC để xác định số lượng
vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Bạn cũng sẽ đo độ đục của thiết bị pipet cơ học như thiết bị trong minh họa 3,
hình 19.2. • Mỗi lần chỉ tháo và sử dụng một pipet; nếu bạn
môi trường nuôi cấy và vẽ các giá trị mật độ quang học của
cần ba pipet cho toàn bộ thí nghiệm và loại bỏ cả ba
các mẫu đã pha loãng.
trong số chúng cùng một lúc, thì không có cách nào bạn có
thể giữ hai trong số chúng vô trùng trong khi bạn đang
Phương pháp mạ định lượng sử dụng cái đầu tiên. • Khi sử dụng pipet xong, hãy đặt
nó vào hộp đựng thẻ đĩa. Hộp đựng rác sẽ có chất khử
(Đếm đĩa tiêu chuẩn)
trùng trong đó. Vào cuối giai đoạn, các pipet có thể tái

Để xác định số lượng sinh vật có trong nước, sữa và thực sử dụng sẽ được rửa và khử trùng bởi trợ lý phòng thí
nghiệm. Các pipet dùng một lần sẽ bị loại bỏ. Học sinh
phẩm, quy trình đếm đĩa tiêu chuẩn (SPC) được sử dụng rộng
rãi. Nó tương đối dễ thực hiện và cho kết quả xuất sắc. Chúng được biết là lơ đãng trả lại pipet đã sử dụng vào hộp vô

ta cũng có thể sử dụng kỹ thuật cơ bản này để tính số lượng trùng ban đầu, và đôi khi, thậm chí ném chúng vào sọt

sinh vật trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Về mặt này, rác. Chúng tôi chắc chắn rằng không ai trong phòng thí
nghiệm này sẽ làm điều đó!
nhiệm vụ này được thiết lập.

Quy trình bao gồm pha loãng các vi sinh vật với một loạt
các mẫu trắng nước vô trùng, như minh họa trong hình 19.1.

Nói chung, chỉ cần ba chai, nhưng có thể dùng nhiều hơn nếu
cần. Bằng cách sử dụng quy trình pha loãng được chỉ ra ở đây,
độ pha loãng cuối cùng là 1:1.000.000 xuất hiện trong mẫu
trắng C. Từ mẫu trắng B và C, lượng vi sinh vật đã pha loãng
Quy trình pha loãng và mạ
đo được sẽ được chuyển vào các đĩa petri trống. Thạch dinh Tiến hành như sau để pha loãng dịch cấy E. coli và đổ bốn

dưỡng, đĩa, như minh họa trong hình 19.1.

140
Machine Translated by Google

Đếm vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn BÀI TẬP 19

ĐỪNG!

(1) Các pipet tái sử dụng có thể có sẵn trong phong bì dùng một lần hoặc (2) Không bao giờ dùng ngón tay chạm vào đầu hoặc thân pipet.

hộp kim loại. Khi sử dụng pipet từ hộp, nhớ đậy nắp sau khi lấy pipet Làm nhiễm bẩn pipet sẽ làm nhiễm bẩn công việc của bạn.

ra.

(3) Sử dụng dụng cụ hỗ trợ pipet cho tất cả các thao tác hút pipet trong (4) Sau khi sử dụng pipet, hãy đặt nó vào hộp đựng.

phòng thí nghiệm. Hút pipet bằng miệng quá nguy hiểm. Ngay cả pipet “dùng một lần” cũng phải được đặt ở đây.

Hình 19.2 Kỹ thuật xử lý pipet.

2. Lắc dịch cấy E. coli và chuyển 1 ml sinh vật vào mẫu trắng
Nguyên vật liệu
A, sử dụng pipet 1,1 ml vô trùng. Sau khi sử dụng pipet,

mỗi 4 học sinh: • đặt nó vào hộp loại bỏ.

1 chai (40 ml) môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli
3. Lắc trống A 25 lần theo hình vòng cung 1 foot trong 7
cho mỗi học sinh: • 1 chai (80 ml) thạch dinh dưỡng •

4 đĩa petri • Pipet 1,1 ml • 3 khoảng trống nước 99 giây với khuỷu tay của bạn trên bàn, như trong hình 19.3.

ml vô trùng • hộp đựng pipet đã loại bỏ Lắc mạnh không chỉ giúp phân phối tốt mà còn phá vỡ các
khối vi khuẩn.

4. Dùng pipet 1,1 ml khác, chuyển 1 ml từ mẫu trắng A sang

mẫu trắng B.

1. Làm lỏng một lọ thạch dinh dưỡng. Trong khi nó đang được 5. Lắc nước mẫu trắng B 25 lần theo cách tương tự.

làm nóng, dán nhãn cho ba mẫu trắng nước vô trùng 99 ml 6. Dùng pipet vô trùng khác, chuyển 0,1 ml từ mẫu trắng B
A, B và C. Đồng thời, dán nhãn cho bốn đĩa petri 1:10.000, sang đĩa 1:100.000 và 1,0 ml vào đĩa 1:10.000. Với cùng
1:100.000, 1:1.000.000 và 1:10.000.000. Ngoài ra, ghi rõ một pipet, chuyển 1,0 ml vào mẫu trắng C.
trên nhãn lượng được hút vào mỗi đĩa (0,1 ml hoặc 1,0

ml). 7. Lắc mẫu trắng C 25 lần.

141
Machine Translated by Google

BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn

Hình 19.4 Các đĩa pha loãng nối tiếp của E. coli. ©
Giáo dục McGraw-Hill. Lisa Burgess, nhiếp ảnh gia

Hình 19.3 Quy trình chuẩn để lắc mẫu trắng nước.

8. Dùng một pipet vô trùng khác, chuyển từ mẫu trắng C

0,1 ml sang đĩa tỷ lệ 1:10.000.000 và 1,0 ml sang
đĩa tỷ lệ 1:1.000.000.
9. Sau khi lọ thạch dinh dưỡng sôi được 8 phút, để
nguội trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 50C trong ít
Hình 19.5 Số lượng khuẩn lạc được xác định trên máy đếm khuẩn lạc.
nhất 10 phút.

10. Đổ 1/4 lượng thạch dinh dưỡng (20 ml) vào mỗi đĩa © Giáo dục McGraw-Hill. Lisa Burgess, nhiếp ảnh gia

trong bốn đĩa. Xoay nhẹ các đĩa để trộn đều môi
trường và vi sinh vật. đếm cùng một thuộc địa hai lần. Sử dụng máy đếm tay

Bước này rất quan trọng! Quá ít hoạt động sẽ dẫn cơ học. Đếm mọi thuộc địa, bất kể nhỏ hay không đáng

đến sự phân tán kém và quá nhiều hoạt động có thể kể. Ghi lại số đếm trên bảng trong phần A của Báo

làm đổ môi trường đã cấy qua mép. cáo Phòng thí nghiệm 19.

11. Sau khi môi trường nguội hoàn toàn, ủ ở 35C trong Phương pháp đếm thay thế: Một cách khác để đếm là

48 giờ, đảo chiều. tháo nắp và úp ngược đĩa lên quầy đếm khuẩn lạc.
Thay vì sử dụng lưới để theo dõi, hãy sử dụng bút
dạ để đánh dấu từng thuộc địa khi bạn đếm.
Đếm và tính toán
3. Tính số lượng vi khuẩn trên mỗi ml dịch cấy chưa
Nguyên vật liệu pha loãng bằng cách sử dụng dữ liệu được ghi trong
phần A của Báo cáo Phòng thí nghiệm 19. Nhân số
• 4 đĩa cấy • máy đếm
lượng khuẩn lạc đếm được với hệ số pha loãng (số
khuẩn lạc • máy đếm
đối của độ pha loãng).
cầm tay cơ học • bút dạ (tùy chọn)
Ví dụ: Nếu bạn đếm được 220 khuẩn lạc trên đĩa nhận
được 1,0 ml dung dịch pha loãng 1:1.000.000: 220

1. Bày các đĩa lên bàn theo thứ tự pha loãng và so 1.000.000 (hoặc 2,2 108 ) vi khuẩn trên mỗi ml.
sánh. Chọn các đĩa có không ít hơn 30 hoặc nhiều hơn Nếu đếm được 220 khuẩn lạc trên đĩa nhận 0,1 ml
300 khuẩn lạc để đếm. Các đĩa có ít hơn 30 hoặc dung dịch pha loãng 1:1.000.000, thì các kết quả

nhiều hơn 300 khuẩn lạc là không đáng tin cậy về mặt trên sẽ được nhân với 10 để chuyển đổi từ số lượng
thống kê (hình 19.4). vi khuẩn trên 0,1 ml thành số lượng vi khuẩn trên
1,0 ml ([Link] hoặc 2,2 109 ).
2. Đặt đĩa lên máy đếm khuẩn lạc với nắp đã được tháo Chỉ sử dụng hai con số quan trọng. Nếu số lượng
ra. Xem hình 19.5. Bắt đầu đếm từ trên cùng của đĩa, vi khuẩn trên mỗi ml được tính là 227.000.000, thì
sử dụng các đường kẻ ô vuông để ngăn nó phải được ghi là 230.000.000 hoặc 2,3 108 .

142
Machine Translated by Google

Đếm vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn BÀI TẬP 19

Đèn

DỮ LIỆU CHIỀU DÀI SÓNG

khe vào
TRUYỀN TẢI

ĐỘ HẤP THỤ

SỰ TẬP TRUNG

NHÂN TỐ
Lối ra

Lọc rạch

nhiễu xạ

ghê tai

Điều khiển ánh sáng

ống ảnh Vật mẫu

Hình 19.6 Sơ đồ máy quang phổ.

các phép đo độ đục, nền văn hóa hoạt động giống như một
Xác định Tăng trưởng theo
huyền phù keo. Khi ánh sáng ở bước sóng xác định đi qua
Độ hấp thụ (Mật độ quang học) môi trường nuôi cấy, nó sẽ được các tế bào vi khuẩn hấp
Khi số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy tăng theo thụ và ánh sáng phát ra từ môi trường nuôi cấy sẽ giảm đi
thời gian, độ đục của môi trường nuôi cấy cũng sẽ tăng lên. một cách tương ứng theo số lượng tế bào hiện có. Điều này
Độ đục của môi trường nuôi cấy vi khuẩn có thể được đo được đưa ra bởi phương trình sau:
bằng dụng cụ gọi là máy đo quang phổ. TRONG

%T (l/l0 ) 100 trong đó: %T là phần trăm ánh sáng truyền qua

l0 là cường độ sáng chiếu vào mẫu l là cường độ

sáng sau khi đi qua mẫu

Máy đo quang phổ xác định %T và cũng xác định độ hấp thụ bước sóng của ánh sáng đơn sắc có thể được chọn từ cách
hoặc mật độ quang (OD) của huyền phù tế bào. Độ hấp thụ (A) tử nhiễu xạ bằng một khe thoát. Điều chỉnh điều khiển bước
hoặc OD là hàm logarit của T và được biểu thị như sau: sóng trên thiết bị sẽ định hướng lại cách tử nhiễu xạ để
có thể chọn một bước sóng khác bằng khe thoát. Sau đó, ánh
sáng đơn sắc đi qua một mẫu và kích hoạt một ống nhân

Nhật ký (1/T) nhật ký (l0 /l) quang, ống này đo các giá trị phần trăm truyền qua (%T) và
độ hấp thụ (A). Điều này được cung cấp dưới dạng đầu đọc
Lưu ý: a. ở độ truyền 100%; Một 0 b. độ
kỹ thuật số tùy thuộc vào tham số nào được chọn. (Lưu ý:
hấp thụ không có đơn vị
Trên các thiết bị analog, %T và A có thể được đọc đồng
c. đơn vị hiệu chuẩn cao nhất của A trên thời trên máy đo.)
một thiết bị là 2.0

Độ hấp thụ càng cao thì nồng độ tế bào vi khuẩn càng lớn.
Do đó, trong một số giới hạn xác định, lượng ánh sáng được
hấp thụ tỷ lệ thuận với số lượng tế bào hiện diện. Các phép xác định độ hấp thụ không đưa ra số lượng
vi khuẩn cụ thể như số lượng thu được với số lượng đĩa

Hình 19.6 minh họa đường đi của ánh sáng qua máy quang tiêu chuẩn. Tuy nhiên, số lượng tấm tiêu chuẩn và xác định
phổ. Một chùm ánh sáng trắng đi qua một loạt thấu kính và độ hấp thụ đối với vi khuẩn phát triển trong các điều kiện

một khe rồi chiếu vào một cách tử nhiễu xạ, ở đó ánh sáng xác định và trên một môi trường cụ thể có thể được vẽ
bị phân tách thành các bước sóng khác nhau của quang phổ biểu đồ để tạo ra một đường cong tiêu chuẩn có thể được
khả kiến. một cụ thể sử dụng để xác định

143
Machine Translated by Google

BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn

0,4

0,3

QUANG
HỌC
MẬT
ĐỘ

0,2

0,1

0
7,5 106 1,5 107 3 107
CFU/ml

Hình 19.7 Biểu đồ mật độ quang nuôi cấy và CFU/ml tương ứng.

số lượng tế bào trong huyền phù bằng cách chỉ đo độ trồng trong những điều kiện khác nhau. Ngoài ra, độ dài
hấp thụ của môi trường nuôi cấy. Điều này đạt được sóng được sử dụng để xác định độ hấp thụ sẽ khác nhau
bằng cách xác định sự gia tăng số lượng tế bào vi khuẩn đối với từng loại vi khuẩn.
trong môi trường nuôi cấy theo thời gian bằng cách sử Trong bài tập sau, bạn sẽ chứng minh mối quan hệ
dụng phương pháp đếm đĩa tiêu chuẩn và cũng xác định giữa độ hấp thụ và độ đục của tế bào bằng cách đo các
các giá trị độ hấp thụ cho từng mẫu được mạ. giá trị độ hấp thụ đối với các độ pha loãng khác nhau
Các giá trị độ hấp thụ sau đó được biểu thị so với số của dịch nuôi cấy. Cần có một mối quan hệ tỷ lệ thuận

lượng tấm (CFU/ml) để tạo ra một đường cong chuẩn. giữa nồng độ tế bào vi khuẩn và độ hấp thụ hoặc mật độ
Đối với vi khuẩn phát triển trong cùng điều kiện xác quang của môi trường nuôi cấy. Để chứng minh mối quan
định, các giá trị độ hấp thụ mới được xác định và sử hệ này, bạn sẽ đo các giá trị độ hấp thụ của các độ pha
dụng để xác định số lượng tế bào tương ứng trong mẫu loãng khác nhau được cung cấp cho bạn. Các giá trị này
từ đường chuẩn (hình 19.7). Ví dụ, trong hình 19.7, độ sẽ được vẽ trên biểu đồ dưới dạng hàm của độ pha loãng
hấp thụ 0,3 tương đương với 3 107 CFU/ml. Điều quan dịch cấy. Đối với các giá trị độ hấp thụ thấp hơn, có
trọng là phải hiểu rằng phương pháp này chỉ hợp lệ khi thể có mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ tế bào và độ
môi trường và điều kiện tăng trưởng được xác định cho hấp thụ. Tuy nhiên, ở các giá trị cao hơn, mối quan hệ
một sinh vật cụ thể. Người ta không thể sử dụng công cụ có thể không tuyến tính. Nghĩa là, để tăng gấp đôi nồng
tạo số cho môi trường nuôi cấy Escherichia coli để xác độ tế bào, có thể có ít hơn gấp đôi độ hấp thụ.
định số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy

Staphylococcus aureus

144
Machine Translated by Google

Đếm vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn BÀI TẬP 19

(Một) Bật thiết bị bằng công tắc bật/tắt (núm phía trước bên trái). (b) Đặt chế độ thành Absorbance. Đặt cuvette chứa canh trường

Để máy quang phổ nóng lên trong 15 phút. Đặt bước sóng thành 550 dinh dưỡng vô trùng vào ngăn chứa mẫu và đóng nắp lại.
nm và định vị bộ lọc tương ứng với bước sóng này. Chọn chế độ Điều chỉnh Absorbance về 0 (không) bằng núm phía trước bên
Transmittance và đảm bảo rằng nắp giá đỡ cuvette được đóng lại. phải. Điều này có thể yêu cầu vài lần xoay núm.
Điều chỉnh đầu đọc kỹ thuật số về độ truyền qua 0% bằng cách sử dụng
núm (bật/tắt) phía trước bên trái.

(c) Lấy mẫu trắng ra và cho một cuvet chứa một trong các vi khuẩn (d) Thỉnh thoảng làm trống thiết bị về 0 bằng máy vô trùng.

mẫu tế bào. Đóng nắp và đọc độ hấp thụ/OD nước dùng dinh dưỡng trong quá trình đọc các mẫu tế bào.

Hình 19.8 Quy trình hiệu chuẩn cho máy quang phổ kỹ thuật số B & L Spectronic 200. © Giáo dục McGraw-Hill. Dịch
vụ chụp ảnh Đại học Auburn

Nguyên vật liệu môi trường chứa các thành phần khiến nó có màu nhẹ
và do đó, nó sẽ hấp thụ một số ánh sáng, làm tăng
• môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli (cùng loại được
khả năng hấp thụ ánh sáng của các ống nuôi cấy vi
sử dụng để đếm đĩa) • cuvette máy đo quang phổ (2
khuẩn. Làm trống thiết bị bằng môi trường chưa
cái cho mỗi học sinh) • 4 ống nghiệm nhỏ và giá đỡ ống
nghiệm • pipet 5 ml • chai canh thang dinh dưỡng vô cấy sẽ trừ đi độ hấp thụ do môi trường tạo ra. Khi
cầm cuvet, hãy ghi nhớ những điều sau:
trùng (20 ml cho mỗi học sinh)

1. Hiệu chuẩn máy đo quang phổ theo quy trình được Một. Rửa cuvet bằng nước cất hoặc nước khử ion để
mô tả trong hình 19.8. Những hướng dẫn này áp làm sạch cuvet trước khi sử dụng. b. Giữ cho
dụng cụ thể cho máy quang phổ kỹ thuật số Bausch phần dưới của cuvet không có chất lỏng, vết bẩn
và Lomb Spectronic 200. Điều quan trọng là làm và dấu vân tay bằng cách chỉ lau cẩn thận bề mặt
trống máy đo quang phổ bằng cách điều chỉnh thiết bằng khăn lau Kim hoặc khăn giấy không có xơ
bị về độ hấp thụ bằng 0 (không) bằng canh thang được cung cấp. Không sử dụng khăn giấy hoặc
dinh dưỡng chưa được cấy. Các khăn tay cho mục đích này. Nếu vết bẩn,

145
Machine Translated by Google

BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn

đ. Xử lý cuvet cẩn thận vì chúng có chất lượng

quang học và đắt tiền.

2. Dán nhãn cuvet 1:1 (gần đầu ống) và bốn ống

nghiệm 1:2, 1:4, 1:8 và 1:16. Các ống này sẽ
được sử dụng cho các pha loãng nối tiếp được
nuôi cấy vi khuẩn minh họa trong hình 19.9.
3. Dùng pipet 5 ml, phân phối 4 ml canh trường dinh
dưỡng vô trùng vào các ống 1:2, 1:4, 1:8 và 1:16.
4. Lắc mạnh dịch cấy E. coli để sinh vật lơ lửng
4ml 4ml
4ml 4ml 4ml và cũng với pipet 5 ml đó, chuyển 4 ml vào
cuvet 1:1 và 4 ml vào ống nghiệm 1:2.

5. Trộn các thành phần trong ống 1:2 bằng cách

hút hỗn hợp vào pipet và xả vào ống ba lần.

6. Chuyển 4 ml từ ống 1:2 sang ống 1:4, trộn ba lần

và chuyển sang các ống khác theo cách tương tự.
1:1 1:2 1:4 1:8 1:16
Ống 1:16 sẽ có 8ml sinh vật pha loãng.
(không pha
loãng) 4 ml canh trường dinh dưỡng vô trùng trong mỗi ống này
7. Đo mật độ quang học của từng ống trong số năm
ống, bắt đầu với ống 1:16 trước. Nội dung của
mỗi ống nghiệm phải được chuyển vào cuvet để
Hình 19.9 Quy trình pha loãng cho cuvet.
đo. Đảm bảo đóng nắp trên giá đỡ mẫu khi thực
hiện các phép đo. Một cuvette duy nhất có thể
chất lỏng, hoặc dấu vân tay xuất hiện trên bề được sử dụng cho tất cả các
mặt cuvet, chúng có thể góp phần vào sự hấp đo.
thụ ánh sáng và đọc sai. c. Đặt cuvet vào ngăn 8. Ghi các giá trị OD vào bảng PTN 19.
chứa mẫu sao cho vạch chỉ số thẳng hàng với vạch
chỉ thị trên ngăn chứa cuvet. Đặt cuvet đúng 9. Vẽ các giá trị OD trên đồ thị của Báo cáo Phòng
vị trí bằng cách căn chỉnh chính xác các vạch thí nghiệm 19.
trên cuvet và giá đỡ.

146