Regulación de La Dinámica de Contracción Del Músculo Cardíaco Basada en Filamentos de Miosina - PMC

21/9/23, 21:53 Regulación de la dinámica de contracción del músculo cardíaco basada en filamentos de miosina - PMC
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Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Apr 7; 117(14): 8177–8186. PMCID: PMC7149498
Published online 2020 Mar 27. doi: 10.1073/pnas.1920632117 PMID: 32220962
Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle

Elisabetta Brunello,a,b,1 Luca Fusi,a,b Andrea Ghisleni,a,b,2 So-Jin Park-Holohan,a,b Jesus G. Ovejero,a,b
Theyencheri Narayanan,c and Malcolm Irvinga,b
SIGNIFICANCE
Cardiovascular disease continues to be the leading cause of death worldwide, and is frequently
associated with heart failure. Efforts to develop better therapeutics for heart failure have been
held back by limited understanding of the normal control of contraction on the timescale of
the heartbeat. We used synchrotron X-ray diffraction to determine the dynamic structural
changes in the myosin motors that drive contraction in the heart muscle, and show that myosin
filament-based control mechanisms determine the time course and strength of contraction, al‐
lowing those mechanisms to be targeted for developing new therapies for heart disease.
Keywords: heart muscle, myosin motor, muscle regulation, myosin-binding protein C
ABSTRACT
Myosin-based mechanisms are increasingly recognized as supplementing their better-known

actin-based counterparts to control the strength and time course of contraction in both skele‐
tal and heart muscle. Here we use synchrotron small-angle X-ray diffraction to determine the
structural dynamics of local domains of the myosin filament during contraction of heart mus‐
cle. We show that, although myosin motors throughout the filament contribute to force devel‐
opment, only about 10% of the motors in each filament bear the peak force, and these are con‐
fined to the filament domain containing myosin binding protein-C, the “C-zone.” Myosin motors
in domains further from the filament midpoint are likely to be activated and inactivated first in
each contraction. Inactivated myosin motors are folded against the filament core, and a subset
of folded motors lie on the helical tracks described previously. These helically ordered motors
are also likely to be confined to the C-zone, and the associated motor conformation reforms
only slowly during relaxation. Myosin filament stress-sensing determines the strength andVolver
time arriba
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7149498/ 1/23
course of contraction in conjunction with actin-based regulation. These results establish the
fundamental roles of myosin filament domains and the associated motor conformations in con‐
trolling the strength and dynamics of contraction in heart muscle, enabling those structures to
be targeted to develop new therapies for heart disease.
La acció n de bombeo del corazó n es impulsada por contracciones rítmicas de sus paredes
musculares. El corazó n sano optimiza continuamente la fuerza y el tiempo de la contracció n
mediante la modulació n del transitorio de calcio que desencadena los latidos del corazó n y los
niveles de fosforilació n de mú ltiples proteínas, incluidos los componentes de los filamentos de
miosina y actina que impulsan la contracció n, y mediante retroalimentació n mecá nica directa
(1) .– 4 ). Estas vías de señ alizació n alteran la contractilidad al cambiar las estructuras de los fi‐
lamentos contrá ctiles a travé s de mecanismos efectores posteriores que aú n no se conocen
bien. Durante muchos añ os, la atenció n se centró en la regulació n basada en filamentos de ac‐
tina y su vínculo con la señ alizació n del calcio intracelular ( 1 ); má s recientemente quedó
claro, en parte por extrapolació n de estudios sobre el mú sculo esquelé tico ( 5– 9 ), que la re‐
gulació n basada en filamentos de miosina tambié n juega un papel importante. Ademá s, la regu‐
lació n basada en la miosina se altera en las enfermedades cardíacas ( 10 , 11 ) y ha sido un ob‐
jetivo cada vez mayor para el desarrollo de nuevas terapias para tratar la insuficiencia car‐
díaca ( 12 ). Sin embargo, tales esfuerzos se han visto obstaculizados por el conocimiento limi‐
tado sobre la acció n de la regulació n basada en la miosina en la escala de tiempo del latido del
corazó n: es decir, sobre mecanismos que operan mucho má s rá pido que la señ alizació n de la
quinasa (3 , 4 ) . Dos principales mecanismos candidatos de este tipo surgieron de los estudios
del mú sculo esquelé tico: la mecanodetecció n directa por los filamentos de miosina ( 6 , 7).) y
señ alizació n entre filamentos mediante la proteína C de unió n a miosina ( 6 , 13 ). Aunque va‐
rios estudios han sugerido que estos mecanismos tambié n está n presentes en el corazó n ( 2 ,
14– 17 ), hasta ahora no ha sido posible investigar su base estructural en el mú sculo cardíaco
intacto en la escala de tiempo del latido del corazó n. Aquí aprovechamos los avances recientes
en líneas de luz de sincrotró n para la difracció n de rayos X de á ngulo pequeñ o de alta resolu‐
ció n para determinar la estructura, funció n y diná mica de los dominios locales del filamento de
miosina en la contracció n del mú sculo cardíaco con una resolució n temporal de 20 ms. Los re‐
sultados resaltan el papel de la regulació n basada en la miosina y los distintos dominios de los
filamentos de miosina en la determinació n del curso temporal de la contracció n.
RESULTADOS Y DISCUSIÓ N
Diná mica estructural de la contracció n en el mú sculo cardíaco. Trabé culas ú nicas, que consisten
en conjuntos tridimensionales (3D) altamente uniformes de cientos de cé lulas del mú sculo car‐
díaco acopladas elé ctrica y mecá nicamente con filamentos contrá ctiles alineados (Figura 1 A)
fueron disecados del ventrículo derecho de corazó n de rata. La longitud de cada conjunto su‐
perpuesto de filamentos de miosina y actina: la longitud del sarcó mero (SL) (Figura 1 B): se
midió continuamente mediante difracció n de rayos X de á ngulo ultrapequeñ o ( 4 ) (Figura 1 C,
Insertar y Película T1 ). Las trabé culas fueron estimuladas elé ctricamente una vez por segundo
(Figura 1 D). Una vez por minuto, justo antes del estímulo, cuando las cé lulas musculares está n
relajadas, y correspondientes a la fase diastó lica del ciclo contrá ctil en el corazó n intacto, se es‐
tiraron para simular el llenado del corazó n entre latidos (Higos. 1D _y2A _). Despué s del estí‐
mulo, la longitud trabecular se mantuvo constante a medida que se desarrollaba la fuerza ac‐
tiva. Los sarcó meros se acortan durante el desarrollo de la fuerza (Figura 2 B), y continuó
acortá ndose durante aproximadamente 100 ms despué s de la fuerza má xima (PF); La recupe‐
ració n del SL fue má s lenta que la relajació n de la fuerza. Los distintos cursos de tiempo de la
fuerza y SL indican la presencia de viscoelasticidad o carga interna ( Apéndice SI , Fig. S1 ).
Figura 1.
Organizació n estructural y difracció n de rayos X de filamentos de miosina en trabéculas cardíacas latentes. (

A ) Micrografía confocal de una trabécula cardíaca de rata teñ ida con anti-α-actinina (magenta) y anti-MyBP-C
(verde); Límite de cardiomiocitos delineado en amarillo. (Barra de escala 10 μm; recuadro , 2 μm.) ( B ) Orga‐
nizació n de los filamentos de actina (negro) y miosina en una repetició n de sarcó mero, lo que indica la zona
C que contiene MyBP-C (verde) y la P proximal y la D distal -zonas (blancas); punto medio del filamento de
miosina, M; Banda Z, Z (magenta). ( C) Patró n de difracció n de rayos X de ángulo pequeñ o de trabéculas des‐
membranadas en solució n relajante a SL 2,15 µm, 27 °C, que muestra reflexiones meridionales basadas en
miosina M1 a M6, la primera línea de la capa de miosina (ML1) y las líneas 1,0 y 1 ,1 reflexiones ecuatoriales
(atenuadas digitalmente). Datos agregados de cuatro trabéculas; tiempo total de exposició n, 160 ms; distancia
del detector, 1,6 m. ( Recuadro ) Patró n de rayos X de ángulo ultrapequeñ o que muestra los reflejos de se‐
gundo a quinto orden de la repetició n del sarcó mero; tiempo total de exposició n, 60 ms; distancia del detec‐
tor, 31 m. ( D ) Curso temporal de la fuerza y el cambio de longitud como porcentaje de la longitud inicial (%
L 0 ). Las trabéculas se estimularon (línea vertical, St) continuamente a 1 Hz a SL 1,95 µm, 27 °C. Una vez por
minuto, las trabéculas se estiraron un 10% L0 en 5 ms, comenzando 40 ms antes del estímulo. La duració n
original se restableció 600 ms después del estímulo.
Figura 2.
Dinámica estructural de los motores y filamentos de miosina durante el latido del corazó n. ( A ) Fuerza y
cambio de longitud trabecular (Δ L , expresado como porcentaje de la longitud inicial [ L 0 ]); La línea conti‐
nua vertical en t = 0 indica el estímulo eléctrico (St). Las líneas verticales punteadas, punteadas y disconti‐
nuas indican PF y el final de las fases 1 y 2 de relajació n, respectivamente. Los trazos grises muestran ± SEM
para la fuerza; n = 6 trabéculas. ( B - E ) Cambios en SL ( B ), relació n de intensidades ecuatoriales ( I 11 / I 10 ,
C ), espaciamiento de la reflexió n M6 ( SM6 , D ) e intensidad de reflexió n ML1 ( I ML1 , E ). Las barras de error
en B y C son SEM para n = 6 trabéculas; datos en D y E agregados de las mismas 6 trabéculas. Calibració n es‐
pacial descrita en Materiales y Métodos . Las líneas horizontales de puntos y rayas indican el valor de cada pa‐
rámetro antes del estímulo. Líneas continuas horizontales en C y D de dos trabéculas desmembranadas en re‐
lajació n en [Ca 2+ ] = 1 nM (naranja) y durante la contracció n isométrica activa en [Ca 2+] = 20 µM (azul),
fuerza 95 kPa.
La diná mica estructural de los motores y filamentos de miosina durante la contracció n se de‐
terminó con resolució n a escala nanomé trica en la misma població n de sarcó meros mediante
difracció n de rayos X de á ngulo pequeñ o (Figura 1 Cy Película T2 ). La relació n de las intensi‐
dades de las reflexiones ecuatoriales (1,1) y (1,0) ( I 11 / I 10 ) (Figura 2 Cy Apéndice SI , Tabla
S1 ), comú nmente utilizado como índice del movimiento de los motores de miosina hacia los fi‐
lamentos de actina, tiene el mismo curso temporal que la fuerza ( Apéndice SI , Tabla S2 ), con‐
sistente con la conclusió n del mú sculo esquelé tico ( 18 , 19) . ) que el desarrollo de la fuerza
sigue rá pidamente a la unió n de los motores de miosina a la actina. El calcio liberado durante
la contracció n de trabé culas intactas estimuladas elé ctricamente es submá ximo; Para controlar
el medio que bañ a los miofilamentos y, por lo tanto, la concentració n de calcio disponible, se
desmembranaron algunas de las trabé culas, como se describe en Materiales y métodos . Yo 11 /
Yo 10en trabé culas intactas en diá stole fue la misma que en trabé culas desmembranadas a una
concentració n estable de calcio muy baja [Ca 2+ ] (Figura 2 C, naranja), pero I 11 / I 10 en PF
fue menor que durante la activació n constante en saturació n de [Ca 2+ ] (Figura 2 C, azul) y
mucho má s bajo que cuando todos los motores de miosina está n unidos a la actina en rigor (
Apéndice SI , Tabla S1 ), lo que indica que solo una pequeñ a fracció n de los motores se unen a
la actina durante la contracció n de las trabé culas intactas.
Dos reflejos de rayos X que señ alan el estado regulador de los filamentos de miosina ( 2 , 6 , 7
), S M6 (Figura 2D) y yo ML1 (Figura 2 mi) tambié n rastrearon el desarrollo de la fuerza durante
la activació n ( Apéndice SI , Tabla S2 ), pero tuvieron distintos cursos de tiempo durante la rela‐
jació n. S M6 mide la periodicidad axial de la columna vertebral del filamento, que aumenta
aproximadamente un 1% durante el desarrollo de la fuerza (Figura 2D), que muestra que la
columna vertebral del filamento de miosina en el mú sculo cardíaco actú a como un mecanosen‐
sor para la activació n del filamento, como en el mú sculo esquelé tico ( 2 , 6 , 7 ). S M6 en diá stole
es cercano al de [Ca 2+ ] muy bajo (Figura 2D, naranja), pero SM6 en PF es menor que en [Ca 2+
] má ximo (Figura 2D, azul). La recuperació n de S M6 tiene componentes rá pidos y lentos, con
una pausa de 220 a 300 ms.
I ML1 , la intensidad de la primera línea de capa basada en miosina (Figura 1 C), señ ala el empa‐
quetamiento helicoidal de los motores de miosina en la superficie del filamento que inhibe su
interacció n con la actina ( 2 , 7 , 20 ). I ML1 en PF fue aproximadamente el 25% de su valor
diastó lico (Figura 2 mi). Dado que las intensidades difractadas son proporcionales al cuadrado
del nú mero de difractores, aproximadamente la mitad de los motores que está n ordenados he‐
licoidalmente en diá stole abandonan ese estado durante el desarrollo de la fuerza. Sorpren‐
dentemente, I ML1 no comenzó a recuperarse hasta aproximadamente 300 ms, cuando la
fuerza ya había regresado a aproximadamente un tercio de su valor má ximo.
Los resultados enFigura 2definen tres fases en la relajació n del mú sculo cardíaco. En la fase 1,
la fuerza disminuye a medida que continú a el acortamiento del sarcó mero, pero los motores
de miosina se desprenden de la actina ( I 11 / I 10 ) (Figura 2 C) y la periodicidad axial de la co‐
lumna vertebral del filamento comienza a recuperarse ( SM6 ) (Figura 2D) sin reaparició n de la
disposició n helicoidal de los motores ( I ML1 ) (Figura 2 mi). En la fase 2, de aproximadamente
220 a 300 ms, la fuerza continú a disminuyendo a medida que los sarcó meros se vuelven a ex‐
tender, la dispersió n SL aumenta ( Apéndice SI , Fig. S1 D ), pero no hay cambios ni en la perio‐
dicidad de la columna vertebral del filamento ni en la disposició n helicoidal de los motores. En
la fase 3, a partir de 300 ms, la dispersió n de SL disminuye y las señ ales estructurales relacio‐
nadas con la miosina se recuperan a sus niveles diastó licos.
Só lo alrededor del 10% de los motores de miosina está n unidos a actina en PF. Utilizamos las re‐
flexiones de la línea de la capa de rayos X asociadas con las periodicidades axiales de las hé li‐
ces basadas en miosina y actina, aproximadamente 43 y 37 nm, respectivamente (20), para es‐
timar el nú mero de motores de miosina unidos a la actina en PF. Aunque los perfiles axiales
observados de estas líneas de capas se superponen sustancialmente (Fig. 3), sus intensidades
relativas se pueden determinar con precisió n mediante deconvolució n gaussiana si se conocen

los espacios entre las líneas de las capas componentes. Esos espaciamientos de componentes
se determinaron en trabé culas desmembranadas en condiciones de relajació n en pCa7 (
Figura 3 A, magenta), elegido para estar cerca de las condiciones diastó licas en trabé culas in‐
tactas donde domina la hé lice basada en miosina, y en condiciones libres de trifosfato de ade‐
nosina (ATP) o de rigor (Figura 3 A, naranja), donde domina la hé lice basada en actina. Ambos
perfiles estaban bien equipados con un primer espaciado entre líneas de capas basado en mio‐
sina ( S ML1 ) de 43,11 ± 0,04 nm, y un primer espaciado entre líneas de capas basado en actina
( S AL1 ) de 36,56 ± 0,09 nm (media ± DE). Luego se aplicó el mismo procedimiento a las líneas
de capa observadas en trabé culas intactas estimuladas elé ctricamente en diá stole (Figura 3 B,
verde) y en PF (Figura 3 B, azul). En ambos casos, los perfiles estaban bien ajustados mediante
una funció n gaussiana doble con S ML1 y S AL1 restringidos a los valores medios anteriores. La
fracció n de motores de miosina unidos a la actina ( f A ) en PF se estimó a partir de la intensi‐
dad de la reflexió n AL1 ( I AL1 ) utilizando el modelo de Koubassova et al. ( 21 ) bajo el su‐
puesto de que todos los motores está n unidos a la acció n en rigor. La estimació n resultante de
f A en PF fue de aproximadamente 0,10 (consulte Materiales y métodos para obtener má s deta‐
lles), lo que concuerda razonablemente con una estimació n reciente de la mecá nica ( 22) .),
0,08 ± 0,01. Dado que hay 294 motores en cada filamento de medio espesor, só lo unos 29 mo‐
tores está n conectados a la actina en PF.
Fig. 3.
Fracció n de motores de miosina unidos a actina en su fuerza máxima. ( A ) Perfiles axiales de la línea de la
primera capa de trabéculas desmembranadas en condiciones de relajació n (pCa 7,0; magenta) y rigor (pCa
9,0, sin ATP; naranja). Datos agregados de cuatro trabéculas. Detector FReLoN con distancia muestra-detector
de 1,6 m. Tiempo total de exposició n, 160 ms. Temperatura, 27°C. Líneas continuas negras y rojas, ajustes
globales doble gaussianos a los perfiles de líneas de capa axiales, con posiciones de la capa de miosina 1
(ML1) y la capa de actina 1 (AL1) como parámetros comunes (líneas grises verticales continuas). Las líneas
de puntos y las líneas discontinuas son componentes gaussianos de los ajustes globales para ML1 y AL1, res‐
pectivamente. ( B) Perfiles axiales de la línea de la primera capa de trabéculas intactas en diástole (verde) y
en PF (azul). Datos agregados de cuatro períodos de tiempo en diástole y alrededor de PF. Detector Pilatus,
distancia muestra-detector, 3,2 m. Tiempo total de exposició n, 230 ms. Temperatura, 26,4 °C. Líneas conti‐
nuas negras y rojas, ajustes doble gaussianos a los perfiles axiales con posiciones de ML1 y AL1 restringidas
a las líneas grises verticales de los ajustes en A. Líneas de puntos y líneas discontinuas como en A.
Aproximadamente 400 moléculas de ATP se hidrolizan por medio filamento de miosina durante
el desarrollo de fuerza. La conclusió n de que só lo alrededor del 10% de los motores está n uni‐
dos a actina en PF no significa que el otro 90% no esté involucrado en el proceso de desarro‐
llo de fuerza. El nú mero así involucrado puede estimarse a partir del nú mero de molé culas de
ATP hidrolizadas por medio filamento durante el desarrollo de la fuerza ( n ATP ), utilizando el
supuesto generalmente aceptado de que un ATP se hidroliza en cada ciclo de interacció n mo‐
tora con actina. Estimamos n ATP en las condiciones de los presentes experimentos mediante
dos mé todos independientes (Figura 4). Primero, estimamos la fuerza má xima por filamento
grueso en 132 pN a partir de la fuerza trabecular por á rea de secció n transversal (Figura 2 A)
y d 1,0 , la separació n de los planos ecuatoriales (1,0), que es de 37,5 nm en diá stole en los pre‐
sentes experimentos, suponiendo que la red de miofilamentos ocupa el 60% del á rea de la sec‐
ció n transversal. Con 29 motores conectados a actina en PF, la fuerza por motor conectado es
de 4,4 pN, cerca de estimaciones recientes de la rigidez del sarcó mero ( 22 ) y mediciones de
una sola molé cula ( 23 ). El trabajo realizado durante el desarrollo de la fuerza se calculó a
partir de la fuerza del filamento y los cursos de tiempo SL (Figura 2 A y B) como 9.700 zJ por
medio filamento. Suponiendo que la energía libre de la hidró lisis del ATP, ~100 zJ por molé ‐
cula, se convierte en trabajo con una eficiencia del 22% ( 24 ), n ATP es aproximadamente 440
en PF (Figura 4, línea roja continua). Alternativamente, el trabajo por motocicleta individual se
puede estimar en 26,4 zJ [4,4 pN en una carrera de 6 nm ( 25 )], lo que conduce a una n ATP de
aproximadamente 370 en PF (Figura 4, línea roja discontinua). Se puede obtener una estima‐
ció n independiente del nú mero total de desprendimientos de motores durante el desarrollo de
la fuerza, calculado a partir de la fracció n n A de motores unidos a actina en cada punto de
tiempo (29 en PF y proporcionalmente menos en fuerzas má s bajas; ver má s abajo) y el desli‐
zamiento del filamento. (Figura 2 B), asumiendo que los motores pueden permanecer unidos
mediante un deslizamiento del filamento de 6 nm ( 25 ) y que se hidroliza una molé cula de ATP
por desprendimiento. Este mé todo da una n ATP de aproximadamente 380 en PF. Estas estima‐
ciones sugieren que la hidró lisis media de ATP por motor de miosina es de aproximadamente
400/294 o aproximadamente 1,3. Si solo el 10% de los motores conectados al PF está n activos
durante el desarrollo de la fuerza, cada uno de ellos necesitaría hidrolizar alrededor de 13
ATP en aproximadamente 200 ms, lo que corresponde a una tasa de rotació n por motor de
aproximadamente 65 s −1 , un orden de magnitud . mayores que los valores de las mediciones
de las proteínas aisladas ( 26). Por lo tanto, parece muy probable que muchas má s miosinas en
el medio filamento fuercen el desarrollo, pero que la mayoría de ellas interactú en transitoria‐
mente con la actina y se hayan desprendido antes del PF.
Figura 4.
Hidró lisis de ATP por medio filamento durante el desarrollo de la fuerza y hasta el pico de acortamiento.
Fuerza (negro) y nú mero de ATP hidrolizados por medio filamento (rojo), calculados como se describe en el
texto principal a partir de la eficiencia termodinámica (línea roja continua) o a partir de la suposició n de que
los motores permanecen unidos a la actina durante un recorrido de 6 nm ( línea discontinua roja), trazada
contra el deslizamiento del filamento ( A ) o el tiempo ( B ).
El PF de contracció n en el mú sculo cardíaco estimulado eléctricamente lo soportan motores en la

zona C del filamento de miosina. A continuació n, utilizamos interferencia de rayos X para locali‐
zar los cambios estructurales diná micos en los motores de miosina durante la contracció n de
dominios específicos del filamento de miosina. Cada medio filamento contiene 49 capas de mo‐
tores de miosina con una separació n axial de aproximadamente 14,5 nm, comenzando aproxi‐
madamente a 80 nm desde el punto medio del filamento (M) (Higos. 1B _y5A _). Las capas 7 a
31 constituyen la zona C que contiene la proteína C de unió n a miosina (MyBP-C) (
Figura 1 A y B, verde yFigura 5 A, gris oscuro), 1 a 7 la zona proximal o P, y 31 a 49 la zona dis‐
tal o D ( 13 ). La interferencia de rayos X entre los dos conjuntos de motores en cada filamento
de miosina multiplica efectivamente el perfil axial de la reflexió n de rayos X M3 producida por
un ú nico conjunto de motores (Figura 5 B, rojo) por un patró n de flecos (Figura 5 B, azul) con
periodicidad determinada por la distancia entre los centros de los dos conjuntos de motores,
la distancia de interferencia (ID) (Figura 5 A), lo que da como resultado un perfil característico
de picos mú ltiples (Figura 5 B, negro) ( 27 ).
Figura 5.
Determinació n de la ubicació n de los motores de difracció n en el filamento de miosina mediante interferen‐

cia de rayos X. La columna de la izquierda ( A , D y G ) muestra las capas ordenadas (rojas) de motores de mio‐
sina en cada filamento de medio espesor en el sarcó mero que contribuyen a la reflexió n de los rayos X M3 y
las capas desordenadas (gris claro) que no . Por simplicidad, solo se muestra una de cada tres capas de moto‐
res. La distancia de centro a centro entre las capas ordenadas es la distancia de interferencia (ID, azul). Las
zonas C están sombreadas en gris oscuro. La columna Centro ( B , E y H) muestra la distribució n de intensi‐
dad de la reflexió n M3 que sería producida por un ú nico conjunto de motores ordenados en cada medio fila‐
mento (rojo), las franjas (azul) producidas por la interferencia entre los dos conjuntos en cada filamento y el
producto del rojo y funciones azules, el perfil M3 resultante (negro) para el conjunto de parámetros especifi‐
cado en el Apéndice SI . La columna derecha ( C , F e I ) muestra los perfiles M3 experimentales correspondien‐
tes (negro) ajustados por mú ltiples funciones gaussianas para los picos de ángulo inferior (LA, naranja), me‐
dio (MA, magenta) y superior (HA, verde). Los datos en C y F se suman de seis trabéculas, en I de dos. ElLa
fila superior ( A – C ) es para trabéculas intactas en diástole, la fila media ( D – F ) para trabéculas intactas con
fuerza máxima y la fila inferior ( G – I ) para trabéculas desmembranadas con activació n total del calcio.
Tenga en cuenta que los perfiles calculados ( columna central ) no incluyen el ensanchamiento debido a la
funció n de dispersió n de puntos del sistema cámara/detector en los perfiles experimentales ( columna dere‐
cha ), pero esta diferencia se evita en el análisis presentado en el texto por Gaussian. ajustando perfiles tanto
experimentales como calculados.
El perfil observado de la reflexió n M3 en diá stole (Figura 5 C) es consistente con lo esperado

de la interferencia entre casi todos los 294 motores en cada medio filamento (Figura 5 A, rojo),
con un pico dominante central o de á ngulo medio (MA) y pequeñ os saté lites de á ngulo bajo
(LA) y alto (HA), como se describió anteriormente para el mú sculo esquelé tico en reposo (27,
28) y el mú sculo cardíaco diastó lico ( 4 ) . Se observó un perfil similar en el mú sculo cardíaco
con [Ca 2+ ] muy bajo ( Apéndice SI , Fig. S2 A ). Sin embargo, en PF (Figura 5 F), los picos LA y
HA se vuelven má s intensos y má s separados, lo que muestra que el perfil M3 correspondiente
a la matriz de un solo motor se ha vuelto má s amplio (Figura 5 mi, rojo) y que las franjas de
interferencia está n má s espaciadas (Figura 5 mi, azul), y por lo tanto que el conjunto de moto‐
res en cada medio filamento se ha acortado y se ha desplazado hacia el punto medio del fila‐
mento (Figura 5D, rojo) ( 29 ). De hecho, las intensidades relativas observadas y las posiciones
de los subpicos de la reflexió n M3 en PF (Figura 5 F) coinciden con los esperados si los moto‐
res que contribuyen a la reflexió n está n confinados a la zona C (Figura 5D, gris oscuro). Por el
contrario, en la activació n má xima del calcio, el perfil de la reflexió n M3 se vuelve má s estrecho
una vez má s (Fig.5 H y yo, rojo), y las franjas de interferencia está n má s espaciadas (
Fig.5 H y yo, azul). El perfil observado (figura 5 yo) vuelve a ser lo esperado de casi todos los
294 motores (Figura 5G, rojo), como se informó anteriormente para la activació n completa del
mú sculo esquelé tico ( 27 , 28 ), y con mayor fuerza en las trabé culas que se estiran durante la
activació n ( 2 ).
El espaciado medio de la reflexió n M3 ( SM3 ) fue aproximadamente un 1,2% mayor durante la

activació n completa que en la diá stole (Figura 6 C), como se puede ver en el desplazamiento
hacia la izquierda del perfil M3 en activació n completa (Figura 5 C y yo), similar al observado
en la activació n completa del mú sculo esquelé tico ( 27 , 28 ), pero el cambio en SM3 en PF en el
mú sculo cardíaco estimulado elé ctricamente (Higos. 5F _y6 C) es inferior al 0,25%. En diá stole,
SM3 es exactamente el doble de SM6 ( Apé ndice SI , Tabla S1 ), como se esperaba para una periodicidad
motora (SM3 ) determinada por su unió n a la columna vertebral del filamento, que domina SM6 .
Esta proporció n se conserva durante la activació n completa en el mú sculo esquelé tico ( 27 , 28
) y, dentro de la precisió n de las mediciones, en el mú sculo cardíaco ( Apéndice SI , Tabla S1 ).
Sin embargo, en la PF en el mú sculo cardíaco, la relación SM3 : SM6 es significativamente menor
que dos ( 2). Se desconoce la base estructural para el desacoplamiento de SM3 y SM6 durante
la contracción del músculo cardíaco estimulado eléctricamente , pero se produce un efecto similar de forma
transitoria en la activación del mú sculo esquelé tico ( 18 ). Los resultados enfigura 5sugerir una posible ex‐
plicació n. SM M6 mide la periodicidad de la columna vertebral de todo el filamento, pero SM M3
en PF (pero no en la activació n completa del calcio) proviene solo de motores en la zona C (
Figura 5D, rojo, gris oscuro), por lo que el comportamiento observado se reproduciría si la pe‐
riodicidad axial del filamento de miosina fuera aproximadamente un 2% menor en la zona C
que en las zonas P y D. La clara superrepetició n de la titina, la "regente molecular" del fila‐
mento de miosina, en la zona C ( 30 ) hace que esa hipó tesis sea estructuralmente plausible.
Figura 6.
Determinació n del nú mero de motores en conformaciones estándar mediante interferencia de rayos X. ( A )

Conformaciones de motor estándar: plegado (F, morado), unido a actina (A, verde), compañ ero de un motor
adjunto (P, amarillo) e isotró pico (I, gris). Hacia el punto medio del filamento, M; Banda Z, Z. ( B – E ) Cursos
de tiempo de intensidad M3 ( I M3 , B ) y espaciado ( SM3 , C ), y la intensidad fraccionaria ( D ) y espaciado ( E
) de sus tres picos componentes con color có digo como enFigura 5 C. Datos agregados de seis trabéculas. St,
estímulo. Líneas verticales como enFigura 2. ( Recuadro derecho ) Valores de trabéculas desmembranadas en
relajació n (triángulos) y activació n completa (diamantes); tenga en cuenta que el pico de HA no se puede me‐
dir en pCa 4,7. Las líneas cian indican los resultados de los cálculos descritos en el texto para los siguientes
parámetros: ( F ) Espaciado de los motores de miosina en la zona C ( S M3c ). ( GRAMO ) Capas difractantes de
motores de miosina (barras verticales rojas) y su posició n en el medio filamento de miosina como se mues‐
tra en el recuadro de la derecha . ( H ) Nú mero de motores plegados, unidos a actina e isotró picos por medio
filamento; có digo de color como en A . ( I ) Los motores plegados en Hresuelto en el nú mero máximo en la
matriz helicoidal ( F H , rosa oscuro) y el resto de motores no helicoidales ( F NH , rosa claro). ( J ) Fuerza y
cambio de longitud trabecular reproducidos deFigura 2 Apara referencia.
Nú mero de motores de miosina en conformaciones está ndar durante el ciclo de contracció n-

relajació n. Las intensidades relativas de los subpicos de interferencia de la reflexió n M3 en
cada momento durante la contracció n (Figura 6 D) y sus espaciamientos (Figura 6 mi) brindan
informació n precisa sobre la conformació n diná mica de los motores de miosina y la ubicació n
de los filamentos de esas conformaciones de los motores. Dado que las conformaciones de
motores está ndar se definieron en trabajos anteriores ( 2 , 25 , 28 ), utilizamos estos datos de
interferencia de rayos X para determinar la cantidad de motores en cada conformació n en
cada momento. Consideramos cuatro conformaciones motoras: 1) Unida a actina (A) (
Figura 6 A, verde) motores generadores de fuerza; 2) “compañ ero” (P) (Figura 6 A, amarillo)
motores en un dímero de miosina AP; 3) motores que está n plegados (F) (Figura 6 A, pú rpura)
contra la superficie del filamento en el "motivo de cabezas interactivas" ( 9 , 17 ), superrelajado
( 8 ) o "estado APAGADO" ( 6 , 7 ) que los hace no disponibles para la interacció n con actina; y
4) isotró pico (I) (Figura 6 A, gris) o motores desordenados, que no contribuirían a la reflexió n
M3. El nú mero de motores A por medio filamento en PF ( n A ) es aproximadamente 29, como
se analizó anteriormente; en otros momentos, es probable que n A sea proporcional a la
fuerza, como lo indica el curso temporal de las reflexiones de rayos X ecuatoriales (Figura 2 C),
y por datos mecá nicos y de rayos X del mú sculo esquelé tico ( 18 , 28 ). n P = n A por definició n,
por lo que los ú nicos pará metros necesarios para calcular el perfil axial de la reflexió n M3 son
el nú mero de motores plegados ( n F ), la periodicidad axial de los motores ( S M3 ), que se su‐
pone es un 2% má s corto en la zona C como se discutió anteriormente, y la primera y ú ltima
capa de la matriz de motores ordenados en cada medio filamento (Figura 5 A , D y G, rojo), se
supone que por simplicidad son contiguos.
Utilizamos una bú squeda global de estos cuatro pará metros ( Apéndice SI ) para determinar el
mejor ajuste a las intensidades relativas (Figura 6 D, líneas cian) y espacios absolutos (
Figura 6 mi, líneas cian) de los componentes LA, MA y HA de la reflexió n M3 en cada punto
temporal durante la contracció n de trabé culas intactas estimuladas elé ctricamente (Figura 6,
círculos) y en trabé culas desmembranadas en relajació n (Figura 6, cuadro a la derecha, triá n‐
gulos) y activació n completa (Figura 6, diamantes). Los pará metros globales de mejor ajuste
reprodujeron las intensidades relativas y los espaciamientos de los subpicos de la reflexió n M3
(Figura 6 D y E), S M3 (Figura 6 C) y, en una primera aproximació n, la intensidad total ( I M3 ) (
Figura 6 B) en cada momento y en cada condició n. La periodicidad axial de la zona C, S M3c (
Figura 6 F), aumentó aproximadamente un 0,9% en PF, similar al aumento en SM6 (Figura 2D),
apoyando la hipó tesis de trabajo de la secció n anterior de que los motores siguen la periodici‐
dad de la columna vertebral del filamento de miosina durante la contracció n, pero la periodici‐
dad del filamento es un 2% má s corta en la zona C.
Los resultados de estos cá lculos confirman y cuantifican las conclusiones defigura 5. En diá s‐
tole casi todas las capas motoras de cada medio filamento está n ordenadas (Figura 6G). El nú ‐
mero de capas ordenadas disminuye durante el desarrollo de la fuerza, y en PF solo se orde‐
nan las capas 8 ± 3 a 32 ± 2 (media ± DE) (Figura 6G), consistente con los límites de la zona C
determinados por microscopía electró nica ( 13 ) e inmunofluorescencia (Figura 1 A), que es
de las capas 7 a 31 (Figura 6G, Inserción derecha , gris). Dado que los motores A está n muy or‐
denados ( 25 ), concluimos que la fuerza má xima de contracció n la soportan los motores A en
la zona C. n F en PF fue 41 ± 14 (Figura 6H). Como las otras capas está n desordenadas, estos
motores plegados tambié n deben estar en la zona C. Los motores helicoidales está n plegados,
por lo que el nú mero de motores helicoidales en PF no puede ser superior a 41 ± 14. El cam‐
bio en la intensidad de la línea de la capa ML1 (Figura 2 mi) muestra que el nú mero de moto‐
res helicoidales en diá stole es aproximadamente el doble que en PF, por lo que el nú mero má ‐
ximo de motores ordenados helicoidalmente en diá stole no puede ser superior a 82 ± 28. Este
nú mero representaría completamente aproximadamente dos tercios de todos los los motores
en la zona C ( 17 ), lo que hace muy poco probable que los ∼105 motores plegados en las zo‐
nas P y D en diá stole (Higos. 6 yoy7,
rosa claro) está n ordenados en forma helicoidal. Este re‐
sultado muestra que hay ambas hé lices plegadas (Higos. 6 yoy7, rosa oscuro) y motores no he‐
licoidales plegados (Higos. 6 yoy7,
rosa claro), y que los motores helicoidales plegados está n
confinados en la zona C.
Figura 7.
Conformaciones motoras de miosina y estados reguladores de las zonas de filamentos de miosina durante la
contracció n. ( Izquierda ) Conformaciones motoras en el medio sarcó mero en diástole: plegada y ordenada
helicoidalmente ( F H , rosa oscuro), plegada no helicoidal ( F NH , rosa claro) e isotró pica ( I , gris). MyBP-C
(azul) puede unirse a filamentos de actina o asociarse con motores helicoidales. ( Derecha ) Ampliació n de
las zonas C y D en los momentos indicados por los círculos en el trazo de fuerza. St, estímulo. Motores co‐
nectados a actina (A, verde); socios de motores A (P, amarillo). El estado regulador de la columna vertebral
del filamento de miosina se indica desde el rosa (más adelante), pasando por el naranja hasta el amarillo bri‐
llante (más adelante).
Activació n dependiente de la longitud y mecanismo de Frank-Starling. El estiramiento de las tra‐

bé culas en diá stole aumenta la fuerza activa en la siguiente contracció n (Figura 1 D). Esta res‐
puesta, llamada activació n dependiente de la longitud (LDA), es fisioló gicamente importante
como base celular del latido cardíaco má s fuerte que sigue al aumento del retorno de sangre
venosa en el corazó n intacto, el mecanismo de Frank-Starling (31 ) . Algunos estudios de rayos
X anteriores han sugerido que la LDA está mediada por la activació n por estiramiento del fila‐
mento de miosina en diá stole ( 32 ), mientras que otros ( 33 ) llegaron a la conclusió n opuesta.
Aquí, como en la ref. 32 , aplicamos el estiramiento justo antes de un estímulo para aislar el
efecto inmediato del cambio de longitud de cambios má s lentos en el manejo del calcio intrace‐
lular pero, como la ref. 33, limitamos la amplitud del estiramiento para minimizar el cambio en
la fuerza pasiva, mientras manteníamos una respuesta LDA robusta, casi duplicando la fuerza
activa en respuesta al siguiente estímulo (Figura 1 D). Descubrimos que el estiramiento diastó ‐
lico de baja fuerza puede producir una gran respuesta LDA sin cambios significativos en el es‐
tado regulador del filamento de miosina, segú n lo monitoreado por SM6 o IML1 (Figura 2 D y E), de
acuerdo con las conclusiones de la ref. 33 . Ademá s, el estiramiento diastó lico no produjo cam‐
bios en la conformació n de los motores de miosina, segú n lo determinado a partir de la estruc‐
tura fina de interferencia de la reflexió n de rayos X M3 y su interpretació n en té rminos de po‐
blaciones motoras (Figura 6). Estos resultados sugieren que la respuesta de Frank-Starling del
corazó n intacto no está mediada por un cambio inmediato en la estructura de los filamentos
de miosina que acompañ a al aumento de la tensió n de los filamentos de miosina en el estira‐
miento diastó lico, y que un mecanismo adicional de detecció n de longitud debe subyacer a la
LDA. Ese mecanismo adicional aú n no se ha dilucidado, pero parece involucrar tanto a la ac‐
tina como al filamento de miosina ( 31 ).
Control de la Diná mica del Desarrollo de Fuerzas. El nú mero de motores en cada conformació n
en cada momento durante la contracció n (Figura 6 yo), combinado con la conclusió n anterior
de que alrededor de 400 motores por medio filamento hidrolizan el ATP durante el desarrollo
de la fuerza (Figura 4), pero só lo ~29 motores en la zona C soportan la fuerza activa (Higos. 5
y6), conducen a una nueva descripció n de la diná mica contrá ctil en el mú sculo cardíaco (
figura 7). Durante el desarrollo de la fuerza, los motores helicoidales y plegados se pierden
aproximadamente en el mismo tiempo medio que el aumento de la fuerza (Figura 6 yoy Apén‐
dice SI , Tabla S2 ), con SM6 ligeramente má s rá pido, consistente con la hipó tesis de mecanode‐
tecció n de activació n de filamentos descrita para el mú sculo esquelé tico ( 6 , 7 ). Esa hipó tesis
postuló que algunos motores está n constitutivamente encendidos (es decir, no está n en el es‐
tado plegado apagado) incluso a niveles bajos de activació n del filamento de actina; Los resul‐
tados actuales muestran que es probable que estos motores constitutivamente encendidos es‐
té n en la zona D- (o P-) (figura 7, diá stole). Los motores de la zona D está n má s cerca de los si‐
tios de liberació n de calcio y, por lo tanto, son los primeros en activarse ( 16 ), lo que activaría
el resto del filamento segú n el paradigma de mecanodetecció n ( 2 , 7 ). Los motores de la zona
D tampoco son helicoidales y no está n sujetos a inhibició n por MyBP-C ( 14 ). Durante el desa‐
rrollo de la fuerza, los motores de la zona D se vuelven má s desordenados (Higos. 6G _y7); en
PF todos son isotró picos y, debido a que no hay motores unidos a actina en la zona D, no hay
tensió n en la columna vertebral del filamento de la zona D, lo que inhibe la zona D mediante
mecanodetecció n (figura 7, FP). Por el contrario, los filamentos de actina en la zona C se sensi‐
bilizan al calcio mediante la unió n del extremo N de MyBP-C ( 14 , 15 ) y permanecen activos
por má s tiempo. El efecto dual de MyBP-C para inhibir los filamentos de miosina pero activar
los filamentos de actina ( 14 ) puede explicar tanto la activació n má s temprana como la inacti‐
vació n má s temprana de la zona D en relació n con la zona C.
Control de la Diná mica de la Relajació n. La relajació n mecá nica, a diferencia del desarrollo de
fuerza, está determinada principalmente por el desprendimiento de los motores de la zona C,
lo que sugiere una posible explicació n para el papel clave del estado de fosforilació n de MyBP-
C en la diná mica de la relajació n (34 ) . La diná mica estructural y zonal de relajació n tiene tres
fases ciné ticas (Higos. 2y7).
En la fase 1, desde PF hasta el acortamiento má ximo en aproxima‐
damente 220 ms, algunos motores se desprenden de la actina como lo indica la disminució n de
la fuerza y I 11 / I 10 (Figura 2 C). La tensió n de la columna vertebral del filamento disminuye
aproximadamente en proporció n a la fuerza ( S M6 ) (Figura 2D), pero casi no hay recupera‐
ció n de la periodicidad axial de la zona C ( S M3c ) (Figura 6 F), lo que indica que la zona C perma‐
nece activa, presumiblemente todavía estabilizada por la unió n de MyBP-C a los filamentos de
actina, y que la fase rá pida de recuperació n de la tensió n de la columna vertebral del filamento
(SM6 ) (Figura 2D) se debe al apagado de la zona D. En la fase 2, de aproximadamente 220 a
300 ms, la fuerza continú a disminuyendo a medida que los sarcó meros se vuelven a extender,
la dispersió n SL aumenta ( Apéndice SI , Fig. S1 D ) y reaparecen los motores F (Figura 6H). S
M3c se recupera (Figura 6 F) , indicando el apagado de la zona C, pero sorprendentemente no
hay recuperació n adicional de la periodicidad de la columna vertebral del filamento ( SM6 ) (
Figura 2D) o la disposició n helicoidal de los motores ( I ML1 ) (Higos. 2 miy6 yo), mostrando
que los motores ordenados que aparecen en la zona D en la fase 2 son plegados pero no heli‐
coidales (Higos. 6 yoy7).
En la fase 3, a partir de 300 ms, la dispersió n SL disminuye, los moto‐
res de la zona P se ordenan, la hé lice del motor diastó lico se reforma en la zona C (Figura 6 yo
), y se completa la recuperació n de la periodicidad de la columna vertebral del filamento (
Figura 2D).
Esta diná mica estructural muestra que el filamento de miosina se enciende y apaga en la se‐
cuencia zonal D a C a P, como se esperaba de la hipó tesis de activació n del filamento por meca‐
nodetecció n, ya que la tensió n del filamento disminuye desde la banda M hasta la punta del fi‐
lamento. Ademá s, el plegado de los motores de miosina contra la columna vertebral del fila‐
mento se disocia ciné ticamente de la reformació n de la disposició n helicoidal de los motores
descrita anteriormente para filamentos aislados ( 9 , 17 ). El plegamiento puede estabilizarse
mediante una interacció n intramolecular motor-cola, mientras que el estado helicoidal puede
requerir interacciones intermoleculares adicionales que está n acopladas a la periodicidad má s
corta de la columna vertebral del filamento, vinculada a la presencia de MyBP-C o la distinta
periodicidad de la titina en el C- zona.
Los resultados descritos anteriormente establecen un paradigma para la regulació n basada en

la miosina de la fuerza y el curso temporal de la contracció n en el mú sculo cardíaco en el que
los motores de miosina en los diferentes dominios del filamento desempeñ an funciones distin‐
tas y previamente no reconocidas. La relació n detallada entre estos mecanismos a nivel de fila‐
mentos y las vías de señ alizació n ascendentes aú n está por determinarse y extenderse al ciclo
cardíaco fisioló gico y a los modelos de enfermedad. Los resultados aquí presentados estable‐
cen la base conceptual y experimental para esa tarea.
MATERIALES Y MÉ TODOS
Preparació n de Trabéculas Cardíacas y Protocolo Experimental. Rattus norvegicus , cepa Wistar

Han (macho, de 6 a 8 semanas de edad) fue suministrada por Charles River Laboratories y
alojada en la casa de animales de la institució n de origen (King's College London) o de la insta‐
lació n biomé dica del Sincrotró n Europeo. Instalació n de radiació n (ESRF) a 20 °C, 55% de hu‐
medad relativa y ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Se proporcionó agua y comida ad libitum. El
día del experimento, las ratas fueron sacrificadas mediante dislocació n cervical despué s de se‐
dació n con isoflurano de conformidad con el Anexo 1 del Ministerio del Interior del Reino
Unido y la regulació n de la Unió n Europea (directiva 2010/63), seguido de un mé todo de con‐
firmació n. El corazón se extirpó rá pidamente y se canuló a travé s de la aorta ascendente y se perfundió retrógradamente
con un tampón de Krebs-Henseleit modificado (NaCl 119 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,5 mM, NaH2 1,2 mM ) .PO4 ,
MgSO4 1,2 mM , NaHCO3 25 mM , glucosa 10 mM , BDM 25 mM) equilibrado con carburó geno
(95% O2 , 5% CO2 ) . Se diseccionaron trabé culas individuales no ramificadas del ventrículo
derecho bajo un estereomicroscopio y se montaron clips "similares a escorpiones" hechos de
alambre de acero inoxidable en los extremos de la vá lvula y de la pared ventricular de cada
trabé cula. Longitud trabecular ( L 0) y el á rea de la secció n transversal se midieron despué s de

estirar hasta justo por encima de la longitud floja. Luego se montaron en el canal experimental
lleno con el mismo amortiguador entre las palancas de un transductor de fuerza extensímetro
y un motor (322C, Aurora Scientific Inc.) en longitud floja. Luego se perfundió la trabé cula con
un tampó n que contenía CaCl 2 1,4 mM sin BDM a 26,4 ± 0,2 °C (media ± DE, n= 6 trabé culas).
Se colocaron dos ventanas de mica que llevaban electrodos estimulantes de platino lo má s
cerca posible de la trabé cula para minimizar la trayectoria de los rayos X en la solució n, y las
trabé culas se marcaron elé ctricamente a 1 Hz durante al menos 30 minutos antes del inicio del
experimento. El SL se midió en mú ltiples puntos a lo largo de la trabé cula mediante difracció n
de rayos X de á ngulo ultrapequeñ o a una distancia de 31 m entre la muestra y el detector, y el
SL promedio en diá stole se estableció en 1,94 ± 0,03 μm. Una vez por minuto, se aplicó un esti‐
ramiento en rampa (10% L 0 en 5 ms) en diá stole 40 ms antes del estímulo ( Apéndice SI , Fig. S1).) seguida
de una liberació n a la longitud original despué s de una relajació n mecá nica, 600 ms despué s
del estímulo. Este protocolo de liberació n de estiramiento en rampa transitoria nos permitió
promediar los datos de activaciones repetidas en el SL má s largo sin alterar el transitorio de
calcio ( 31 ).
Las trabé culas intactas aisladas se fijaron y se tiñ eron con un anticuerpo monoclonal de rató n
antisarcomé rico α-actinina (clon EA-53, Sigma-Aldrich) y un anticuerpo policlonal de conejo
anti-MyBP-C, amablemente donado por M. Gautel, King's College London, Londres. REINO
UNIDO; para obtener detalles sobre el protocolo, consulte Iskratsch et al. ( 35 ). La micrografía
confocal (Figura 1 A) se recolectó a temperatura ambiente en un microscopio confocal LEICA
SP5 equipado con lá seres de argó n y helio-neó n y un objetivo de inmersió n en aceite de 63 ×
en modo de escaneo secuencial.
Para experimentos con trabé culas desmembranadas, las trabé culas aisladas se desmembrana‐
ron durante 20 minutos en hielo en una solució n relajante en presencia de BDM (25 mM) y
Triton X-100 1% (vol/vol), luego se almacenaron a -20 °C en una solució n de almacenamiento.
(Imidazol 6 mM, KPr 70 mM, MgAc 2 8 mM , EGTA 5 mM, Na 2 ATP 7 mM, NaN 3 1 mM , glicerol
al 50%) durante hasta 24 h. Se colocaron clips en T de aluminio en los extremos de las trabé ‐
culas y se montaron en un aparato multigota con temperatura controlada ( 36) .) en solució n
relajante a ~2,15 µm SL entre las palancas de un transductor de fuerza extensímetro y el mo‐
tor Aurora. Antes de cada experimento, los extremos de las trabé culas se fijaron con goma laca
disuelta en etanol a 2 °C. La solució n relajante contenía: imidazol 25 mM, KPr 45 mM, MgAc 2
6,89 mM , EGTA 10 mM, Na 2 ATP 5,56 mM, Na 2 -creatina fosfato (CP) 20 mM , (pCa= −log [Ca 2+ ] =
9 ). La solució n de preactivació n contenía: imidazol 25 mM, KPr 46 mM, MgAc2 6,48 mM , EGTA
0,1 mM, HDTA 9,9 mM, Na2ATP 5,6 mM , Na2CP 20 mM (pCa 9) . La solución activadora contenía: imidazol 25
mM, KPr 46 mM, MgAc2 6,39 mM , CaEGTA 10 mM, Na2 5,65 mM .ATP, Na2CP 20 mM ( pCa 4,7). La
solució n de rigor contenía: imidazol 25 mM, KPr 134 mM, MgAc2 1,5 mM , EGTA 10 mM (pCa
9). Se obtuvo una solució n que coincidía con la concentració n fisioló gica de calcio en diá stole
(pCa 7) mezclando 62,5% y 37,5% de solució n relajante y activadora (vol/vol), respectiva‐
mente. En todas las soluciones [Mg 2+ ] libre = 1,0 mM, fuerza ió nica = 180 mM y pH 7,1 a 25
°C. Se añ adió el agente osmó tico dextrano T500 (3% [peso/vol]) a todas las soluciones experi‐
mentales (excepto rigor) para reducir el espacio entre filamentos a un valor similar al de las
trabé culas intactas (37) .). Justo antes del experimento, se agregaron a todas las soluciones la
mezcla de inhibidor de proteasa P8340 (Sigma) y DTT 2 mM. La trabé cula se activó con un
protocolo de salto de temperatura: inicialmente se equilibró en una solució n preactivadora a 2
°C durante 5 min, luego se transfirió a 1) solució n activadora a 2 °C durante aproximadamente

8 s para alcanzar una fuerza constante, 2) activació n solució n a 27 °C, 3) en aire para la expo‐
sició n a los rayos X, y 4) finalmente de nuevo a la solució n relajante.
Recolecció n de datos de rayos X. Para las trabé culas intactas, se selló el canal para evitar fugas
de solució n y la trabé cula se montó verticalmente en la línea de luz ID02 del ESRF, que propor‐
cionó hasta 2 × 10 13 fotones s −1 a una longitud de onda de 0,1 nm en un haz de tamañ o 300
μm. (horizontal, ancho completo a la mitad del má ximo) y 70 μm (vertical) en la posició n de la
muestra ( 38). El haz se atenuó al 3% (atenuador de Fe de 25 μm) para la alineació n de las tra‐
bé culas. Para minimizar el dañ o por radiació n, la exposició n a los rayos X se limitó al período
de recolecció n de datos utilizando un obturador electromagné tico rá pido (nmLaser Products)
y la trabé cula se movió verticalmente entre 100 y 200 μm entre las contracciones utilizadas
para la adquisició n de datos de rayos X. Los datos de rayos X se recogieron de la regió n cen‐
tral (1,1 ± 0,2 mm, media ± DE) de la trabé cula, evitando las regiones menos uniformes o dé bil‐
mente difractantes cerca de las inserciones y el mayor contenido de colá geno cerca del ex‐
tremo de la vá lvula. El tiempo má ximo de exposició n de haz completo en cada posició n fue de
aproximadamente 20 ms. Se recogieron datos de 12 a 30 contracciones en cada trabé cula;
fuerza sistó lica má xima ( T PF) disminuyó menos del 10% durante la serie y no hubo signos de‐
tectables de dañ o por radiació n en el patró n de difracció n de rayos X. Los datos de rayos X se
registraron utilizando el detector de conteo de fotones Pilatus 300K (Dectris), compuesto por
tres mó dulos, á rea total de 83,8 mm × 106,5 mm con 487 × 619 píxeles, tamañ o de píxel de
172 μm × 172 μm. Los espacios de diecisiete píxeles entre los mó dulos dividen el patró n meri‐
dional en tres; las reflexiones ecuatoriales y ML1/M1 y M2 basadas en miosina estaban en el
mó dulo central; los reflejos de M3 y M6 estaban cerca de los bordes de los mó dulos exteriores
( Película S2). La distancia entre la muestra y el detector se estableció en 31 m para registrar
las reflexiones sarcomé ricas o en 3,2 m para registrar las reflexiones meridionales hasta el
M6. En cada activació n se registraron 37 fotogramas consecutivos de una regió n local de la tra‐
bé cula a intervalos de 20 ms; en cada cuadro, los datos se recopilaron durante 17 ms seguidos
de un tiempo muerto de 3 ms. La principal ventaja de este protocolo y detector sobre experi‐
mentos anteriores que combinan un obturador rá pido con un detector de dispositivo de carga
acoplada (CCD) de lectura lenta es que cada punto de tiempo proviene de la misma combina‐
ció n de regiones trabeculares; su principal limitació n es que cada punto de las trabé culas
queda expuesto durante 740 ms, lo que produciría dañ os por radiació n si se utilizara la inten‐
sidad completa del haz. Por lo tanto, todos los experimentos resueltos en el tiempo utilizaron
un atenuador de Fe de 25 μm para reducir la intensidad del haz al 3%. de modo que la exposi‐
ció n equivalente a la luz completa fue de 22,2 ms (= 740 ms × 0,03). La relació n señ al-ruido
aumentó con un promedio de señ al de 12 a 30 contracciones por trabé cula para seis trabé cu‐
las con longitudL 0 = 2,5 ± 0,5 mm, á rea de secció n transversal = 59.000 ± 26.000 μm 2 y PF T
PF = 50,4 ± 10,0 kPa (media ± DE).
Para experimentos de rayos X en trabé culas desmembranadas, un aparato multigota propor‐

cionó un rá pido intercambio de solució n de trabé culas montadas verticalmente en la línea de
luz. Los patrones de difracció n de rayos X se registraron utilizando el detector CCD FReLoN de
alta resolució n espacial ( 38 ), con un á rea activa de 50 mm × 50 mm, 2048 × 2048 píxeles, ta‐
mañ o de píxel de 24 μm × 24 μm. Los patrones de rayos X se agruparon en 8 en direcció n ho‐
rizontal antes de la lectura para aumentar la relació n señ al-ruido a lo largo del eje meridional.
Se agregaron datos de dos a cuatro trabé culas paraHigos. 2 C y D,3,5 yo, y6B - E _y Apéndice SI ,
Fig. S2 y Tabla S1 para aumentar aú n má s la relació n señ al-ruido. El á rea transversal promedio
fue de 37.000 ± 11.500 μm 2 (media ± DE) y la longitud de 1,55 ± 0,35 mm.
Aná lisis de datos de rayos X. Los datos de difracció n de rayos X de á ngulo pequeñ o se analiza‐
ron utilizando el paquete SAXS (P. Boesecke, ESRF, Grenoble, Francia), Fit2D (A. Hammersley,
ESRF, Grenoble, Francia) e IgorPro (WaveMetrix, Inc.).
Aná lisis de los patrones de difracció n de rayos X de á ngulo ultrapequeñ o recopilados a una
distancia de 31 m entre la muestra y el detector. La distribució n de intensidad meridional se ob‐
tuvo a partir de patrones de rayos X bidimensionales (2D) registrados en dos a cuatro ubica‐
ciones en la regió n central de cada trabé cula integrando desde 0,39 μm −1 a cada lado del eje
meridional (paralelo a la fibra eje). La intensidad, el espaciado y el ancho axial del segundo or‐
den de la repetició n del sarcó mero se determinaron ajustando un pico gaussiano en la regió n
de 0,74 a 1,24 μm -1 . La dispersió n SL se estimó a partir del ancho axial de la reflexió n des‐
pué s de la deconvolució n del ancho axial del haz de rayos X en el detector.
Análisis de los patrones de rayos X de ángulo pequeño recopilados a una distancia de 3,2 m entre la
muestra y el detector. Para cada trabé cula, se agregaron, centraron y alinearon las series tem‐
porales de patrones 2D de cada contracció n utilizando las reflexiones ecuatoriales 1,0, luego
se reflejaron horizontal y verticalmente. La distribució n de intensidad ecuatorial se determinó
integrando 0,0045 nm −1 a cada lado del eje ecuatorial (perpendicular al eje trabecular), y las
intensidades y espaciamientos de las reflexiones 1,0 y 1,1 se determinaron ajustando dos picos
gaussianos. en la regió n de 0,019 a 0,064 nm −1 con la restricció n d 11 = d 10 /(3) 1/2. Se po‐
drían obtener datos ecuatoriales con una relació n señ al-ruido adecuada a partir de trabé culas
individuales. El aná lisis de las reflexiones de las líneas meridionales y de las capas requirió da‐
tos promediados de seis trabé culas y un suavizado 1:2:1 de los marcos de tiempo de 20 ms. La
distribució n de la intensidad difractada a lo largo del eje meridional del patró n de rayos X (pa‐
ralelo al eje de la fibra) se calculó integrando desde 0,009 nm −1 a cada lado del meridiano.
Las primeras líneas de miosina y primera capa de actina (ML1 y AL1) se integraron radial‐
mente en la regió n entre 0,063 y 0,036 nm −1desde el eje meridional. Los experimentos se
completaron en dos visitas al ESRF. Los datos de las dos visitas diferentes tenían valores de
energía ligeramente diferentes; por lo tanto, los patrones de difracción de rayos X 2D no se pudieron
agregar directamente, pero las distribuciones de intensidad de líneas meridionales y de capa
de las tres trabé culas adquiridas en cada visita se calcularon en funció n del espaciado recí‐
proco utilizando la calibració n SM3 que se describe a continuació n antes de agregar . Las dis‐
tribuciones de intensidad de fondo se ajustaron utilizando un algoritmo de casco convexo y se
restaron; el pequeñ o fondo residual se eliminó utilizando la distribució n de intensidad de una
regió n cercana del patró n que no contenía reflejos. Las intensidades integradas se obtuvieron
de las siguientes regiones axiales: M3, 0,066 a 0,072 nm −1; M6, 0,134 a 0,140 nm -1 ; ML1,
0,017 a 0,024 nm -1 . Los límites axiales para ML1 mostrados enFigura 2 miSe eligieron para
excluir la contribució n de la primera línea de la capa de actina. El ancho transmeridional de la
reflexió n M3 se determinó a partir de la distribució n radial de su intensidad en la regió n axial
definida anteriormente utilizando una funció n doble gaussiana centrada en el meridiano, con
el componente má s ancho considerado como fondo. Los componentes de interferencia de la
reflexió n M3 se determinaron ajustando mú ltiples picos gaussianos con el mismo ancho a la
distribució n de intensidad meridional. La intensidad total de la reflexió n ( IM3 ) se calculó como
la suma de los picos componentes y el espaciamiento de la reflexió n ( SM3) como el promedio
ponderado del espaciado axial de los picos de los componentes. La funció n de dispersió n de
puntos instrumental combinada fue insignificante en comparació n con el ancho radial de la re‐
flexió n M3. La intensidad meridional en la región de la reflexión M6 se equipó con uno o dos picos gaussianos
con el mismo ancho axial, y su espaciado ( SM6 ) se calculó como el promedio ponderado del
espaciado axial de los picos componentes. La fuerza, el estímulo, el cambio de longitud de la fi‐
bra y el tiempo de adquisició n de rayos X se recopilaron y analizaron utilizando un software
personalizado escrito en LabVIEW (National Instruments).
Para experimentos con trabé culas desmembranadas, se recopilaron datos a una distancia de
muestra a detector de 31 my 1,6 m utilizando el detector CCD FReLoN de alta resolució n espa‐
cial. Las distribuciones de intensidad ecuatorial podrían analizarse en trabé culas individuales,
mientras que para obtener suficiente S/N en reflexiones basadas en miosina, se agregaron da‐
tos de dos a cuatro trabé culas antes del aná lisis como se describió anteriormente.
Para un aná lisis má s completo de la línea de capa mixta reportada enFig. 3, el perfil axial de la
línea de capa observada se ajustó en la regió n axial de 0,01 a 0,045 nm −1 . Para comparar las
intensidades de reflexió n de las trabé culas intactas y desmembranadas, normalizamos I AL1 de
cada preparació n mediante I ML1en la misma preparació n en condiciones de pCa 7 diastó lica y
relajada, respectivamente, bajo el supuesto de que la estructura del filamento de miosina es la
misma en esos dos estados. Debido a que hay un AL1 significativo tanto en condiciones relaja‐
das como diastó licas, su intensidad en esas dos condiciones se restó de la de rigor y alrededor
de la fuerza má xima, respectivamente, para determinar la relació n fuerza má xima:rigor para el
componente de intensidad de AL1 asociado con fuerza má xima. motores de miosina adjuntos.
Existe cierta incertidumbre sobre la aplicació n de la relació n entre f A,PF e I AL1 en relació n con
el rigor en el modelo de Koubassova et al. (figura 6A en ref. 21 ) porque su valor de I AL1en au‐
sencia de motores fuertemente ligados es mucho menor que la observada en las trabé culas en
diá stole, y la relació n tiene una pendiente significativamente menor en el extremo inferior de I
AL1 . Dependiendo de la interpretació n del AL1 diastó lico, la estimació n resultante de f A en la
fuerza má xima es aproximadamente 0,10. Se agregaron datos para la diá stole de cuatro perío‐
dos de tiempo (a −21,5, 8,5, 548,5 y 578,5 ms del estímulo) y para la fuerza má xima de 108,5 a
168,5 ms del estímulo.
Calibració n de Periodicidades Espaciales. Se adquirieron patrones de difracció n de rayos X bidi‐

mensionales de trabé culas cardíacas desmembranadas de rata intactas, relajadas y en reposo,
y de fibras esquelé ticas desmembranadas relajadas del mú sculo psoas de conejo utilizando el
detector CCD FReLoN de alta resolució n espacial a distancias de muestra a detector de 1,6 m,
2,4 my 3,2 m. Las fibras del mú sculo psoas se prepararon como se describió anteriormente (
39 ) y se montaron en una solució n relajante que contenía dextrano T500 al 5% (peso/vol),
temperatura 27 °C. En cada distancia entre la muestra y el detector, los patrones 2D se centra‐
ron y alinearon utilizando las reflexiones ecuatoriales 1,0, y la distribució n de la intensidad di‐
fractada a lo largo del eje meridional del patró n de rayos X se calculó integrando desde 0,005
nm −1a ambos lados del meridiano. Los componentes de interferencia de la reflexió n M3 se de‐
terminaron ajustando mú ltiples picos gaussianos con el mismo ancho axial a la distribució n de
intensidad meridional. El espaciado de la reflexió n se calculó en píxeles desde el centro del pa‐
tró n ( S M3, píxel ) como el promedio ponderado por intensidad de los espaciados de los picos
componentes. La relació n entre SM3 , píxel y la distancia muestra-detector ( L ) para los tres va‐
lores de L se ajustó mediante regresió n lineal y el á ngulo de dispersió n θ se determinó a partir
del arcotangente de su pendiente. Luego se calculó la separació n de la reflexió n M3 en nanó ‐
metros como S M3= λ/(2sin(θ/2)), donde λ se estimó a partir de la energía del haz monocro‐
má tico calibrado con bordes Au L 3 y Pb L 3 . S M3 en trabé culas inactivas intactas fue de
14,479 ± 0,007 nm; norte =1; SL = 1,95 µm; en trabé culas desmembranadas relajadas 14,479 ±
0,011 nm; norte =2; SL = 2,14 ± 0,04 μm, y en fibras de mú sculo esquelé tico relajadas 14,461 ±

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21/9/23, 21:53 Regulación de la dinámica de contracción del músculo cardíaco basada en filamentos de miosina - PMC

Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle

Keywords: heart muscle, myosin motor, muscle regulation, myosin-binding protein C

Myosin-based mechanisms are increasingly recognized as supplementing their better-known

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