Machine Translated by Google

19
BÀI TẬP

VI TRÙNG HỌC
Đếm vi khuẩn:
Số đĩa tiêu chuẩn

các ống nghiệm chứa lactose được cấy vào các mẫu nước và mẫu ống
Kết quả học tập thể hiện axit và khí được so sánh với các bảng thống kê đưa ra

Sau khi hoàn thành bài tập này, bạn sẽ có thể
1. Giải thích các phương pháp khác nhau được sử dụng để
đếm vi khuẩn.
số lượng có thể có của dạng coli hiện diện. Bạn sẽ sử dụng quy
trình này trong Bài tập 59 để kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn
coliform trong nước. Phương pháp MPN được giới hạn trong việc
thử nghiệm khi các bảng thống kê đã được thiết lập cho một thông

2. Thực hiện đếm đĩa tiêu chuẩn để xác định số lượng số tăng trưởng cụ thể.
vi khuẩn trong một mẫu.
Đếm đĩa tiêu chuẩn (SPC) Đĩa tiêu chuẩn, hay số đếm khả thi, là
3. Sử dụng máy đo quang phổ để đo độ tăng của độ đục
một trong những phương pháp phổ biến nhất để xác định số lượng
nuôi cấy bằng cách xác định mật độ quang học.
vi khuẩn trong một mẫu. Một mẫu được pha loãng trong một loạt các
4. Tương quan giữa việc xác định độ đục với số lượng đĩa
dung dịch trắng pha loãng, như minh họa trong hình 19.1. Sau đó,
tiêu chuẩn của môi trường nuôi cấy vi khuẩn.
các phần của dung dịch pha loãng được đặt lên môi trường và số
lượng khuẩn lạc được đếm sau khi ủ từ 24 đến 48 giờ. Người ta

cho rằng các tế bào vi khuẩn được pha loãng đến điểm cuối nơi một

tế bào đơn lẻ phân chia, tạo ra một khuẩn lạc có thể nhìn thấy
Việc xác định số lượng vi khuẩn trong một mẫu thường rất cần
được trên đĩa.
thiết. Ví dụ, việc phân loại sữa dựa trên số lượng vi khuẩn có
Số lượng vi khuẩn trong mẫu ban đầu được xác định bằng cách
mặt. Việc bệnh nhân có bị nhiễm trùng bàng quang hay không phụ
nhân số khuẩn lạc với hệ số pha loãng. Tuy nhiên, giả định rằng
thuộc vào mức ngưỡng nhất định của vi khuẩn có trong mẫu nước
một khuẩn lạc đại diện cho một tế bào không phải lúc nào cũng đúng
tiểu. Đôi khi điều quan trọng là phải biết có bao nhiêu vi khuẩn
vì các tế bào trong một chuỗi, chẳng hạn như Streptococcus, cũng
có trong thực phẩm hoặc nước để đảm bảo an toàn. Một số phương
sẽ tạo ra một khuẩn lạc trên đĩa. Do không chắc chắn về số lượng
pháp khác nhau có thể được sử dụng để xác định số lượng tế bào
tế bào thực tế hình thành một khuẩn lạc nên số lượng tế bào được
vi khuẩn và mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm
SPC đếm được báo cáo là đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).
riêng. Việc sử dụng phương pháp này hay phương pháp khác sẽ tùy

thuộc vào mục đích của nghiên cứu. Sau đây là một số phương pháp
Chỉ những con số từ 30 đến 300 CFU mới được coi là có giá trị
trực tiếp để xác định số lượng vi khuẩn:
thống kê. Nếu CFU lớn hơn 300 thì có khả năng xảy ra tình trạng

quá tải trên

Đếm qua kính hiển vi Một mẫu có thể được pha loãng và các tế bào

trong mẫu có thể được đếm với sự trợ giúp của kính hiển vi. Các

phiến kính đặc biệt, chẳng hạn như buồng Petroff-Hauser, tạo điều

kiện thuận lợi cho việc đếm vì phiến kính có dạng lưới và lượng

mẫu được đưa vào lưới được biết trước. Các mẫu sữa có thể được 1ml 1ml 1ml
đếm bằng phương pháp hiển vi với độ tin cậy và độ tin cậy cao. Một b c

99 ml 99 ml 99 ml
Văn hoá 1:100 1:10.000 1:1.000.000
Số có thể xảy ra nhất (MPN) Số lượng vi khuẩn trong một mẫu có

thể được xác định bằng mối quan hệ của một số thông số tăng

trưởng với xác suất thống kê. Sự an toàn của nước uống phụ thuộc 0,1ml 0,1ml

vào việc nước uống không bị ô nhiễm do nước thải và điều này
1:100.000 1:10.000.000
được kiểm tra bằng phương pháp MPN. Vi khuẩn chỉ thị được gọi

là coliforms, được tìm thấy trong ruột của con người và động vật 1,0ml 1,0ml
máu nóng, lên men đường lactose để tạo ra axit và khí. Sự hiện
1:10.000 1:1.000.000
diện của những vi khuẩn này trong mẫu nước cho thấy khả năng gây

bệnh. Một loạt các

Hình 19.1 Quy trình mạ định lượng.

139
Machine Translated by Google
BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn
tấm có thể đã ức chế một số tế bào phát triển.
Ít hơn 30 CFU có thể liên quan đến lỗi lấy mẫu và đánh giá thấp
các con số. Phương pháp SPC chỉ xác định các tế bào sống sót,
trong khi số lượng vi mô xác định cả tế bào sống và tế bào chết.
Ngoài ra, phương pháp SPC bị sai lệch vì các điều kiện và môi
trường cụ thể được sử dụng và các yếu tố này có thể loại trừ một
số vi khuẩn nhất định trong số lượng. Ví dụ, SPC sẽ đánh giá thấp
nghiêm trọng số lượng vi khuẩn trong mẫu đất vì các điều kiện và
môi trường được sử dụng để đếm có thể tạo điều kiện thuận lợi
cho các vi khuẩn dị dưỡng phát triển trong điều kiện hiếu khí ở
giá trị pH trung tính. Những điều kiện này không cho phép sự phát
triển của vi khuẩn kỵ khí, sinh vật hóa dưỡng hoặc vi khuẩn có
thể phát triển ở độ pH cực cao.
Các phương pháp gián tiếp Đôi khi người ta chỉ muốn biết liệu tế
bào có đang phát triển hay không và do đó có tăng số lượng hay
không. Sự tăng trưởng có thể liên quan đến một số thông số tăng
lên khi tế bào phân chia. Các tế bào đang phát triển làm tăng hàm
lượng protein, axit nucleic và khối lượng vì tế bào đang phân
chia. Do đó, các phép đo protein, DNA và trọng lượng khô có thể
được sử dụng để theo dõi sự tăng trưởng. Tương tự như vậy, môi
trường nuôi cấy sẽ trở nên đục hơn khi tế bào phân chia và độ đục
của môi trường nuôi cấy có thể được xác định và liên quan đến sự
phát triển. Độ đục của tế bào có thể được đo bằng máy quang phổ,
đo độ hấp thụ hoặc mật độ quang của môi trường nuôi cấy. Thông
thường, một đường cong tiêu chuẩn được xây dựng liên quan đến
mật độ quang học với số lượng vi khuẩn thực tế được xác định
bởi SPC. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng cả tế bào sống và tế bào chết
đều góp phần tạo nên độ đục của môi trường nuôi cấy, đây cũng là
một nhược điểm của phương pháp này.
Trong bài tập sau đây, bạn sẽ sử dụng SPC để xác định số lượng
vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Bạn cũng sẽ đo độ đục của môi
trường nuôi cấy và vẽ đồ thị giá trị mật độ quang của các mẫu đã
pha loãng.
Phương pháp mạ định lượng
(Đếm đĩa tiêu chuẩn)
Để xác định số lượng sinh vật có trong nước, sữa và thực phẩm,
số lượng đĩa tiêu chuẩn
(SPC) được sử dụng rộng rãi. Nó tương đối dễ thực hiện và mang
lại kết quả tuyệt vời. Chúng ta cũng có thể sử dụng kỹ thuật cơ
bản này để tính toán số lượng sinh vật trong môi trường nuôi cấy
vi khuẩn. Đó là về mặt này mà nhiệm vụ này được thiết lập.
Quy trình này bao gồm việc pha loãng các sinh vật bằng một
loạt mẫu nước vô trùng, như minh họa trong hình 19.1. Nói chung,
chỉ cần ba chai, nhưng có thể sử dụng nhiều hơn nếu cần thiết.
Bằng cách sử dụng quy trình pha loãng được chỉ ra ở đây, độ pha
loãng cuối cùng là 1:1.000.000 xảy ra trong mẫu trắng C. Từ mẫu
trắng B và C, số lượng đo được của sinh vật đã pha loãng được
chuyển vào các đĩa petri trống. Thạch dinh dưỡng,
140
làm nguội đến 50C, sau đó đổ vào từng đĩa. Sau khi thạch dinh
dưỡng đông đặc, các đĩa được ủ trong 24 đến 48 giờ và kiểm tra.
Một đĩa có từ 30 đến 300 khuẩn lạc được chọn để đếm. Từ việc đếm,
việc tính toán số lượng vi sinh vật trên mililit môi trường nuôi
cấy ban đầu là một vấn đề đơn giản. Cần chỉ ra rằng có thể đạt
được độ chính xác cao hơn bằng cách đổ hai đĩa cho mỗi độ pha
loãng và lấy số đếm trung bình. Người hướng dẫn của bạn sẽ cho
biết có nên thực hiện việc mạ trùng lặp hay không.
Xử lý pipet
Thành công trong thí nghiệm này phụ thuộc đáng kể vào kỹ thuật sử
dụng pipet thích hợp. Pipet có thể được cung cấp cho bạn ở dạng hộp
kim loại hoặc trong phong bì riêng lẻ; chúng có thể dùng một lần
hoặc tái sử dụng. Do những mối nguy hiểm tiềm ẩn, không được phép
sử dụng pipet bằng miệng và do đó tất cả việc thao tác bằng pipet
đều được thực hiện bằng cách sử dụng dụng cụ hỗ trợ pipet. Người
hướng dẫn của bạn sẽ chỉ ra các kỹ thuật sẽ áp dụng trong phòng thí nghiệm này.
Nếu đây là lần đầu tiên bạn sử dụng pipet vô trùng, hãy tham khảo
hình 19.2, lưu ý những điểm sau:
• Khi lấy pipet vô trùng ra khỏi hộp, hãy làm như vậy mà không
làm nhiễm bẩn các đầu của pipet khác bằng ngón tay của bạn.
Điều này có thể được thực hiện bằng cách di chuyển nhẹ hộp
từ bên này sang bên kia để cố gắng tách một pipet khỏi phần
còn lại.
• Sau khi tháo pipet ra, đậy nắp hộp đựng để duy trì tính vô
trùng của các pipet còn lại.
• Không dùng ngón tay chạm vào thân pipet hoặc đặt pipet xuống
bàn trước hoặc sau khi sử dụng. Giữ pipet đó vô trùng cho
đến khi bạn sử dụng xong và không làm ô nhiễm bàn hoặc bản
thân sau khi sử dụng.
• Luôn sử dụng thiết bị pipet cơ học như thiết bị trong hình
minh họa 3, hình 19.2.
• Mỗi lần chỉ tháo và sử dụng một pipet; nếu bạn cần ba pipet
cho toàn bộ thí nghiệm và loại bỏ cả ba pipet cùng một lúc,
không có cách nào bạn có thể giữ vô trùng hai trong số chúng
trong khi bạn đang sử dụng pipet đầu tiên.
• Khi dùng xong pipet, đặt nó vào hộp đựng thẻ loại bỏ. Hộp
đựng rác thải sẽ có chất khử trùng bên trong. Khi kết thúc
thời gian sử dụng, các pipet có thể tái sử dụng sẽ được
trợ lý phòng thí nghiệm rửa sạch và khử trùng. Pipet dùng
một lần sẽ bị loại bỏ. Học sinh được biết là đã lơ đãng trả
lại các pipet đã sử dụng vào hộp đựng vô trùng ban đầu và
đôi khi thậm chí ném chúng vào thùng rác. Chúng tôi chắc
chắn rằng không ai trong phòng thí nghiệm này có thể làm
điều đó!
Quy trình pha loãng và mạ
Tiến hành như sau để pha loãng môi trường nuôi cấy E. coli và đổ
vào bốn đĩa, như minh họa trong hình 19.1.
Machine Translated by Google

Đếm vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn BÀI TẬP 19

ĐỪNG!

(1) Pipet tái sử dụng có thể được đựng trong phong bì dùng một lần hoặc (2) Không bao giờ chạm vào đầu hoặc thân pipet bằng ngón tay của bạn.
hộp kim loại. Khi sử dụng pipet từ hộp đựng, hãy nhớ đậy nắp Làm ô nhiễm pipet sẽ làm ô nhiễm công việc của bạn.
chúng sau khi lấy pipet ra.

(3) Sử dụng dụng cụ hỗ trợ pipet cho tất cả thao tác pipet trong phần này. (4) Sau khi sử dụng pipet, đặt pipet vào hộp đựng rác.
phòng thí nghiệm. Hút bằng miệng quá nguy hiểm. Ngay cả những pipet “dùng một lần” cũng phải được đặt ở đây.

Hình 19.2 Kỹ thuật xử lý pipet.

2. Lắc môi trường nuôi cấy E. coli và chuyển 1 ml vi sinh vật

Nguyên vật liệu
vào mẫu trắng A, sử dụng pipet 1,1 ml vô trùng. Sau khi sử

mỗi 4 học sinh: • dụng pipet, đặt nó vào hộp đựng loại bỏ.

1 chai (40 ml) nước nuôi cấy vi khuẩn E. coli

3. Lắc trống A 25 lần theo hình vòng cung 1 foot trong 7 giây
mỗi học sinh:

• 1 chai (80 ml) thạch dinh dưỡng • 4 với khuỷu tay đặt trên bàn, như minh họa trong hình 19.3.

đĩa petri • Pipet Lắc mạnh không chỉ giúp phân bố tốt mà còn phá vỡ các khối

1,1 ml • 3 bình chứa vi khuẩn.

nước 99 ml vô trùng • hộp đựng pipet

bỏ đi 4. Dùng pipet 1,1 ml khác chuyển 1 ml từ mẫu trắng A sang mẫu

trắng B.

1. Làm lỏng một chai thạch dinh dưỡng. Trong khi đun nóng, dán 5. Lắc mẫu trắng B 25 lần theo cách tương tự.

nhãn ba cốc nước vô trùng 99 ml A, B,
và C. Ngoài ra, dán nhãn cho bốn đĩa petri 1:10.000,
1:100.000, 1:1.000.000 và 1:10.000.000. Ngoài ra, ghi rõ
trên nhãn lượng cần pipet vào mỗi đĩa (0,1 ml hoặc 1,0 ml).
6. Dùng pipet vô trùng khác chuyển 0,1 ml từ mẫu trắng B sang
đĩa 1:100.000 và 1,0 ml sang đĩa 1:10.000. Dùng cùng pipet
đó chuyển 1,0 ml vào mẫu trắng C.
7. Lắc trống C 25 lần.

141
Machine Translated by Google
BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn
Hình 19.3 Quy trình chuẩn để lắc mẫu trắng bằng nước.
8. Dùng pipet vô trùng khác chuyển từ mẫu trắng C 0,1 ml sang
đĩa 1:10.000.000 và 1,0 ml sang đĩa 1:1.000.000.
9. Sau khi chai thạch dinh dưỡng sôi được 8 phút, để nguội
trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 50C trong ít nhất 10 phút.
10. Đổ một phần tư thạch dinh dưỡng (20 ml) vào mỗi bốn đĩa.
Xoay các đĩa nhẹ nhàng để có được sự trộn đều giữa môi
trường và vi sinh vật.
Bước này rất quan trọng! Tác động quá ít sẽ dẫn đến độ phân
tán kém và tác động quá nhiều có thể làm môi trường cấy
tràn ra mép.
11. Sau khi môi trường nguội hoàn toàn, ủ ở 35C trong 48 giờ,
đảo ngược.
Đếm và tính toán
Nguyên vật liệu
• 4 đĩa nuôi cấy • máy đếm
khuẩn lạc • máy đếm tay cơ
khí • bút nỉ (tùy chọn)
1. Xếp các đĩa lên bàn theo thứ tự pha loãng và so sánh. Chọn
các đĩa có không ít hơn 30 hoặc nhiều hơn 300 khuẩn lạc để
đếm. Các đĩa có ít hơn 30 hoặc hơn 300 khuẩn lạc là không
đáng tin cậy về mặt thống kê (hình 19.4).
2. Đặt đĩa lên quầy đếm khuẩn lạc và đã tháo nắp. Xem hình
19.5. Bắt đầu đếm từ phía trên đĩa, sử dụng các đường lưới
để tránh
142
Hình 19.4 Các đĩa pha loãng của E. coli. © Giáo dục McGraw-Hill. Lisa
Burgess, nhiếp ảnh gia
Hình 19.5 Số lượng khuẩn lạc được xác định trên máy đếm khuẩn lạc.
© Giáo dục McGraw-Hill. Lisa Burgess, nhiếp ảnh gia
đếm cùng một thuộc địa hai lần. Sử dụng máy đếm tay cơ học.
Đếm từng khuẩn lạc, bất kể nhỏ hay không đáng kể. Ghi lại
số đếm vào bảng trong phần A của Báo cáo Phòng thí nghiệm
19.
Phương pháp đếm thay thế: Một cách khác để đếm là tháo nắp
và đặt đĩa lộn ngược trên quầy đếm khuẩn lạc. Thay vì sử
dụng lưới để theo dõi, hãy sử dụng bút dạ để đánh dấu từng
khuẩn lạc khi đếm.
3. Tính số lượng vi khuẩn trên mỗi ml môi trường nuôi cấy
không pha loãng bằng cách sử dụng dữ liệu ghi trong phần A
của Báo cáo Phòng thí nghiệm 19. Nhân số lượng khuẩn lạc
đếm được với hệ số pha loãng (hệ số nghịch đảo của độ pha
loãng).
Ví dụ: Nếu bạn đếm 220 khuẩn lạc trên đĩa nhận được 1,0 ml
độ pha loãng 1:1.000.000: 220 1.000.000 (hoặc 2,2 108 ) vi
khuẩn trên mỗi ml. Nếu đếm 220 khuẩn lạc trên đĩa nhận
0,1 ml dung dịch pha loãng 1:1.000.000 thì kết quả trên sẽ
được nhân với 10 để chuyển từ số lượng vi khuẩn trên 0,1
ml sang số lượng vi khuẩn trên 1,0 ml (2.200.000.000, hoặc
2,2 109 ).
Chỉ sử dụng hai chữ số có nghĩa. Nếu số lượng vi khuẩn
trên mỗi ml được tính là 227.000.000 thì phải ghi là
230.000.000, hay 2,3 108 .
Machine Translated by Google

Đếm vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn BÀI TẬP 19

Đèn

DỮ LIỆU ĐỘ DÀI SÓNG

TRUYỀN
Khe vào
HẤP DẪN

SỰ TẬP TRUNG

Lối ra
NHÂN TỐ

Lọc rạch

Nhiễu xạ

ghê tai

Điều khiển ánh sáng

ống ảnh Vật mẫu

Hình 19.6 Sơ đồ của máy đo quang phổ.

đo độ đục, môi trường nuôi cấy hoạt động giống như huyền phù
Xác định sự tăng trưởng bằng
keo. Khi ánh sáng ở bước sóng xác định đi qua môi trường nuôi
Độ hấp thụ (Mật độ quang học)
cấy, nó sẽ được các tế bào vi khuẩn hấp thụ và ánh sáng phát
Khi số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy tăng lên theo ra từ môi trường nuôi cấy sẽ giảm đi tương ứng với số lượng

thời gian, độ đục của môi trường nuôi cấy cũng sẽ tăng lên. tế bào có mặt. Điều này được cho bởi phương trình sau:

Độ đục của môi trường nuôi cấy vi khuẩn có thể được đo bằng
dụng cụ gọi là máy đo quang phổ. TRONG

%T (l/l0 ) 100 trong đó: %T là phần trăm ánh sáng truyền qua

l0 là cường độ ánh sáng chiếu vào mẫu

l là cường độ ánh sáng sau khi truyền qua mẫu

Máy quang phổ xác định %T và cũng xác định độ hấp thụ hoặc mật
độ quang (OD) của huyền phù tế bào. Độ hấp thụ (A) hoặc OD là
hàm logarit của T và được biểu thị như sau:
bước sóng của ánh sáng đơn sắc có thể được chọn từ cách tử
nhiễu xạ bằng khe thoát. Việc điều chỉnh điều khiển bước sóng
trên thiết bị sẽ định hướng lại cách tử nhiễu xạ sao cho khe
thoát có thể chọn bước sóng khác. Ánh sáng đơn sắc sau đó đi
qua mẫu và kích hoạt ống nhân quang, ống này đo giá trị phần

Nhật ký (1/T) nhật ký (l0 /l) trăm truyền qua (%T) và độ hấp thụ (A). Điều này được cung
cấp dưới dạng đọc kỹ thuật số tùy thuộc vào tham số nào được
Lưu ý: a. ở độ truyền qua 100%; A 0
chọn. (Lưu ý: Trên các thiết bị analog, %T và A có thể được
b. độ hấp thụ không có đơn vị
đọc đồng thời trên đồng hồ.)
c. đơn vị hiệu chuẩn cao nhất của A trên thiết
bị là 2,0

Độ hấp thụ càng cao thì nồng độ tế bào vi khuẩn càng lớn.
Do đó, trong giới hạn xác định nhất định, lượng ánh sáng được

hấp thụ tỷ lệ thuận với số lượng tế bào có mặt. Việc xác định độ hấp thụ không cho số lượng vi khuẩn cụ thể
như số lượng vi khuẩn thu được khi đếm đĩa tiêu chuẩn. Tuy

Hình 19.6 minh họa đường đi của ánh sáng qua máy đo quang nhiên, việc đếm đĩa tiêu chuẩn và xác định độ hấp thụ đối với vi

phổ. Một chùm ánh sáng trắng đi qua một loạt thấu kính và một khuẩn phát triển trong các điều kiện xác định và trên môi trường

khe rồi đi vào một cách tử nhiễu xạ, ở đó ánh sáng được tách cụ thể có thể được vẽ biểu đồ để tạo ra đường cong chuẩn có thể

thành các bước sóng khác nhau của quang phổ nhìn thấy được. được sử dụng để xác định

Một cụ thể

143
Machine Translated by Google

BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn

0,4

0,3

0,2
QUANG
HỌC
MẬT
ĐỘ

0,1

0
7,5 106 1,5 107 3 107
CFU/ml

Hình 19.7 Đồ thị mật độ quang nuôi cấy và CFU/ml tương ứng.

số lượng tế bào trong huyền phù chỉ bằng cách đo độ hấp thụ của trồng ở những điều kiện khác nhau. Ngoài ra, độ dài sóng được sử

môi trường nuôi cấy. Điều này đạt được bằng cách xác định sự gia dụng để xác định độ hấp thụ sẽ khác nhau đối với từng loại vi

tăng số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy theo khuẩn.

thời gian bằng phương pháp đếm đĩa tiêu chuẩn và cũng xác định Trong bài tập sau đây, bạn sẽ chứng minh mối quan hệ giữa

giá trị độ hấp thụ cho từng mẫu được cấy vào đĩa. độ hấp thụ và độ đục của tế bào bằng cách đo các giá trị độ hấp

thụ đối với các độ pha loãng khác nhau của môi trường nuôi cấy.

Sau đó, các giá trị độ hấp thụ được lập biểu đồ so với số lượng Cần có mối quan hệ tỷ lệ giữa nồng độ tế bào vi khuẩn và độ hấp

đĩa (CFU/ml) để tạo ra đường cong chuẩn. thụ hoặc mật độ quang của môi trường nuôi cấy. Để chứng minh mối

Đối với vi khuẩn phát triển trong cùng điều kiện xác định, các quan hệ này, bạn sẽ đo các giá trị độ hấp thụ của các độ pha loãng
giá trị độ hấp thụ mới được xác định và sử dụng để xác định số khác nhau được cung cấp cho bạn. Các giá trị này sẽ được vẽ

lượng tế bào tương ứng trong mẫu từ đường chuẩn (hình 19.7). Ví trên biểu đồ như là một hàm của độ pha loãng môi trường nuôi

dụ, trong hình 19.7, độ hấp thụ 0,3 bằng 3 107 CFU/ml. Điều quan cấy. Đối với các giá trị độ hấp thụ thấp hơn có thể có mối quan

trọng là phải hiểu rằng phương pháp này chỉ có giá trị khi môi hệ tuyến tính giữa nồng độ của tế bào và độ hấp thụ. Tuy nhiên, ở

trường và điều kiện tăng trưởng được xác định cho một sinh vật các giá trị cao hơn, mối quan hệ có thể không tuyến tính. Nghĩa

cụ thể. Người ta không thể sử dụng các con số được tạo ra cho là, để tăng gấp đôi nồng độ tế bào, độ hấp thụ có thể ít hơn gấp

quá trình nuôi cấy Escherichia coli để xác định số lượng tế bào đôi.

trong quá trình nuôi cấy Staphylococcus Aureus

144
Machine Translated by Google
Đếm vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn BÀI TẬP 19
(Một) Bật nhạc cụ bằng công tắc bật/tắt (núm phía trước bên trái).
Để máy đo quang phổ ấm lên trong 15 phút. Đặt bước sóng ở 550 nm và đặt
bộ lọc tương ứng với bước sóng này. Chọn chế độ Truyền và đảm bảo nắp
giá đỡ cuvet được đóng. Điều chỉnh đầu ra kỹ thuật số về độ truyền
qua 0 % bằng cách sử dụng núm (bật/tắt) phía trước bên trái.
(c) Lấy mẫu trắng ra và đặt một cuvet chứa vi khuẩn vào.
mẫu tế bào. Đóng nắp và đọc độ hấp thụ/OD
Hình 19.8 Quy trình hiệu chuẩn máy quang phổ kỹ thuật số B & L Spectronic 200. © Giáo dục McGraw-Hill. Dịch vụ chụp ảnh
của Đại học Auburn
Nguyên vật liệu
• Canh cấy E. coli (giống như dùng để đếm đĩa) • cuvet đo
quang phổ (2
cuvet cho mỗi học sinh) • 4 ống nghiệm nhỏ và giá đựng ống
nghiệm
• Pipet 5 ml • Chai
nước dùng dinh dưỡng vô trùng (20 ml mỗi học sinh)
1. Hiệu chỉnh máy đo quang phổ theo quy trình được mô tả trong
hình 19.8. Những hướng dẫn này áp dụng riêng cho máy quang
phổ kỹ thuật số Bausch và Lomb Spectronic 200. Điều quan
trọng là làm trống máy đo quang phổ bằng cách điều chỉnh
thiết bị về độ hấp thụ bằng 0 (không) bằng cách sử dụng môi
trường dinh dưỡng không được cấy. Các
(b) Đặt chế độ thành Độ hấp thụ. Chèn một cuvet chứa
nước chứa dinh dưỡng vô trùng vào ngăn đựng mẫu và đóng nắp lại
che phủ. Điều chỉnh độ hấp thụ về 0 (không) bằng cách sử dụng
núm phía trước bên phải. Điều này có thể yêu cầu một vài lần xoay núm.
(d) Thỉnh thoảng làm trống thiết bị về 0 bằng dung dịch vô trùng.
nước canh dinh dưỡng trong quá trình đọc mẫu tế bào.
Môi trường chứa các thành phần làm cho nó hơi có màu và do
đó, nó sẽ hấp thụ một số ánh sáng, làm tăng thêm khả năng
hấp thụ ánh sáng của ống nuôi cấy vi khuẩn. Làm trống thiết
bị bằng cách sử dụng môi trường không cấy sẽ làm giảm độ hấp
thụ của môi trường. Khi sử dụng cuvet, hãy lưu ý những điều
sau:
Một. Rửa cuvet bằng nước cất hoặc nước khử ion để làm sạch
trước khi sử dụng.
b. Giữ phần dưới của cuvet không dính chất lỏng, vết bẩn
và dấu vân tay bằng cách chỉ lau cẩn thận bề mặt bằng
khăn lau Kim hoặc khăn giấy không xơ được cung cấp.
Không sử dụng khăn giấy hoặc khăn tay cho mục đích này.
Nếu bị nhòe,
145
Machine Translated by Google

BÀI TẬP 19 Định lượng vi khuẩn: Đếm đĩa tiêu chuẩn

d. Xử lý cuvet cẩn thận vì chúng có chất lượng

quang học và đắt tiền.

2. Dán nhãn cuvet 1:1 (gần đầu ống) và bốn ống nghiệm 1:2,
1:4, 1:8 và 1:16. Những ống này sẽ được sử dụng cho các
độ pha loãng nối tiếp được trình bày trong hình 19.9.
Nuôi cấy vi khuẩn

3. Dùng pipet 5 ml, phân phối 4 ml canh thang dinh

dưỡng vô trùng vào các ống 1:2, 1:4, 1:8 và 1:16.
4. Lắc mạnh môi trường nuôi cấy E. coli để tạo huyền phù sinh
4ml 4ml
4ml 4ml 4ml vật, và dùng pipet 5 ml tương tự, chuyển 4 ml vào cuvet 1:1
và 4 ml vào ống nghiệm 1:2.

5. Trộn lượng chứa trong ống 1:2 bằng cách hút hỗn hợp vào

pipet và xả vào ống ba lần.

6. Chuyển 4 ml từ ống 1:2 sang ống 1:4, trộn ba lần và chuyển sang

các ống khác theo cách tương tự. Ống 1:16 sẽ có 8 ml sinh vật pha
1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 loãng.

(không pha loãng)

4 ml nước canh dinh dưỡng vô trùng trong mỗi ống này

7. Đo mật độ quang của từng ống trong số năm ống, bắt đầu từ ống

1:16 trước. Nội dung của mỗi ống nghiệm phải được chuyển
sang cuvet để đo. Đảm bảo đóng nắp giá đỡ mẫu khi thực hiện
Hình 19.9 Quy trình pha loãng cuvet.
phép đo. Một cuvet duy nhất có thể được sử dụng cho tất cả

các
chất lỏng hoặc dấu vân tay xuất hiện trên bề mặt
cuvet, chúng có thể góp phần làm hấp thụ ánh sáng đo.

và dẫn đến kết quả đọc sai. 8. Ghi lại các giá trị OD vào bảng Báo cáo Phòng
c. Đưa cuvet vào giá đỡ mẫu sao cho vạch chỉ thí nghiệm 19.
số thẳng hàng với vạch chỉ số trên giá đỡ 9. Vẽ các giá trị OD trên biểu đồ của Báo cáo Phòng
cuvet. Đặt cuvet đúng cách bằng cách căn thí nghiệm 19.
chỉnh chính xác các đường trên cuvet và giá đỡ.

146