Machine Translated by Google

Chương 3

Biến thể thông lượng thấp và trung bình

Phương pháp phát hiện: Lịch sử
Luật xa gần
A. Sgourou1 , A. Papachatzopoulou2 , T. Katsila2 và GP Patrinos2
1 2
Đại học Mở Hellenic, Patras, Hy Lạp; Trường Khoa học Y tế Đại học Patras, Patras, Hy Lạp

3.1 GIỚI THIỆU
Chẩn đoán phân tử chủ yếu nhằm mục đích phát hiện các
biến thể gen, còn được gọi là đa hình nucleotide đơn
(SNP), có thể gây bệnh hoặc lành tính. Kể từ sự ra đời
của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (Mullis và Faloona,
1987) và Taq polymerase chịu nhiệt (1998; xem thêm Chương
1), một số phương pháp xét nghiệm di truyền dựa trên PCR
đã được mô tả. Ví dụ, những cách tiếp cận đó đều có hiệu
suất thấp, cho phép phát hiện một hoặc chỉ một vài biến
thể gen. Các phương pháp này có thể được tóm tắt thành
hai loại chính: phương pháp sàng lọc di truyền, được
thiết kế đặc biệt để phát hiện (các) biến thể gen cụ thể
và phương pháp quét di truyền, nhằm phát hiện mọi biến
thể gen trong đoạn khuếch đại PCR đang được nghiên cứu.
Chương này nhằm mục đích cung cấp cái nhìn tổng quan về
các phương pháp xét nghiệm di truyền hiệu suất thấp được
sử dụng phổ biến nhất, làm cơ sở cho sự phát triển các
phương pháp tiếp cận hiệu suất trung bình và cao được sử
dụng ngày nay trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán phân
tử hiện đại.
3.2 PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC GEN
Như đã mô tả trong Chương 1, phương pháp đầu tiên được sử
dụng để chẩn đoán bệnh di truyền ở cấp độ phân tử là PCR
kết hợp với phân tích đa hình thái chiều dài đoạn giới
hạn (RFLP) để phát hiện biến thể dẫn đến bệnh hồng cầu
hình liềm. Kể từ đó, đã có một số phương pháp khác phụ
thuộc vào phương pháp khuếch đại DNA dựa trên PCR đặc
hiệu của alen để sàng lọc các biến thể gen đã biết. Các
phương pháp phát hiện đặc hiệu alen đã được
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán phân
tử kể từ lần phát triển đầu tiên vào cuối những năm 1980,
không chỉ vì chúng có thể dễ dàng áp dụng để phân tích
hầu như bất kỳ biến thể nào đã biết mà còn vì các phương
pháp này không yêu cầu thiết bị đắt tiền và phức tạp.
Những phương pháp tiếp cận này, vốn đã tạo thành nền tảng
cho một số phòng thí nghiệm nghiên cứu và chẩn đoán trước
đây, là hệ thống đột biến khuếch đại chịu lửa (ARMS), đầu
dò oligonucleotide đặc hiệu với alen (ASO) và xét nghiệm
thắt oligonu cleotide (OLA). Ngoài ra còn có các phương
pháp sàng lọc di truyền khác, chẳng hạn như mồi oligo
cạnh tranh, phân tách bằng hóa học và enzym, v.v., ít
được sử dụng thường xuyên hơn để chẩn đoán phân tử và do
đó sẽ không được mô tả ở đây.
3.2.1 Hệ thống đột biến vật liệu chịu lửa
khuếch đại
ARMS hoạt động dựa trên nguyên tắc rằng sự không khớp
giữa 30 nucleotide của mồi PCR và khuôn sẽ ngăn cản sự
mở rộng mồi của Taq polymerase. Năm 1989, một số nhóm độc
lập đã mô tả phương pháp này để phân tích các đột biến
điểm đã biết trong DNA và phân biệt giữa các kiểu gen
đột biến gen bình thường, dị hợp tử và đồng hợp tử
( Newton và cộng sự, 1989; Nichols và cộng sự, 1989;
OKama và cộng sự, 1989). ; Sommer và cộng sự, 1989; Wu và
cộng sự, 1989). Sự khuếch đại của alen bình thường chứ
không phải của alen đột biến được thực hiện bằng cách sử
dụng mồi bổ sung cho alen bình thường và có sự không khớp
giữa gốc 30 và alen đột biến. Ngược lại, chỉ đột biến mới
được khuếch đại nếu dư lượng 30 của

Chẩn đoán phân tử. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-802971-8.00003-1 Bản

23
quyền © 2017 Elsevier Ltd. Mọi quyền được bảo lưu.
Machine Translated by Google

24 Chẩn đoán phân tử

mồi bổ sung cho alen đột biến chứ không phải alen bình
thường. Khái niệm cơ bản và ứng dụng biểu thị được minh
họa lần lượt ở Hình 3.1A và B.
Việc thiết kế và tối ưu hóa các công cụ PCReARMS dựa
vào trình tự mục tiêu và sự khác biệt về nucleotide xác
định các alen. Ngoài sự không khớp giữa gốc đầu cuối thứ
30 của mồi và mục tiêu, sự không khớp đơn lẻ phải được
kết hợp ở một số vị trí từ đầu cuối thứ 30 . Việc thiết
kế và tối ưu hóa
Các mồi PCReARMS tuân theo các cân nhắc tương tự được sử
dụng cho bất kỳ loại PCR nào khác, cụ thể là: (1) các mồi
được chọn để có nhiệt độ nóng chảy lý thuyết tương đương
(Tm), (2) độ dài mồi thường là 20 nucleotide hoặc dài
hơn, mặc dù độ dài ít quan trọng hơn hơn Tm, và (3) mồi
không được có trình tự tự bổ sung gồm 4 nucleotide trở
lên và chúng cũng không được có nhiều hơn 4 nucleotide bổ
sung giữa 30 đầu của chúng. Giống như bất kỳ chiến lược
PCR thông thường nào, tránh sai sót

HÌNH 3.1 (A) Phát hiện PCReARMS của một đột biến DHCR7. Sơ đồ biểu diễn ranh giới giữa trình tự can thiệp 8 và exon 9 của gen DHCR7 cho thấy vị
trí của một đột biến phổ biến gây ra hội chứng Smith-Lemli-Opitz. Đột biến làm thay đổi trình tự chấp nhận mối nối chính tắc (AG > AA) và có thể
được phát hiện bằng cách sử dụng đoạn mồi ARMS dành riêng cho alen đột biến. Phân tích các sản phẩm PCReARMS bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide không biến tính, được hiển thị bằng nhuộm ethidium bromide và huỳnh quang UV, cho thấy một đoạn 190 bp đặc trưng cho alen biến thể
IVS 8-1 G > C. Đoạn 429-bp tương ứng với một vùng của gen HFE đóng vai trò kiểm soát nội bộ dương tính đối với quá trình khuếch đại PCR. Làn 1:
điều khiển bình thường; làn 2e4: dị hợp tử IVS 8-1 G > C. (B) Kiểu gen của đột biến HFE p.C282Y sử dụng PCReARMS.
Sơ đồ biểu diễn một phần gen HFE cho thấy đột biến phổ biến nhất liên quan đến bệnh nhiễm sắc tố sắt mô di truyền (p.C282Y). Phân tích ghép kênh
chứa các đoạn mồi cho hai xét nghiệm PCReARMS khác nhau, thực hiện các chuỗi đối diện nhau. Một xét nghiệm PCReARMS đặc hiệu cho alen đột biến,
trong khi xét nghiệm còn lại đặc hiệu cho alen bình thường. Sản phẩm PCR của các alen đột biến và alen bình thường có độ dài khác nhau và có thể
dễ dàng phân biệt bằng điện di trên gel. Làn 1, 3: mẫu bình thường; làn 2, 4: dị hợp tử p.C282Y; ngõ 5: p.C282Y đồng hợp tử. (C) Chuyển tiếp
PCReASO của đột biến gen HBB. Phân tích PCReASO về biến thể HBB phổ biến nhất trong quần thể người Hy Lạp (IVS I-110 G > A), dẫn đến bệnh b-
thalassemia. N/N: mẫu bình thường đồng hợp tử; N/M: mẫu đột biến dị hợp tử; M/M: mẫu đột biến đồng hợp tử; Trường hợp A: mẫu bình thường đồng hợp
tử; Trường hợp B: mẫu đột biến dị hợp tử.
Machine Translated by Google
Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 25
kết quả tiêu cực có thể được khắc phục bằng cách kết hợp một
nucleotide thoái hóa vào mồi hoặc bằng cách nhắm mục tiêu vào
chuỗi đối diện để khuếch đại.
Nếu cần phát hiện một số biến thể trình tự trong giao
thức phát hiện ARMS ghép kênh, trước tiên người ta cần tối ưu
hóa các điều kiện PCR để phát hiện độ nhạy và đặc hiệu của
từng alen, cụ thể là điều chỉnh các tham số chu trình PCR và
nồng độ MgCl2 . Sau đó, khi các tham số đó được đặt cho từng
alen, các cặp mồi có thể được kết hợp để đánh giá hiệu suất
của xét nghiệm ARMS ghép kênh. Sau khi khuếch đại DNA, hệ
thống điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide có thể
được sử dụng để phân biệt loại hoang dã với biến thể khuếch
đại, có kích thước khác nhau để có thể phân biệt rõ ràng
trong quá trình điện di. Tính đặc hiệu của PCReARMS là có thể
phân tích một số lượng lớn mẫu nếu cần trong nhóm, vì phương
pháp này có khả năng phát hiện một mẫu dương tính duy nhất
trong nhóm gồm 30 mẫu trở lên ( Nowaczyk et al., 2001; Waye
et al. , 2002).
Các xét nghiệm PCReARMS có thể được phát triển, xác nhận,
triển khai và ghép kênh khá dễ dàng, điều này tạo nên ưu
điểm chính của phương pháp này, trong khi chúng không yêu cầu
các hệ thống phát hiện phức tạp và đắt tiền (Liu và cộng sự,
2016; Medicare và cộng sự, 2016 ) . Ngược lại, cũng như các
phương pháp sàng lọc biến thể khác, PCReARMS chỉ có thể được
sử dụng để phát hiện các biến thể gen đã biết.
3.2.2 Lai Oligonucleotide đặc
hiệu cho alen
Việc phân tích các biến thể nucleotide đơn trong DNA bằng
phương pháp lai với đầu dò ASO dựa trên nguyên tắc rằng ngay
cả sự không khớp nucleotide đơn lẻ giữa đầu dò và mục tiêu
của nó cũng có thể làm mất ổn định con lai. Các đầu dò ASO có
thể được thiết kế để bổ sung và đặc hiệu cho các alen khác
nhau, do đó cung cấp một phương pháp đơn giản để phát hiện
bất kỳ đột biến hoặc SNP nào đã biết.
Việc sử dụng đầu dò ASO thực sự có trước PCR và là phương
pháp thường được sử dụng để phân tích DNA nhân bản, sử dụng
đầu dò ASO được đánh dấu phóng xạ để lai trên DNA bộ gen đã
được cố định trên màng sau khi hạn chế tiêu hóa và điện di
endnuclease (Conner và cộng sự, 1983 ; Orkin và cộng sự,
1983; Pirastu và cộng sự, 1983). Với sự ra đời của kỹ thuật
khuếch đại PCR (Saiki và cộng sự, 1985, 1988a,b), PCReASO đã
trở thành một trong những phương pháp được lựa chọn để phân
tích các đột biến điểm đã biết trong các đoạn DNA được khuếch
đại (Saiki và cộng sự, 1986).
Các mẫu dò ASO thường là các oligonucleotide ngắn (15e17
mers) có hàm lượng GC thấp (hoặc hàm lượng guanine-cytosine)
(thường là 30e50%), được thiết kế sao cho nucleotide phân
biệt nằm ở đâu đó ở giữa mẫu dò. Việc lựa chọn đúng đầu dò
ASO đòi hỏi phải đầu tư thời gian đáng kể và thử nghiệm một
số
các đầu dò ứng cử viên phải được đánh giá riêng lẻ bằng cách
sử dụng cả mẫu đối chứng dương tính và âm tính, tất cả đều
trong điều kiện nghiêm ngặt về rửa và lai cố định. Ngoài ra,
cần thận trọng để tránh các trình tự đa hình, có thể dẫn đến
kết quả âm tính giả nếu tính đa hình làm suy yếu quá trình ủ
và/hoặc làm mất ổn định lai ASO/mục tiêu.
Có hai biến thể khác nhau của chủ đề PCRe ASO: định dạng ASO chuyển
tiếp và định dạng ASO ngược.
Ở định dạng ASO chuyển tiếp, các đoạn DNA được khuếch đại
PCR được cố định trên bộ lọc hoặc màng và các đầu dò
oligonucleotide được đánh dấu bổ sung và đặc hiệu cho trình
tự DNA nhất định sẽ được lai với bộ lọc. Sau đó, bộ lọc được
rửa ở mức độ nghiêm ngặt thích hợp để phân tách mọi phân tử
thăm dò và tiếp xúc.
Các giao thức PCReASO đầu tiên sử dụng đầu dò oligonu
cleotide được dán nhãn phóng xạ với [g 32P] và phơi nhiễm
phim tia X để phát hiện các giống lai mục tiêu thăm dò gắn
màng (Saiki và cộng sự, 1986). Các giao thức thay thế sử dụng
đầu dò ASO đánh dấu biotin và phát hiện lai mục tiêu thăm dò
bằng cách sử dụng streptavidin kết hợp với peroxidase cải
ngựa (Saiki và cộng sự, 1988b), có thể được phát hiện bằng
cách sử dụng phát hiện so màu với tetramethylbenzidine và
hydro peroxide hoặc chất nền phát quang hóa. Định dạng ASO
chuyển tiếp đặc biệt hữu ích khi cần phân tích số lượng lớn
mẫu cho một số lượng nhỏ các alen biến thể (Hình 3.1C). Đối
với số lượng lớn các alen đang được thử nghiệm, định dạng ASO
chuyển tiếp sẽ phức tạp hơn, đòi hỏi các đầu dò được dán nhãn
riêng biệt và các chu trình lai cho từng alen được thử nghiệm.
Vì lý do này, định dạng ASO ngược được hình thành để khắc
phục vấn đề này. Trong ASO ngược, các đầu dò ASO khác nhau
được cố định trên bộ lọc và/hoặc màng và xảy ra quá trình lai
giữa bộ lọc với DNA khuếch đại PCR được đánh dấu. Định dạng
ASO đảo ngược ban đầu (còn được gọi là Reverse dot blot) sử
dụng các đầu dò có đuôi poly(dT) được thêm vào 30 đầu cuối
của chúng và được cố định trên màng nylon bằng liên kết ngang
UV (Saiki và cộng sự, 1989).
Phương pháp này sau đó đã được cải tiến nhờ liên kết cộng hóa
trị của đầu dò ASO với màng thông qua 50 trình tự liên kết
amino (Zhang và cộng sự, 1991; Chehab và Wall, 1992). Định
dạng ASO ngược đã trở thành một công cụ được sử dụng rộng rãi
để sàng lọc thường xuyên các gen có nhiều alen đột biến (được
đánh giá trong Gold, 2003), và một số bộ xét nghiệm dot-blot
ngược đã được cung cấp để sàng lọc đột biến đối với một số
bệnh di truyền, bao gồm α-thalassemia (Chan và cộng sự, 1999;
Foglietta và cộng sự, 2003), b-thalassemia (Chehab, 1993; Cai
và cộng sự, 1994), và bệnh xơ nang (Chehab và Wall, 1992;
Makowski và cộng sự. , 2003). Ngoài ra, một số bộ dụng cụ
thương mại đã được phát triển để phát hiện đột biến a- và b-
thalassemia (được xem xét trong Patrinos và cộng sự, 2005).
Phương pháp PCReASO, đặc biệt là định dạng ngược, cung
cấp một cách tiếp cận thuận tiện để sàng lọc đồng thời số
lượng lớn các biến thể gen, có thể được thực hiện
Machine Translated by Google
26 Chẩn đoán phân tử
áp dụng cho bất kỳ biến thể trình tự nào đã biết và không
yêu cầu bất kỳ thiết bị đo phức tạp nào để phát hiện biến
thể. Ngược lại, khối lượng công việc cần thiết để chuẩn hóa
điều kiện lai và rửa nghiêm ngặt để lai đồng thời một số đầu
dò oligo nucleotide là một hạn chế đáng kể, đặc biệt đối với
các phòng thí nghiệm nhỏ với nguồn lực hạn chế, đòi hỏi đầu
tư ban đầu đáng kể.
3.2.3 Xét nghiệm thắt oligonucleotide
Nguyên lý của OLA nằm ở khả năng các dây chằng DNA liên kết
các oligonucleotide ngắn theo kiểu cộng hóa trị với nhau,
điều này gián tiếp phản ánh kiểu gen của DNA mục tiêu. Sự kết
hợp của hai đầu dò oligonucleotide bằng DNA ligase phụ thuộc
vào ba điều kiện khác nhau: (1) sự lai của các đầu dò với
DNA đích, (2) các đầu dò phải nằm liền kề nhau theo hướng 50
đến 30 và (3 ) các mẫu dò phải có sự bổ sung cặp bazơ hoàn
hảo với DNA mục tiêu tại vị trí nối của chúng. Nếu cả ba điều
kiện đều được đáp ứng thì các biến thể trình tự có thể được
phân biệt một cách đáng tin cậy, chính xác và có thể tái tạo
bằng cách sử dụng OLA. Phản ứng có thể được theo dõi bằng
cách đưa vào một chức năng có thể phát hiện được ở một trong
hai đầu dò trong phản ứng thắt. Một số kỹ thuật phân tích
khác nhau đang được sử dụng, khác nhau về phương pháp phát
hiện và nhu cầu thiết bị đo đạc.
Năm 1988, phản ứng enzyme này đã được áp dụng để nối các
đầu dò DNA chuỗi đơn ngắn như một phương tiện để phát hiện
các biến thể trình tự (Alves và Carr, 1988; Landegren et
al., 1988). Đây là sự khởi đầu cho sự phát triển của một số
phương pháp phân tích sử dụng các dây chằng DNA, ví dụ, phản
ứng chuỗi OLA và ligase. Khi các dây chằng DNA ổn định nhiệt
được thương mại hóa vào năm 1990, chúng đã tạo điều kiện cho
chu kỳ nhiệt độ của phản ứng nối. OLA đã được cách mạng hóa
vào năm 1990 khi PCR được kết hợp với xét nghiệm trước phản
ứng thắt (Nickerson và cộng sự, 1990), và ngày nay phương
pháp này được sử dụng trong nhiều phòng thí nghiệm nghiên
cứu và lâm sàng trên toàn thế giới để phát hiện nhiều loại
đột biến liên quan đến y tế .
Trong hầu hết các ứng dụng, đoạn gen liên quan trước tiên
được khuếch đại trong PCR, mặc dù trong một số ứng dụng, DNA
bộ gen đã trực tiếp chịu phản ứng thắt.
DNA mẫu của OLA bị biến tính để tạo thành DNA mục tiêu chuỗi
đơn. Cần có hai đầu dò oligonucleotide liền kề (khoảng 20
mers) và enzyme DNA ligase cho mỗi phản ứng thắt. Các
oligonucleotide của OLA được thiết kế để đặt cạnh nhau tại
vị trí đột biến đã được xác định trước đó trên khuôn mẫu.
Các đầu dò được lai với DNA mục tiêu theo hướng từ đầu đến
đuôi (50 đến 30). Nếu các đầu dò và DNA mục tiêu bổ sung hoàn
hảo cho nhau thì enzyme DNA ligase sẽ hình thành liên kết
phosphodiester giữa các đầu dò. Nếu thậm chí chỉ có một cặp
bazơ
(bp) không khớp ở hai bên hoặc gần với khe giữa các đầu dò,
hiệu quả của enzyme giảm đáng kể và việc thắt bị ngăn chặn;
do đó nó có thể được phân biệt với một sự kết hợp hoàn hảo
(Wu và Wallace, 1989; Pritchard và Southern, 1997). Đối với
các biến thể trình tự song song, ba đầu dò oligonucleotide
tổng hợp được sử dụng: cần một đầu dò đặc hiệu alen để phát
hiện từng alen và đầu dò chung thứ ba sau đó lai với trình
tự DNA mục tiêu ngay cạnh các đầu dò đặc hiệu alen và hoàn
toàn bổ sung cho mục tiêu allelic. Nếu sử dụng DNA ligase
bền nhiệt trong phản ứng thì các bước biến tính và thắt có
thể được thực hiện theo chu kỳ để đạt được mức khuếch đại
tuyến tính của đầu dò được nối, do đó nâng cao độ nhạy của
xét nghiệm.
Có một số phương pháp phát hiện và việc lựa chọn giữa
chúng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn như thiết bị có
sẵn trong phòng thí nghiệm, số lượng mẫu cần phân tích và số
lượng biến thể di truyền cần phân tích trên mỗi mẫu, cũng
như chi phí và nhu cầu về tốc độ, sự đơn giản và mạnh mẽ. Có
các thử nghiệm dựa trên việc bắt giữ pha rắn của các đầu dò
được gắn dây, trong đó một trong các đầu dò oligonucleotide
được sử dụng cho phản ứng thắt có thể được gắn trực tiếp vào
chất mang pha rắn, ví dụ, hạt thuận từ hoặc chip cảm biến
sinh học (Martinelli et al. , 1996; Zhong và cộng sự, 2003).
Tuy nhiên, một cách tiếp cận phổ biến hơn là thu giữ đầu dò
ở pha rắn bằng phương pháp lai hoặc tương tác
streptavidinebiotin (Nickerson và cộng sự, 1990; Iannone và
cộng sự, 2000). Có một số phương pháp phát hiện sử dụng đĩa
vi thể 96 hoặc 386 giếng. Việc phát hiện trên các tấm vi thể
có thể được thực hiện bằng phương pháp đo màu, sử dụng
phương pháp phát hiện dựa trên xét nghiệm hấp thụ miễn dịch
liên kết với enzyme đo màu (Nickerson và cộng sự, 1990), bằng
phương pháp đo độ phát quang hóa học (Tannous và cộng sự,
2003), hoặc sử dụng phương pháp đo huỳnh quang phân giải theo
thời gian (Hansen và cộng sự ., 1995). Có các phương pháp
phát hiện khác ít được sử dụng hơn, chẳng hạn như phát hiện
huỳnh quang trên kính hiển vi (Iannone và cộng sự, 2000) và
mảng cảm biến không sinh học phát hiện đo màu, nâng hiệu suất
của xét nghiệm lên mức cao hơn nữa (Zhong và cộng sự, 2003).
Ngoài ra còn có các xét nghiệm điện di, dựa trên thực tế là kích thước đầu dò
Như vậy, các sản phẩm nối được phân giải với nhau và với các
đầu dò không được nối trong điều kiện biến tính trên gel
polyacrylamide có độ phân giải cao hoặc điện di mao mạch
bằng khả năng di động điện di độc đáo của chúng. Phương pháp
phát hiện có thể là chụp X quang tự động hoặc phát quang
huỳnh quang, tùy thuộc vào nhãn được sử dụng trong các đầu
dò thông thường (Day et al., 1995a; Grossman et al., 1994).
Ngày nay, một số ứng dụng của OLA để phát hiện các khiếm
khuyết phân tử gây bệnh ở người vẫn được sử dụng trong các
phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử trên quy mô toàn cầu.
Báo cáo đầu tiên mô tả OLA như một phương pháp chẩn đoán phân
tử là để chẩn đoán bệnh hồng cầu hình liềm (MIM 603903;
Landegren et al., 1988). Kể từ đó OLA đã được sử dụng để sàng
lọc trước sinh bệnh này (Day et al.,
Machine Translated by Google
Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 27
2002). Ngoài ra, OLA đã được sử dụng để phát hiện nhiều loại
đột biến liên quan đến y tế gây ra các bệnh di truyền hoặc đột
biến góp phần gây ra một căn bệnh thông thường, chẳng hạn như
bệnh xơ nang, bệnh nhiễm sắc tố sắt mô di truyền và các biến
thể xảy ra ở các quần thể biệt lập, chẳng hạn như Di sản Bệnh
tật Phần Lan. Mặc dù hầu hết các ứng dụng OLA đều được phát
triển và xác nhận nội bộ, một số bộ công cụ xác định kiểu gen
thương mại vẫn có sẵn để chẩn đoán các rối loạn di truyền,
chẳng hạn như bộ dụng cụ phát hiện các biến thể di truyền phổ
biến của các yếu tố đông máu II (protrombin) và V, cũng như
methylene. tetrahydrofolate reductase, khiến một cá nhân dễ
mắc bệnh huyết khối. Ngay cả những bộ dụng cụ thương mại này
cũng phải được xác nhận để sử dụng lâm sàng trong mỗi phòng thí nghiệm.
Một trong những ưu điểm chính của PCReOLA là nó phân biệt
đáng tin cậy các trường hợp đột biến dị hợp tử và đồng hợp tử
với các cá thể đồng hợp tử bình thường. Ngoài ra, việc sử dụng
DNA ligase bền nhiệt giúp cải thiện tính đặc hiệu của phản
ứng vì quá trình thắt có thể được thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn, do đó làm tăng khả năng ủ chuỗi (Barany, 1991). Vì xét
nghiệm có thể được thực hiện trong phạm vi rộng về nhiệt độ
buộc, nồng độ muối và nồng độ DNA ligase mà không làm mất độ
nhạy (Hansen và cộng sự, 1995), điều này giúp loại bỏ nguy cơ
phản ứng âm tính giả hoặc dương tính giả do trước những biến
động của các yếu tố này. Ngoài ra, có một số phương tiện để
phát hiện các sản phẩm nối, chẳng hạn như đo màu, đo độ sáng
hóa học và đo huỳnh quang phân giải theo thời gian, có thể
được thực hiện ở dạng vi đĩa bằng cách cố định trực tiếp một
trong các đầu dò hoặc bằng tương tác biotinestreptavidin vào
giếng, một hạt, hoặc một pin. Hơn nữa, PCReOLA có thể được
ghép kênh để phát hiện một số alen hoặc locus trong cùng một
phản ứng. Tuy nhiên, cũng có một số hạn chế, chẳng hạn như
thiếu khả năng tái tạo do tạo ra các sản phẩm khuếch đại giả
trong bước PCR (Fox và cộng sự, 2007).
3.3 PHƯƠNG PHÁP QUÉT GEN
Ngược lại với các phương pháp sàng lọc di truyền được mô tả
trước đó chỉ có thể phát hiện các biến thể đã biết mà chúng
được thiết kế, người ta phải đảm bảo rằng đoạn khuếch đại PCR
đang được nghiên cứu được nghiên cứu kỹ lưỡng về sự tồn tại
của bất kỳ biến thể có thể nào, cả đã biết cũng như chưa
biết. . Do đó, nên sử dụng các phương pháp xác định kiểu gen
khác, còn được gọi là phương pháp quét di truyền, để có thể
phát hiện sự tồn tại của bất kỳ biến thể nào có thể có trong
đoạn được đề cập. Các phương pháp quét di truyền phổ biến nhất
đã tạo thành nền tảng của bất kỳ phòng thí nghiệm chẩn đoán
phân tử nào trong thập kỷ qua là đa hình cấu trúc chuỗi đơn
(SSCP), ysis hậu môn dị thể (HDA), và điện di trên gel biến
tính và độ dốc nhiệt độ (DGGE và TGGE). , tương ứng). Trong
các đoạn văn sau, chúng tôi sẽ tóm tắt các phương pháp được
đề cập trước đó, hãy nhớ rằng những kỹ thuật đó
được thiết kế để quét bất kỳ đoạn khuếch đại PCR nào để tìm
các biến thể điểm đơn và các đoạn indel nhỏ. Có các phương
pháp khác được thiết kế để sàng lọc các phần xóa, chèn và sắp
xếp lại tổng thể lớn hơn, chẳng hạn như khuếch đại đầu dò phụ
thuộc vào hệ thống ghép kênh, nằm ngoài phạm vi của chương này.
3.3.1 Phân tích đa hình dạng sợi
đơn
SSCP có lẽ là phương pháp quét di truyền dựa trên điện di phổ
biến nhất. Cùng với việc khuếch đại DNA của trình tự cần phân
tích, những kỹ thuật này đã trở thành phương pháp được lựa
chọn cho một số phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử. Điều này
có thể được giải thích chủ yếu bằng nhiều ưu điểm, cụ thể là
tính đơn giản về mặt kỹ thuật và độ đặc hiệu tương đối cao
trong việc phát hiện các biến thể trình tự, chi phí vận hành
thấp và tiềm năng tự động hóa để phân tích đột biến thông
lượng cao. Nếu các mồi được dán nhãn huỳnh quang được sử dụng
trong quá trình khuếch đại DNA, phân tích SSCP có thể được
thực hiện trong các trình tự động hóa dựa trên điện di dựa
trên gel hoặc mao mạch, do đó cho phép phân tích chính xác,
có thể tái tạo và thông lượng cao về biến thể gen.
Việc phân tích SSCP đã được Orita et al. (1989) là một
phương pháp đơn giản, hiệu quả và đáng tin cậy để phát hiện
sự thay đổi trình tự trong locus gen. Dựa trên PCR, SSCP được
phát triển ngay sau khi giới thiệu công nghệ PCR và dựa trên
thực tế là các đoạn DNA chuỗi đơn tương đối ngắn có thể di
chuyển trong gel không biến tính không chỉ phụ thuộc vào kích
thước mà còn phụ thuộc vào trình tự của chúng. Nói cách khác,
sau khi khuếch đại bất kỳ trình tự DNA nhất định nào, các đoạn
DNA được khuếch đại sẽ bị biến tính bằng nhiệt hoặc tác nhân
hóa học, chẳng hạn như formamide. Sau đó, các đoạn DNA bị biến
tính được điện di thông qua gel polyacrylamide tự nhiên (không
biến tính). Trong quá trình điện di, các đoạn DNA sợi đơn có
hình dạng ba chiều cụ thể theo trình tự nucleotide của chúng
và do đó thể hiện một cấu hình duy nhất.
Do đó, khả năng di chuyển điện di của chúng phụ thuộc vào hình
dạng ba chiều đã đề cập trước đó. Dựa trên những nguyên tắc
này, người ta hiểu rõ rằng ngay cả một sự khác biệt cơ bản
duy nhất giữa đoạn DNA đang được thử nghiệm và đoạn DNA kiểu
hoang dã của nó cũng đủ để chấp nhận một hình dạng khác và do
đó di chuyển ở một vị trí khác trong quá trình điện di (Hình
3.2A) .
SSCP huỳnh quang (F-SSCP) là một biến thể của chủ đề phương
pháp SSCP tiêu chuẩn. F-SSCP là phương pháp PCReSSCP có độ
phân giải cao, không phóng xạ, trong đó các sản phẩm PCR có
nhãn huỳnh quang được điện di và phát hiện bằng máy giải trình
tự DNA tự động (Makino et al., 1992).
Kết hợp phân tích SSCP với DNA tự động
Machine Translated by Google

28 Chẩn đoán phân tử

HÌNH 3.2 (A) Sơ đồ vẽ một kết quả điển hình từ phân tích đa hình dạng chuỗi đơn (SSCP). Sau khi nhuộm, gel có thể được chia thành hai phần: phần
có các dải tương ứng với các alen sợi đơn (SS) và phần có các dải sợi đôi (DS), vì đôi khi không thể biến tính hoàn toàn. Trong ví dụ này, làn 1
tương ứng với mẫu kiểu hoang dã cho bất kỳ vị trí cụ thể nào được phân tích. Nếu làn 2 tương ứng với trường hợp đồng hợp tử về đột biến A, thì
làn 3 tương ứng với trường hợp dị hợp tử về cùng một đột biến, và làn 4 và 5 tương ứng với trường hợp đồng hợp tử về đột biến B và trường hợp dị
hợp tử phức hợp cho đột biến A và B, tương ứng. . Làn 6e8 là ví dụ đặc trưng của kiểu điện di của những phần mất hoặc thêm vào nhỏ, cũng có thể
được phân biệt ở phần DS của gel (xem thêm Hình 5.5b). Làn 6, 7: các trường hợp dị hợp tử và đồng hợp tử tương ứng với một lần xóa nhỏ; Ngõ 8:
trường hợp dị hợp tử để chèn nhỏ. (B) Phân tích vùng mã hóa của locus G6PD ở người (Phỏng theo Menounos, P., Zervas, C., Garinis, G., Doukas, C.,
Kolokithopoulos, D., Tegos, C., Patrinos, GP, 2000. Tính không đồng nhất về phân tử của tình trạng thiếu hụt glucose-6-phosphate dehydrogenase
trong quần thể người Hy Lạp. Hum. Hered. 50, 237e241.). Làn 1, 2: Exon 8 (làn 1: cá thể bình thường; làn 2: trường hợp dị hợp tử); Làn 3e7: Exon
11 (làn 5, 6: kiểu hoang dã; làn 4, 7: trường hợp dị hợp tử về các đột biến khác nhau; làn 3: trường hợp dị hợp tử có hai đột biến điểm ở cis,
một trong số đó giống như ở làn 4 [lưu ý sự khác biệt nhỏ về khả năng di chuyển của các dải đối với các alen SS giữa làn 3 và 4]). (C) Nguyên tắc
phân tích song công (HDA). Không giống như phân tích SSCP, DNA khuếch đại hiện nay bị biến tính, sau đó là sự ủ lại chậm của các alen bị biến
tính, dẫn đến cả hai thể đồng nhất (HmD) và dị thể (HtD). Loại thứ hai di chuyển chậm hơn trong quá trình điện di trên gel, do (các) trình tự
không khớp của chúng, và do đó các trường hợp dị hợp tử (Het) và đồng hợp tử (Hom) có thể dễ dàng phân biệt với loại hoang dã (Wt) dựa trên kiểu
điện di của chúng. M: điểm đánh dấu kích thước. (D) Sàng lọc đột biến ở exon 10 của gen CFTR để tìm đột biến p.F508del, dẫn đến xơ nang, sử dụng
HDA. Điện di được thực hiện trên gel acrylamide 8% không biến tính. Sản phẩm khuếch đại của alen kiểu hoang dã là 97 bp và của alen đột biến là
94 bp. Làn 3e6 tương ứng với các dị hợp tử p.F508del, làn 1 tương ứng với một đồng hợp tử p.F508del và làn 2 tương ứng với một cá thể kiểu hoang
dã. Khả năng di chuyển điện di của các dị thể bị chậm lại so với các dị thể. M: Điểm đánh dấu kích thước 4X174/HaeIII. Hình ảnh do Tiến sĩ
Angeliki Balasopoulou cung cấp, Athens, Hy Lạp.

trình sắp xếp chuỗi cho phép phát hiện các mảnh có độ DNA tiêu chuẩn được đánh dấu bằng thuốc nhuộm khác với
nhạy cao và cho phép kiểm soát chặt chẽ mọi nhiệt độ mong thuốc nhuộm của DNA mẫu cho phép xác định độ linh động
muốn, một yêu cầu cơ bản của phân tích SSCP để thu được của đoạn DNA mẫu tương đối bằng cách sử dụng độ linh động
kết quả có thể lặp lại. Điện di có kích thước bên trong của DNA chuẩn nội làm tham chiếu.
Machine Translated by Google

Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 29

Có một số thông số ảnh hưởng đến phân tích SSCP và cuối Nhìn chung, hầu hết các đoạn DNA mạch đơn sẽ có cấu
cùng sẽ ảnh hưởng đến quá trình di chuyển điện di: trúc chặt chẽ hơn ở nhiệt độ thấp hơn hoặc khi có nồng độ
muối cao hơn. Tuy nhiên, bằng cách tăng nồng độ muối, độ
dẫn điện cũng tăng lên, do đó có ảnh hưởng khá đáng kể đến
1. Khuếch đại DNA (chẳng hạn như kích thước của sản phẩm
nhiệt độ. Do đó, người ta đề xuất rằng điện di được thực
PCR) với kích thước đoạn PCR khoảng 550 bp (Hayashi,
hiện ngay từ đầu ở nhiệt độ phòng với 5-10% glycerol hoặc
1991; Hayashi và Yandell, 1993).
ở 4C mà không cần thêm glycerol hoặc muối. Hayashi và
2. Biến tính: Trong phân tích SSCP, điều quan trọng là
Yandell (1993) đã chỉ ra rằng trong hầu hết các đoạn ngắn
phải đạt được sự biến tính hoàn toàn và không thể đảo
hơn 200 nu cleotide, hơn 90% các biến thể trình tự sẽ được
ngược của các chuỗi DNA càng tốt. Thông thường, quá
phát hiện và khi kích thước của đoạn PCR tăng dần lên
trình biến tính các sản phẩm PCR được thực hiện ở 95C
300e350 nucleotide, số lượng biến thể có thể được phát
trong 5-7 phút, sau đó là bước ủ ở 4C trong khoảng 10
hiện một cách an toàn giảm xuống còn hơn 80%.
phút. Ngoài ra, có rất nhiều chất biến tính, chẳng hạn
như formamide, metyl-thủy ngân hydroxit, natri hydroxit
và urê, dường như hoạt động tốt (Humphries et al.,
Các quan sát thực tế cho thấy rằng bất kỳ mảnh nào thể
1997).
hiện tính di động vi sai thường sẽ di chuyển rất gần với
3. Các điều kiện điện di, cụ thể là thời gian và thời
mảnh tham chiếu. Tuy nhiên, số lượng mảnh tổng thể không
gian chạy gel, cường độ ion trong dung dịch đệm được
phải lúc nào cũng có thể dự đoán trước được. Bất kỳ số
sử dụng, nhiệt độ và thành phần nền gel. Cần lưu ý rằng
lượng sự phù hợp nào cũng có thể được hỗ trợ ở một mức độ
không có lý thuyết đầy đủ cũng như không có mô hình
khác nhau bằng các thông số điện di được áp dụng. Hơn
hóa lý nào có thể cho phép người ta dự đoán cấu trúc
nữa, cường độ dải không liên quan đến sự khác biệt về
ba chiều của bất kỳ đoạn DNA chuỗi đơn nào và do đó,
alen, vì nó phụ thuộc chặt chẽ vào các hình dạng khác nhau.
khả năng di chuyển điện tích của nó. Ngoài kích thước
Do đó SSCP không phải là phương pháp an toàn để dự đoán
của đoạn DNA và hàm lượng GC của nó, các thông số sau
tác dụng của liều lượng gen. Ngoài ra, việc phát hiện đồng
đây đã được chứng minh bằng thực nghiệm có ảnh hưởng
thời nhiều đột biến trong một mẫu DNA không dễ dự đoán, vì
đến độ nhạy của phân tích SSCP: thành phần nền gel,
dữ liệu trước đây đã chỉ ra rằng kiểu điện di có thể thay
thành phần đệm (cường độ ion, độ pH và các chất bổ sung
đổi đáng kể trong các thí nghiệm khác nhau. Nói chung, mặc
đệm, chẳng hạn như glycerol). ), thời gian chạy gel,
dù có khả năng tái sản xuất cao nhưng khả năng di động
chiều dài gel, nồng độ DNA và nhiệt độ điện di.
của các DNA chuỗi đơn không thể dự đoán trước được từ
thông tin trình tự.
Hơn nữa, trong nỗ lực cải thiện hơn nữa độ nhạy của SSCP,
4. Phát hiện: Việc hiển thị các đoạn DNA chuỗi đơn có thể
phương pháp RNAeSSCP đã được phát triển (Sarkar và cộng
được thực hiện bằng một số phương pháp phát hiện. Điều
sự, 1992), trong đó DNA chuỗi kép được chuyển đổi thành
này bao gồm việc sử dụng chất phóng xạ và một số quy
RNA chuỗi đơn tương ứng bằng một trong hai mồi có trình tự
trình được mô tả khác sử dụng phương pháp nhuộm bạc
khởi động phage ở đầu 50 của nó . Mặc dù độ nhạy của nó có
hoặc phát hiện bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Ngoài ra,
thể dựa vào thực tế là chuỗi phiên mã in vitro không có
trong F-SSCP, việc phân tích có thể được thực hiện trên
chuỗi bổ sung để ủ lại, nhưng nó vẫn cần đủ lượng sản phẩm
các máy giải trình tự tự động với các đoạn DNA được
phiên mã in vitro để điện di và dễ dàng phân tích, thậm
đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Từ đó, phương
chí bằng cách nhuộm ethidium bromide (Sarkar et al . ,
pháp nhuộm bạc bao gồm một trong những phương pháp đơn
1992).
giản, nhanh chóng và nhạy cảm nhất để hiển thị các

dải trên gel SSCP thông thường.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy trong phân tích
SSCP và do đó cần phải được tính đến để có được kết quả có
thể lặp lại cũng như tối đa hóa độ nhạy của việc phát hiện
đột biến. Việc tối ưu hóa các yếu tố này mang tính thực
nghiệm cao, vì không có cơ sở lý thuyết hoặc loại thuật
toán đầy đủ (như trong DGGE [xem sau]) cho phép các nhà
nghiên cứu dự đoán cấu trúc ba chiều của các đoạn DNA
chuỗi đơn theo các quy trình thí nghiệm cụ thể. . Những
yếu tố thường xuyên ảnh hưởng đến độ nhạy của cả hai
phương pháp sẽ được thảo luận trong phần này.
Do có nhiều ưu điểm, phân tích SSCP là (và vẫn là trong
một số trường hợp) phương pháp được lựa chọn ở một số
phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử tư nhân hoặc công cộng
để thẩm vấn các đột biến đã biết hoặc quét các đột biến đã
biết hoặc chưa biết trong một thời gian tương đối ngắn.
Điều này áp dụng cả trong khoa học cơ bản cũng như trong
chẩn đoán phân tử. Ví dụ, phân tích SSCP lần đầu tiên được
sử dụng để sàng lọc các gen ứng cử viên trong nguyên nhân
khối u (Suzuki và cộng sự, 1990; Yap và McGee, 1992).
Ngoài việc sử dụng phương pháp SSCP như một công cụ sàng
lọc, một số nhà nghiên cứu trước đây đã sử dụng kỹ thuật
này để lập bản đồ gen ở chuột (Beier, 1993) và trong một
số ít trường hợp hơn để phân tích mối liên kết giữa các gen.
Machine Translated by Google
30 Chẩn đoán phân tử
gen người (Nishimura và cộng sự, 1993; Avramopoulos và cộng
sự, 1993).
Ngoài ra, SSCP đã được áp dụng nhiều lần để phát hiện
các biến thể ở bất kỳ vị trí gen nào, chẳng hạn như sàng
lọc đột biến G6PD (Menounos và cộng sự, 2000; Hình 3.2B) và
phân tích di truyền HBE (Papachatzopoulou và cộng sự, 2006).
Hơn nữa, SSCP đã được sử dụng để phân loại phân tử trong
vi sinh lâm sàng nhằm phát hiện các biến thể nucleotide ở
gen groEL, nhằm phân biệt các chủng sal monella ở cả
interserovar và intraserovar.
mức độ (Nair và cộng sự, 2002). Ngoài ra, Peters và cộng sự
(1997) đã báo cáo sự phân biệt thành công giữa các giả loài
virus viêm gan C (HCV), sử dụng phân tích F-SSCP của các
đoạn được sao chép ngược-PCR từ HCV RNA, chứa vùng I siêu
biến của bộ gen HCV.
Với điều kiện là hiệu giá virus là đủ, các tác giả này đã chỉ ra
rằng F-SSCP là một phương pháp nhanh chóng và đáng tin cậy để
phân tích các giả loài HCV. Cuối cùng, F-SSCP đã được chứng minh
là một phương pháp đặc biệt hữu ích trong việc xác định kiểu gen
kháng nguyên tiểu cầu ở người (Quintanar et al., 1998).
3.3.2 Phân tích song công
Nguyên tắc của HDA đơn giản và có liên quan chặt chẽ với
SSCP. Tóm lại, các dị thể được hình thành giữa các alen DNA
khác nhau, ví dụ, bằng cách trộn các đoạn DNA được khuếch
đại kiểu hoang dã và đột biến, sau đó biến tính ở 95C và ủ
lại chậm đến nhiệt độ phòng (White và cộng sự, 1992). Nếu
DNA mục tiêu đã bao gồm các alen khác nhau (ví dụ: trường
hợp dị hợp tử) thì các đám rối dị hợp tử sẽ được hình thành
tự động trong bước khuếch đại. Kết quả là sự hình thành của
hai đồng thể và hai dị thể, bị chậm lại trong quá trình
điện di ở gel polyacrylamide tự nhiên (Hình 3.2C). Có hai
loại phân tử dị thể, tùy thuộc vào loại biến thể gen, từ đó
phản ánh tính ổn định của chúng. Nói cách khác, việc xóa
hoặc thêm một lượng nhỏ sẽ tạo ra các dị thể ổn định, được
gọi là các dị thể loại phình, đã được xác minh bằng kính
hiển vi điện tử (Wang và cộng sự, 1992). Mặt khác, sự thay
thế bazơ đơn tạo thành cái gọi là dị vòng loại bong bóng,
khó hình dung hơn nhiều và cần phải tối ưu hóa các điều kiện
thí nghiệm để đạt được độ phân giải tối ưu của loại dị vòng
này. Một số kỹ thuật chẩn đoán phân tử, dựa trên dị thể để
giao phối, đã được báo cáo trong tài liệu, chẳng hạn như
phân tách bằng enzyme hoặc hóa học và DGGE, nhưng HDA dường
như là kỹ thuật hấp dẫn nhất, vì nó có thể được thực hiện
nhanh chóng trên các gel ngắn mà không cần cần thiết bị
chuyên dụng và sử dụng chất phóng xạ. Ví dụ điển hình nhất
về việc sử dụng HDA để sàng lọc đột biến là việc phát hiện
nhanh việc mất 3-bp p.F508del trong gen CFTR, dẫn đến bệnh
xơ nang (Hình 3.2D).
HDA cũng có thể được điều chỉnh phù hợp với hệ thống mao
quản huỳnh quang, chẳng hạn như máy phân tích DNA tự động
hiện có. Điều này có thể thực hiện được bằng cách dán nhãn
mồi bằng thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn như 6-
carboxyfluorescein, hexachloro 6-carboxyfluorescein, v.v.
Giống như F-SSCP, HDA dựa trên mao quản (CE-HDA) cũng có ưu
điểm là ghép kênh, cùng với việc sử dụng của các loại thuốc
nhuộm huỳnh quang khác nhau có thể làm tăng đáng kể năng
suất phân tích (Kozlowski và Krzyzosiak, 2001). Việc sử
dụng các hệ thống đa mao quản, ví dụ như bệ 96 mao quản,
cũng có thể giảm thời gian cần thiết để xử lý từng mẫu. Ví
dụ: có thể phân tích tối đa 10 sản phẩm PCR trong một mao
quản mỗi lần chạy, cho thấy rằng toàn bộ phân tích vùng mã
hóa BRCA1 và BRCA2 của bệnh nhân có thể được hoàn thành
trong một lần chạy trong vòng 1,5 giờ (Esteban-Cardeñosa và
cộng sự, 2004) . Tóm lại, CE HDA là một phương pháp có hiệu
suất cao, đủ độ nhạy và tiết kiệm chi phí và có thể dễ dàng
triển khai để cung cấp phân tích di truyền đáng tin cậy
trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử với khối lượng mẫu lớn.
Độ nhạy của phương pháp HDA chưa được xác định trong
phạm vi phân tích SSCP. Rossetti và cộng sự. (1995) đã so
sánh cả hai xét nghiệm SSCP và HDA để phát hiện các đột biến
đã biết trong một nhóm gồm bốn gen.
Mặc dù không có xét nghiệm nào trong số này được thực hiện
với hiệu suất 100%, HDA đã phát hiện nhiều biến thể hơn SSCP
trong cùng một mẫu. Ngoài ra, người ta đã chứng minh rằng
hiệu suất của HDA có thể được cải thiện nhờ ma trận gel,
trong trường hợp này là tăng cường phát hiện đột biến (dẫn
xuất từ HydroLink D5000; Keen và cộng sự, 1991), về cơ bản
đã biến HDA trở thành công nghệ phát hiện biến thể có giá
trị. độc đáo. Cuối cùng, để cải thiện khả năng hiển thị của
các dị vòng loại bong bóng, khó hình dung hơn nhiều so với
các dị vòng loại phình, Máy tạo song công đa năng (UHG) đã
được hình thành (Wood và cộng sự, 1993a,b). UHG bao gồm một
đoạn DNA tổng hợp, có một đoạn mất đi nhỏ (tức là 2 đến 5
bp), được khuếch đại bằng cách sử dụng cùng các đoạn mồi
oligonucleotide giống như DNA đang nghiên cứu. Sau khi
khuếch đại, bộ khuếch đại thử nghiệm được trộn với UHG đã
khuếch đại, bị biến tính và sau đó được ủ lại từ từ, sau đó
là điện di. Nếu không có đột biến nào xuất hiện trong DNA
thử nghiệm thì sẽ chỉ xuất hiện một dị thể loại phình ra,
chậm hơn một chút so với song công đồng nhất. Tuy nhiên,
nếu cũng có sự thay thế bazơ đơn lẻ thì dị thể thu được sẽ
có hai điểm không khớp: loại phình và loại bong bóng, điều
này sẽ dẫn đến dị thể song công di chuyển thấp hơn đáng kể
so với dị song loại phình đơn giản. Việc sử dụng UHG đã được
báo cáo để phát hiện các biến thể đã biết trong một số cơ
địa, chẳng hạn như bệnh von Willebrand (Wood và cộng sự,
1995), phenylketon niệu (Wood và cộng sự, 1993a) và để xác
định nhóm máu trước khi sinh tất cả các lele (Stoerker và
cộng sự, 1996).
Chiến lược HDA đã được thiết kế thành công để phát hiện
các khiếm khuyết di truyền ở một số gen ở người,
Machine Translated by Google
Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 31
chẳng hạn như CFTR (Rommens và cộng sự, 1990), NF1 (Shen và
cộng sự, 1993) và NF2 (Sainz và cộng sự, 1994), APC (Paul
và cộng sự, 1993), PKU (Wood và cộng sự, 1993a ), BRCA1 và
BRCA2 (sử dụng phương pháp CE-HDA; Kozlowski và Krzyzosiak,
2001; Esteban-Cardeñosa và cộng sự, 2004), v.v.
3.3.3 Điện di trên gel
gradient nhiệt độ
TGGE và DGGE đều dựa trên nguyên tắc là khả năng di động
điện di của các đoạn DNA sợi đôi bị giảm đáng kể do sự biến
tính một phần của chúng.
Do sự phụ thuộc vào trình tự của các mối liên kết thích hợp
khi tan chảy của các đoạn DNA, nên có thể phát hiện được
các biến thể trình tự. Mặc dù độ nhạy của TGGE và DGGE trong
việc phát hiện đột biến điểm trong các rối loạn di truyền
và các bối cảnh khác đã được báo cáo là gần 100%, nhưng các
phương pháp này chưa bao giờ trở nên phổ biến như các phương
pháp phát hiện đột biến khác như SSCP, có thể do khó khăn.
trong việc thiết kế các đoạn mồi PCR thích hợp và thiết lập
các xét nghiệm.
Phương pháp này ban đầu được Myers và đồng nghiệp (1985b)
nghĩ ra để tách các đoạn DNA khác nhau bằng cách thay thế
nucleotide đơn trong gel gradient biến tính. Phương pháp này
dựa trên quan điểm cho rằng sự biến tính (tan chảy) của các
đoạn DNA có thể được coi là trạng thái cân bằng cho mỗi bp
giữa hai trạng thái riêng biệt: xoắn kép và trạng thái ngẫu
nhiên hơn trong đó các bazơ không được ghép cặp cũng như
không xếp chồng lên các bazơ liền kề trong bất kỳ trạng thái
nào. cách có trật tự (Myers et al., 1987). Sự thay đổi từ
trạng thái thứ nhất sang trạng thái thứ hai là do nhiệt độ
tăng hoặc nồng độ chất biến tính tăng.
Trong trường hợp thay thế một nucleotide, việc thay thế
một A:T bp (hai liên kết hydro) bằng một cặp G:C (ba liên
kết hydro) nhìn chung sẽ làm tăng nhiệt độ tại đó trình tự
DNA tương ứng tan chảy. Bối cảnh của sự thay thế nucleotide
cũng đóng một vai trò và sự thay thế các cặp A:T bằng các
cặp T:A hoặc các cặp G:C bằng C:G cũng có thể ảnh hưởng đến
nhiệt độ mà tại đó trình tự DNA phân ly.
Hơn nữa, đoạn DNA phân tách theo kiểu từng bước khi
nhiệt độ tăng dần. Sự phân ly xảy ra gần như đồng thời ở
các vùng riêng biệt dài khoảng 50e300-nucleotide, được gọi
là “miền nóng chảy”. Tất cả các nucleotide trong miền nóng
chảy nhất định đều phân ly theo kiểu hoàn toàn hoặc không
có gì trong một khoảng nhiệt độ hẹp.
Tm biểu thị nhiệt độ tại đó 50% phân tử riêng lẻ bị phân
ly trong miền nóng chảy nhất định và 50% là xoắn ốc kép .
Như đã chỉ ra trước đó, Tm phụ thuộc rất nhiều vào trình tự
DNA riêng lẻ và có thể bị thay đổi đáng kể bởi những thay
đổi nhỏ trong trình tự DNA, bao gồm cả nucleotide đơn.
sự thay thế. TGGE dựa trên việc phát hiện sự khác biệt về
độ linh động điện di giữa các phân tử có thể chỉ khác nhau
ở một vị trí. Các đoạn DNA được tạo ra bằng PCR sẽ được điện
di thông qua gradient nhiệt độ tăng tuyến tính (hoặc
gradient nồng độ của các tác nhân biến tính như urê và
formamide trong trường hợp DGGE). Sự thay thế nucleotide và
những thay đổi nhỏ khác trong trình tự DNA có liên quan đến
các dải bổ sung sau TGGE.
Khả năng di động điện di của các đoạn DNA khác nhau tùy
theo đoạn đó có xoắn ốc kép hoàn toàn hay không, nếu một
hoặc nhiều miền nóng chảy đã phân ly hoặc nếu xảy ra sự phân
ly hoàn toàn thành hai phân tử chuỗi đơn. Khả năng di động
điện di của đoạn DNA xoắn kép (không biến tính) không bị
thay đổi đáng kể bởi sự thay thế nucleotide đơn bên trong
nó, nhưng nó chủ yếu phụ thuộc vào chiều dài và có lẽ độ
cong của đoạn (Haran et al., 1994) . Do đó, giả sử rằng các
sản phẩm PCR chứa hỗn hợp hai đoạn DNA khác nhau ở một vị
trí duy nhất, như trường hợp của một biến thể gen ở trạng
thái dị hợp tử, thì cả hai đoạn ban đầu sẽ di chuyển qua gel
với cùng tốc độ. Khi các phân tử đạt đến điểm đó trong gel,
nơi nhiệt độ bằng Tm của chúng, các phân tử sẽ bị giảm độ
linh động do sự chuyển đổi từ cấu trúc xoắn ốc kép (song
công) hoàn toàn sang cấu trúc bị biến tính một phần. Sự phân
ly của một số miền tan chảy đầu tiên thường dẫn đến sự giảm
đáng kể tính di động của đoạn DNA, bởi vì đoạn DNA này có
cấu trúc phân nhánh phức tạp. Do sự phụ thuộc trình tự mạnh
mẽ của Tm, sự phân ly và hậu quả là làm chậm quá trình di
chuyển điện di xảy ra ở các mức gradient nhiệt độ khác nhau
liên quan đến các dải ở các vị trí khác nhau trong gel
(Myers et al., 1987).
Ngoài hai phân tử song công (wt/wt và mt/mt), hai phân tử dị
hợp tử khác nhau (wt/mt và mt/wt) có thể được hình thành
bằng cách phân tách và gắn lại các đoạn DNA chứa đột biến
dị hợp tử trước khi thực hiện TGGE (Hình 2) . 3,3A). Các
mảnh dị thể sau đó chứa các bazơ không ghép cặp hoặc “phình”
trong DNA xoắn kép, dẫn đến giảm đáng kể Tm của vùng nóng
chảy bị ảnh hưởng (Ke và Wartell, 1995). Tm của hai phân tử
dị thể nhìn chung khác nhau, do đó mỗi dị thể có thể nhìn
thấy riêng biệt trong gel . Như vậy, một biến thể gen ở
trạng thái dị hợp tử sẽ được hình dung bằng sự xuất hiện
của bốn dải: một dải đại diện cho alen bình thường (đồng hợp
tử), một dải đại diện cho thể đồng hợp tử đột biến sẽ nằm
phía trên hoặc bên dưới dải đồng nhất kiểu hoang dã, tùy
thuộc vào ảnh hưởng của biến thể lên Tm và hai dải dị thể
luôn ở trên các dải đồng nhất (Hình 3.3B; Myers et al.,
1987).
Các dải đồng nhất loại đột biến và hoang dã được phân tách
bằng 2e10 mm trong gel polyacrylamide điển hình và
Machine Translated by Google

32 Chẩn đoán phân tử

HÌNH 3.3 (A) Cơ chế hình thành dị thể. Trong trường hợp đột biến điểm dị hợp tử trong các rối loạn di truyền (được biểu thị bằng dấu hoa thị),
phản ứng chuỗi polymerase tạo ra hai alen chỉ khác nhau ở vị trí đột biến điểm. Các phân tử loại hoang dã và đột biến hiện diện với tỷ lệ xấp xỉ
1:1. Sự biến tính sau đó là ủ lại các phân tử này tạo ra cả phân tử đồng hợp loại hoang dã và phân tử đồng hợp đột biến (Hom) cũng như hai phân
tử dị hợp tử, bao gồm loại hoang dã và chuỗi đột biến (Het). (B) Điện di gel gradient nhiệt độ và biến tính song song (DGGE). Sàng lọc đột biến
thường được thực hiện với gradient nhiệt độ hoặc độ biến tính song song với hướng điện di. Trong ví dụ này, kết quả điện di từ trên xuống dưới
đối với một gia đình giả định đang phân biệt rối loạn lặn nhiễm sắc thể thường được hiển thị. Trường hợp 2 là bình thường, chỉ mang alen kiểu
hoang dã; Trường hợp 3 là dị hợp tử về đột biến điểm, dẫn đến sự xuất hiện của một dải đồng nhất bổ sung cũng như hai dải dị hợp tử bổ sung (Het).
Trường hợp 1, đồng hợp tử về đột biến, chỉ hiển thị dải đồng hợp tử đột biến (Hom).
(C) Phát hiện đột biến bằng phân tích DGGE. Sàng lọc tính đa hình GC-158 C > T trong vùng khởi động của gen HBG2 (GC-globin) ở người. Làn 3 và 4
tương ứng với các mẫu đồng hợp tử cho tính đa hình đó. Làn 2 tương ứng với một mẫu dị hợp tử và làn 1 tương ứng với một mẫu không mang tính đa
hình này trên một trong hai alen. Hình ảnh lịch sự của George P. Patrinos.

Các dải dị thể thường cao hơn các dải đồng nhất từ 3 cm
trở lên.
Một vấn đề quan trọng trong cả TGGE (và DGGE) là các
biến thể gen chỉ có thể được phát hiện trong (các) hoạt
động tan chảy chính với Tm thấp nhất. Do đó, việc hình
dung các biến thể gen hiện diện trong các đoạn DNA có
nhiều miền tan chảy với Tm khác nhau trở nên khó khăn, vì
một khi các đoạn DNA đạt đến nhiệt độ mà tại đó miền tan
chảy đầu tiên phân tách, khả năng di động của đoạn đó sẽ
giảm đi rất nhiều. rằng nó có thể không đạt được nhiệt độ
phù hợp với các miền Tm cao hơn trong các điều kiện của
thí nghiệm. Nói cách khác, chỉ những đột biến trong miền
Tm thấp nhất mới có thể được phát hiện một cách đáng tin
cậy bởi TGGE hoặc DGGE (Myers et al., 1987).
Để khắc phục nút cổ chai này, khái niệm kẹp GC đã
được đưa ra. Kẹp GC là một chuỗi giàu GC dài 135 bp được
gắn vào đoạn cần phân tích trong bước khuếch đại. Nếu
không có kẹp GC, chỉ các biến thể có trong miền nóng chảy
thấp nhất (loại có Tm thấp hơn) mới có thể được hiển thị
trong gel. Tuy nhiên, do hàm lượng GC cao nên kẹp GC có
Tm cao hơn đáng kể so với hầu hết các chuỗi xuất hiện tự
nhiên và do đó, việc bổ sung kẹp GC làm thay đổi đáng kể
tính chất nóng chảy của bất kỳ chuỗi nào, cho phép phát
hiện bất kỳ biến thể nào trong đoạn này (Myers et al.,
1985a). Người ta đã chứng minh rằng việc bổ sung trình tự
giàu G þ C dài 40 nucleotide vào một trong hai mồi PCR,
kẹp GC có thể được thêm vào một cách thuận tiện vào bất
kỳ đoạn DNA nào được tạo ra bằng PCR (Sheffield và cộng
sự, 1989) . ). Cũng có thể sử dụng kẹp GC phổ quát được
tích hợp vào các đoạn DNA khuếch đại trong quá trình PCR,
do đó tránh được chi phí tổng hợp các đoạn mồi dài (Top,
1992). Mồi PCR biến đổi Psoralen có thể được sử dụng
thay thế cho kẹp GC. Một trong hai mồi PCR được biến đổi
50 bởi 5-(-hexyloxy)-psoralen. Đầu 50 của mồi phải có hai
gốc adenosine; nếu trình tự tự nhiên không có AA thì
trình tự này phải được gắn vào trình tự DNA cụ thể của
mồi.
Psoralens là chất quang học hai chức năng có thể hình
thành liên kết cộng hóa trị với bazơ pyrimidine (đặc
biệt là thymi dine). Nếu xen kẽ ở mức 50 -TpT trong DNA
xoắn kép (đây sẽ là trình tự bổ sung của đầu 30 của
Machine Translated by Google
Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 33
chuỗi còn lại sau PCR), psoralen tạo thành liên kết cộng
hóa trị với thymidine sau quá trình quang hóa (Costes et
al., 1993b). Cảm ứng quang có thể được thực hiện bằng
cách cho sản phẩm PCR tiếp xúc với nguồn tia cực tím (UV)
(365) trong 5-15 phút, việc này có thể được thực hiện một
cách thuận tiện trong các ống PCR ban đầu hoặc đĩa 96
giếng. Kẹp Psoralen đôi khi được ưu tiên hơn kẹp GC vì
PCR thường dễ tối ưu hóa hơn và có thể kẹp lưỡng cực nếu
cần thiết. Việc sửa đổi mồi Psoralen có sẵn từ nhiều nguồn
oligonucleotide thương mại.
Để tối ưu hóa các điều kiện chạy gel, có thể sử dụng
một chương trình máy tính, chẳng hạn như Melt94, nhưng
vẫn cần thực hiện một số thí nghiệm sơ bộ để xác định các
điều kiện điện di và thời gian chạy tối ưu và để xác nhận
rằng gradient biến tính tối ưu đã được chọn. để đảm bảo
rằng các dải được tách biệt tốt. Chương trình Melt87 tính
toán Tm cho mỗi bp trong đoạn DNA, tức là nhiệt độ tại đó
50% phân tử riêng lẻ có dạng xoắn kép và 50% phân tử ở
trạng thái nóng chảy hoàn toàn. Kết quả của phép tính như
vậy được gọi là “bản đồ tan chảy”, trong đó các đoạn DNA
được cho thấy thường được chia thành các miền nóng chảy
riêng biệt có chiều dài khoảng 50e300 bp, trong đó tất cả
các bps đều có Tm gần như giống hệt nhau . Bản đồ nóng
chảy thể hiện miền nóng chảy thấp nhất trong đoạn DNA;
như đã đề cập trước đó, chỉ các biến thể gen trong vùng
này mới được hiển thị bằng phân tích DGGE hoặc TGGE.
Tương tự, để chọn phạm vi nồng độ chất biến tính tối ưu,
có thể sử dụng phần mềm cụ thể (SQHTX, Lerman và
Silverstein, 1987) , tính toán sự chênh lệch nhiệt độ tại
đó các phân tử đồng nhất và dị thể tan chảy một phần. Sau
đó, quá trình tối ưu hóa bắt đầu bằng thí nghiệm TGGE
vuông góc, trong đó điện di được thực hiện vuông góc với
gradient nhiệt độ. TGGE vuông góc được chạy với gradient
20e60C, sẽ phù hợp với phần lớn các đoạn PCR.
3.3.4 Điện di chuyển màu trên
gel biến tính
DGGE là một dạng điện di trên gel polyacrylamide trong đó
đoạn DNA sợi đôi di chuyển vào một gradient có điều kiện
biến tính tăng tuyến tính, thay vì nhiệt độ, có chức năng
tương đương với gradient nhiệt độ của TGGE. Các chất biến
tính được sử dụng là nhiệt (nhiệt độ không đổi thường là
60C) và tỷ lệ cố định của formamide (trong khoảng từ 0
đến 40%) và urê (trong khoảng từ 0 đến 7 M). Nhiệt độ 60C
được chọn theo kinh nghiệm để vượt quá Tm của đoạn DNA
giàu AT trong trường hợp không có chất biến tính. Nhiệt
độ cao hơn (ví dụ 75C) có thể được sử dụng cho các trình
tự DNA giàu GC. Để đạt được sự phân bố nhiệt độ đồng đều
thiết bị điện di được ngâm trong bể nước tuần hoàn.
DGGE, giống như TGGE, đã được sử dụng để nghiên cứu
một số lượng lớn gen bệnh. Do việc phát hiện các biến thể
gen ở trạng thái dị hợp tử tương đối dễ dàng, chủ yếu là
do sự xuất hiện của các dị hợp tử, TGGE và DGGE đặc biệt
hữu ích đối với các rối loạn đặc trưng bởi các biến thể
dị hợp tử hoặc đột biến de novo thường xuyên (được xem
xét trong Fodde và Losekoot, 1994) . Do nỗ lực liên quan
đến việc thiết kế mồi và tối ưu hóa các điều kiện, TGGE
hoặc DGGE thường được dành riêng cho các tình huống khi
cần sàng lọc đột biến với số lượng lớn mẫu.
Hầu hết các giao thức sàng lọc đột biến đều liên quan
đến việc phân tích đồng thời 24 mẫu trở lên trên một TGGE/
DGGE song song. Nói chung, các mẫu dây đeo bị thay đổi
rất dễ nhận ra. Sự xuất hiện cổ điển của các đột biến dị
hợp tử (Hình 3.3C) là do sự xuất hiện của ba dải bổ sung.
Với một số đột biến, chỉ có một hoặc hai dải bổ sung được
nhìn thấy. Nói chung, nếu không có kẹp GC, Myers và cộng
sự, (1985b) đã cho thấy tỷ lệ phát hiện gần 40% các biến
thể trình tự trong đoạn DNA lên tới 500 bp, nhưng việc bổ
sung kẹp psoralen hoặc GC có thể cải thiện đáng kể. tỷ lệ
phát hiện, trong hầu hết các trường hợp lên tới 100%. Độ
nhạy của TGGE/DGGE để phát hiện các biến thể đã biết
thường được báo cáo là gần như 100%, như trong trường hợp
gen CFTR, trong đó DGGE phát hiện 201 trong số 201 biến
thể đã biết (Macek et al., 1997). Ngoài ra, TGGE và DGGE
đã được chứng minh là rất nhạy cảm trong việc phát hiện
các đột biến trong các tình huống mà trình tự đột biến
xuất hiện với tỷ lệ dưới 50%, chẳng hạn như trong trường
hợp dị hợp chất trong các rối loạn ty thể với tỷ lệ dị
chất ở mức thấp. là 1% (Tully và cộng sự, 2000), cũng như
trong xét nghiệm bệnh còn sót lại trong bệnh ung thư
(Ahnhudt và cộng sự, 2001; Alkan và cộng sự, 2001).
Cũng có một số biến thể của các chủ đề DGGE và TGGE
chính, chẳng hạn như DGGE phạm vi rộng, trong đó một loại
gel và một bộ điều kiện duy nhất được sử dụng để sàng lọc
tất cả các exon của một gen (Guldberg và Guttler, 1994;
Hayes et cộng sự, 1999); multiplex DGGE, trong đó một số
exon được phân tích đồng thời trong một gel DGGE (Costes
et al., 1993a); DGGE bộ gen, trong đó DNA bộ gen được
tiêu hóa bằng enzyme giới hạn, được điện di bởi DGGE,
chuyển vào màng nylon và được lai với một đầu dò DNA duy
nhất (Borresen và cộng sự, 1988); DGGE không đổi (cDGGE),
trong đó gel chứa nồng độ chất biến tính không đổi, cho
phép tăng độ phân giải của các mảnh đột biến vì chúng sẽ
liên tục di chuyển với độ linh động điện di khác nhau
trong toàn bộ chiều dài của gel (Hovig et al., 1991) ;
điện di mao mạch biến tính liên tục, trong đó sự phân tách
các đoạn DNA đạt được bằng tốc độ vi phân của DNA nóng
chảy một phần trong môi trường có nồng độ chất biến tính
đồng nhất (cũng có sẵn trong phương pháp điện di dựa trên
mảng).
Machine Translated by Google

34 Chẩn đoán phân tử

định dạng); điện di mao mạch gradient nhiệt độ dựa trên chip điện di mao mạch, trong đó các biến thể trình tự DNA

(Zhang và cộng sự, 2007); nhiệt độ thời gian được phát hiện dựa trên sự di chuyển khác biệt của chúng trong một

Điện di trên gel gradient, trong đó sử dụng nồng độ urê hoặc hệ thống mao quản chứa đầy polymer, cho phép lấy nhiều mẫu
formamide liên tục, như trong cDGGE, nhưng được phân tích vào cùng một mao mạch (hoặc tập hợp mao mạch)

nhiệt độ trong quá trình chạy tăng dần (Yoshino được phân tách bằng các khoảng thời gian xác định trước của điện

và cộng sự, 1991; Wiese và cộng sự, 1995); gradient nhiệt độ vi mô di từng phần (ví dụ: hệ thống 96 mao quản có thể sàng lọc

điện di gel, trong đó gel được thu nhỏ 15.000 mẫu trong 24 giờ; Minarik và cộng sự, 2003).
(20 20 0,5 mm) được sử dụng để giảm thiểu lượng Đã có một số ứng dụng chẩn đoán của cả hai

DNA cần thiết và thời gian chạy (khoảng 12 phút) DGGE và TGGE (Bảng 3.1). Tuy nhiên, việc sử dụng dần dần

ở 100 V, 10 mA; Biyani và Nishigaki, 2001; Tominaga, các kỹ thuật thông lượng cao khác, chẳng hạn như microarrays và

2007); Điện di gel gradient biến tính, độ dốc kép, trong đó ngoài trình tự thế hệ tiếp theo, đã dẫn đến sự dịch chuyển của

việc biến tính hóa học TGGE và DGGE.

gradient (formamid và urê) gradient sàng

(ví dụ: gradient polyacrylamide 6e12%) được sử dụng (Cremonesi

và cộng sự, 1997); lấy dấu vân tay DNA hai chiều/quét gen hai
3.4 KẾT LUẬN
chiều, kết hợp phân tách kích thước

của các đoạn DNA ở chiều thứ nhất với Tất cả các kỹ thuật được mô tả trước đó đều cực kỳ hiệu quả.

phân tách theo trình tự cụ thể thông qua DGGE trong lần thứ hai phổ biến và tạo thành cơ sở để chẩn đoán

kích thước; biến tính HPLC, sử dụng nguyên lý phân tách sắc ký phòng thí nghiệm đang hoạt động. Các phương pháp phát hiện đột

cặp ion kết hợp với kỹ thuật chính xác biến đặc trưng cho alen, đặc biệt là PCReARMS và PCReASO,

kiểm soát nhiệt độ cột và tối ưu hóa thiết bị di động là khả thi và khá đơn giản với một cách tương đối

gradient pha để tách các phân tử DNA đột biến độ chính xác và độ đặc hiệu cao, mặc dù chúng

(xem xét trong Xiao và Oefner, 2001); và độ dốc đi xe đạp chỉ thích hợp cho các phòng thí nghiệm có năng suất thấp.

BẢNG 3.1 Các ví dụ điển hình về các ứng dụng điện di trên gel gradient biến tính trong chẩn đoán phân tử

Ứng dụng gen Người giới thiệu

COL1A2 Borresen và cộng sự. (1988)

Sàng lọc các gen trong bộ gen rõ ràng
của con người
SERPINA1 Hayes (2003)

HBG1/HBG2 Patrinos và cộng sự. (1998, 2001)

TP53 Pignon và cộng sự. (1994)

FBN1 Tiecke và cộng sự. (2001), Katzke và cộng sự. (2002), và Robinson và cộng sự.

(2002)

NF1 Peters và cộng sự. (1999) và Fahsold và cộng sự, 2000

DMD Hofstra và cộng sự. (2004)

HBD Papadakis và cộng sự. (1997)

HBB Losekoot và cộng sự. (1990)

NAM1 Balogh và cộng sự. (2004)

Bạch cầu người Uhrberg và cộng sự. (1994) và Knapp (2005)

Gõ kháng nguyên

Nucleotide đơn Hsia và cộng sự. (2005) và Maher và cộng sự. (2006)

khám phá đa hình

Bộ gen của ty thể Các biến thể ty thể Hanekamp và cộng sự. (1996) và Chen và cộng sự. (1999)

Vi sinh phân tử Phân tích vi khuẩn Muyzer và Smalla (1998), van Elsas và cộng sự. (2002), Đặng và cộng sự.
(2008) và Ercolini (2004)

Bộ gen vi sinh vật Watanabe và cộng sự. (2002)

lập hồ sơ

Sàng lọc bộ gen virus Lu và cộng sự. (2002) và Motta và cộng sự. (2002)

Đa dạng sinh học phân tử thực vật Gomes và cộng sự. (2003) và Nikolcheva và cộng sự. (2003)
Machine Translated by Google

Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 35

Tương tự, SSCP và HDA, là các phương pháp đơn giản, Cai, SP, Wall, J., Kan, YW, Chehab, FF, 1994. Đảo ngược các đầu dò dấu chấm để sàng

lọc các đột biến b-thalassemia ở người châu Á và người Mỹ da đen. Ừm. Đột biến.
đáng tin cậy và nhạy cảm để phát hiện sự thay đổi trình tự
3, 59e63.
nucleotide trong locus gen, được sử dụng rộng rãi để phân
Chan, V., Yam, I., Chen, FE, Chan, TK, 1999. Một dấu chấm ngược cho
tích DNA của bệnh ung thư ở người và các rối loạn di truyền khác.
phát hiện nhanh bệnh thalassemia không xóa bỏ. Anh. J. Haematol. 104,
TGGE, DGGE và các phương pháp liên quan chặt chẽ mang lại
513e515.
độ nhạy rất cao và là các phương pháp thay thế tương đối
Chehab, FF, Wall, J., 1992. Phát hiện nhiều đột biến xơ nang bằng phương pháp lai
dễ dàng và rẻ tiền để thực hiện sau khi các xét nghiệm đã
dot blot ngược: một công nghệ sàng lọc chất mang. Ừm. Genet. 89, 163e168.
được thiết kế và tối ưu hóa. Ưu điểm chính của tất cả các
phương pháp ap này là tỷ lệ phát hiện và độ đặc hiệu cao Chehab, FF, 1993. Chẩn đoán phân tử: quá khứ, hiện tại và tương lai. Ừm.

cũng như khả năng phát hiện dị hợp tử được cải thiện. Nhược Đột biến. 2, 331e337.

điểm chính là hạn chế về độ dài đoạn PCR (300e500 Chen, TJ, Boles, RG, Wong, LJ, 1999. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng phương pháp

nucleotide) và khó khăn trong việc phân tích các đoạn giàu điện di trên gel gradient nhiệt độ thời gian.

Phòng khám. Chem. 45, 1162e1167.

GC (trong trường hợp DGGE/TGGE).
Conner, BJ, Reyes, AA, Morin, C., Itakurs, K., Teplitz, RL, Wallace, RB, 1983. Phát
Mặc dù những kỹ thuật này từng chiếm ưu thế trong các
hiện alen S-globin của tế bào hình liềm bằng cách cầu nối hy với oligonucleotide
phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử nhưng dần dần chúng có
tổng hợp. Proc. Natl. Học viện. Khoa học.
xu hướng bị cấm sử dụng. Tuy nhiên, điều đáng chú ý là một
Hoa Kỳ 80, 278e282.
số phương pháp này, chẳng hạn như phát hiện đột biến đặc
Costes, B., Fanen, P., Goossens, M., Ghanem, N., 1993a. Một xét nghiệm nhanh chóng,
trưng của alen, đặt ra các tiêu chuẩn cho sự phát triển của
hiệu quả và nhạy cảm để phát hiện đồng thời nhiều đột biến bệnh xơ nang. Ừm. Đột
các hệ thống thông lượng cao, chẳng hạn như các mảng vi mô biến. 2, 185e191.

nhằm mục đích xác định kiểu gen SNP quy mô lớn liên quan Costes, B., Girodon, E., Ghanem, N., Chtaskol, M., Thương, NT, Dupret, D., Goossens,

đến quét bộ gen và chẩn đoán DNA của các bệnh di truyền, M., 1993b. Các mồi oligonucleotide biến đổi Psoralen cải thiện khả năng phát

mắc phải và truyền nhiễm (xem thêm Chương 18). Những nỗ lực hiện đột biến bằng cách làm biến tính điện di trên gel gradient và cung cấp giải

ban đầu nhằm sàng lọc đột biến HBB ở định dạng mảng pháp thay thế cho kẹp GC. Ừm. Mol.

Genet. 2, 393e397.
(Foglieni và cộng sự, 2004), đã mở đường cho sự phát triển
Cremonesi, L., Firpo, S., Ferrari, M., Righetti, PG, Gelfi, C., 1997.
của các vi mô thông lượng cao ngày nay.
DGGE gradient kép để phát hiện tối ưu các đột biến điểm DNA. Công nghệ sinh học

22, 326e330.
NGƯỜI GIỚI THIỆU Day, DJ, Speiser, PW, White, PC, Barany, F., 1995a. Phát hiện các alen steroid 21-

hydroxylase bằng phương pháp PCR đặc hiệu gen và phản ứng phát hiện thắt nhiều
Ahnhudt, C., Muche, JM, Dijkstal, K., Sterry, W., Lukowsky, A., 2001.
đám rối. Bộ gen 29, 152e162.
Một cách tiếp cận về độ nhạy của điện di gel gradient nhiệt độ trong việc phát
Day, IN, Whittall, R., Gudnason, V., Humphries, SE, 1995b. DNA tấm tem khô,
hiện các tế bào T nhân bản vô tính trong u lympho tế bào T ở da. Điện di 22,
oligonucleotide PCR khô và gửi thư trong đĩa 96 giếng: sàng lọc đột biến gen thụ
33e38.
thể LDL. Công nghệ sinh học 18, 981e984.
Alkan, S., Cosar, E., Ergin, M., Hsi, E., 2001. Phát hiện sự sắp xếp lại gen gamma
Day, NS, Tadin, M., Christiano, AM, Lanzano, P., Piomelli, S., Brown, S., 2002. Chẩn
của thụ thể tế bào T trong các rối loạn tăng sinh lympho bằng phương pháp điện
đoán nhanh bệnh hồng cầu hình liềm trước khi sinh bằng xét nghiệm thắt
di trên gel gradient nhiệt độ. Vòm. Pathol. Phòng thí nghiệm. Med. 125, 202e207.
oligonucleotide kết hợp với phát hiện huỳnh quang mao mạch do tia laser gây ra.
Alves, AM, Carr, FJ, 1988. Phát hiện dấu chấm của đột biến điểm bằng các đầu dò
Prenat. Chẩn đoán. 22, 686e691.
oligonucleotide tổng hợp lai liền kề. Axit nucleic Res. 16, 8723.
Deng, W., Xi, D., Mao, H., Wanapat, M., 2008. Việc sử dụng các kỹ thuật phân tử dựa

trên RNA ribosome và DNA cho nghiên cứu hệ sinh thái vi sinh vật dạ cỏ: đánh
Avramopoulos, D., Cox, T., Kraus, JP, Chakravarti, A., Antonarakis, SE, 1993. Lập bản
giá. Mol. Biol. Dân biểu 35, 265e274.
đồ liên kết của gen Cysathionine beta synthase (CBS) trên nhiễm sắc thể người
Ercolini, D., 2004. Lấy dấu vân tay PCR-DGGE: các chiến lược mới để phát hiện vi
21 bằng cách sử dụng đa hình thái DNA ở vùng 30 chưa được dịch mã . Ừm. Genet.
khuẩn trong thực phẩm. J. Vi sinh vật. Phương pháp 56 (3), 297e314.
90, 566e568.
Esteban-Cardeñosa, E., Duran, M., Infante, M., Velasco, E., Miner, C., 2004. Phương
Balogh, K., Patócs, A., Majnik, J., Rácz, K., Hunyady, L., 2004. Các phương pháp sàng
pháp phát hiện đột biến thông lượng cao để quét BRCA1 và BRCA2 dựa trên phân
lọc di truyền để phát hiện các đột biến gây ra nhiều loại tân sinh nội tiết loại
tích dị thể bằng phương pháp điện di mảng mao quản. Phòng khám. Chem. 50,
1. Mol. Genet. Metab. 83, 74e81.
313e320.
Barany, F., 1991. Phát hiện bệnh di truyền và khuếch đại DNA bằng cách sử dụng ligase
Fahsold, R., Hoffmeyer, S., Mischung, C., Gille, C., Ehlers, C., Kucukceylan, N.,
nhân bản vô tính chịu nhiệt. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 88, 189e193.
Abdel-Nour, M., Gewies, A., Peters, H., Kaufmann, D ., Buske, A., Tinschert, S.,
Beier, DR, 1993. Phân tích đa hình dạng chuỗi đơn (SSCP) như một công cụ để lập bản
Nurnberg, P., 2000. Phổ đột biến tổn thương nhỏ của toàn bộ gen NF1 không giải
đồ di truyền. Mẹ ơi. Bộ gen 4, 627e631.
thích được khả năng biến đổi cao của nó nhưng chỉ ra một miền chức năng ngược
Biyani, M., Nishigaki, K., 2001. Năng suất gấp trăm lần của phân tích bộ gen bằng
dòng của miền liên quan đến GAP. Là. J. Hừm. Genet. 66, 790e818.
cách giới thiệu điện di gel gradient nhiệt độ vi mô. Điện di 22, 23e28.

Fodde, R., Losekoot, M., 1994. Phát hiện đột biến bằng phương pháp điện di gel
Borresen, AL, Hovig, E., Brogger, A., 1988. Phát hiện các đột biến cơ bản trong DNA
gradient biến tính (DGGE). Ừm. Đột biến. 3, 83e94.
bộ gen bằng cách sử dụng phương pháp điện di trên gel gradient biến tính (DGGE),
Foglieni, B., Cremonesi, L., Travi, M., Ravani, A., Giambona, A., Rosatelli, MC,
sau đó chuyển và lai với các đầu dò đặc hiệu gen. Đột biến. Res. 202, 77e83.
Perra, C., Fortina, P., Ferrari, M., 2004. Beta
Machine Translated by Google

36 Chẩn đoán phân tử

Chip vi điện tử thalassemia: phương pháp phát hiện đột biến nhanh và chính xác Humphries, SE, Gudnason, V., Whittall, R., Day, IN, 1997. Phân tích đa hình dạng

Phòng khám. Chem. 50, 73e79. chuỗi đơn với các sửa đổi thông lượng cao và sử dụng nó trong phát hiện đột

Foglietta, E., Bianco, I., Maggio, A., Giambona, A., 2003. Phát hiện nhanh biến trong chứng tăng cholesterol máu gia đình. Liên đoàn Khoa học Hóa học Lâm
trong sáu vùng Địa Trung Hải chung và ba vùng ngoài Địa Trung Hải sàng Quốc tế: Ủy ban Kỹ thuật Sinh học Phân tử. Phòng khám.

đột biến điểm thalassemia bằng phân tích dotblot ngược. Là. J.

Hematol. 74, 191e195. Chem. 43, 427e435.

Fox, DH, Huang, CK, Du, J., Chang, TY, Pan, Q., 2007. Ảnh hưởng sâu sắc đến bước Iannone, MA, Taylor, JD, Chen, J., Li, MS, Rivers, P., Slentz Kesler, KA, Weiner,

PCR của xét nghiệm PCR/OLA ghép kênh CF V3 bằng cách sử dụng ống phản ứng nhựa MP, 2000. Kiểu gen đa hình nucleotide đơn đa pha bằng phương pháp thắt

được chiếu xạ UV. Chẩn đoán. Mol. Pathol. 16, 121e123. oligonucleotide và tế bào học dòng chảy. Tế bào học 39, 131e140.

Gold, B., 2003. Nguồn gốc và tiện ích của dấu chấm ngược. Chuyên gia Rev. Mol.

Chẩn đoán. 3, 143e152. Katzke, S., Booms, P., Tiecke, F., Palz, M., Pletschacher, A., Turkmen, S.,

Gomes, NC, Fagbola, O., Costa, R., Rumjanek, NG, Buchner, A., Mendona-Hagler, L., Neumann, LM, Pregla, R., Leitner, C., Schramm, C., Lorenz, P., Hagemeier, C.,

Smalla, K., 2003. Động thái của quần xã nấm với số lượng lớn và đất vùng rễ Fuchs, J., Skovby, F., Rosenberg, T., Robinson, PN, 2002. Sàng lọc TGGE toàn bộ

ngô ở vùng nhiệt đới. Môi trường ứng dụng. chuỗi mã hóa FBN1 ở 126 cá nhân mắc hội chứng Marfan và các bệnh lý

Vi sinh vật. 69 (7), 3758e3766. Lỗi trong: Appl. Môi trường. Vi sinh vật. 69 fibrillinopathies liên quan. Ừm.

(9), 5737. Đột biến. 20, 197e208.

Grossman, PD, Bloch, W., Brinson, E., Chang, CC, Eggerding, FA, Fung, S., Iovannisci, Ke, SH, Wartell, RM, 1995. Ảnh hưởng của các cặp bazơ lân cận đến tính ổn định của

DM, Woo, S., Winn-Deen, ES, Iovannisci, DA, 1994. High- phát hiện ghép kênh mật các chỗ phồng bazơ đơn và các cặp bazơ trong đoạn DNA.

độ của các chuỗi axit nucleic: xét nghiệm thắt oligonucleotide và phân tách Hóa sinh 34, 4593e4600.

theo trình tự. Axit nucleic Res. 22, 4527e4534. Keen, J., Lester, D., Inglehearn, C., Curtis, A., Bhattacharya, S., 1991.

Phát hiện nhanh các base không khớp đơn lẻ dưới dạng dị thể trên gel Hydrolink.

Guldberg, P., Guttler, F., 1994. DGGE 'phạm vi rộng' để quét đột biến một bước của Xu hướng Genet. 7, 5.

toàn bộ gen: ứng dụng vào gen phenylala 9 hydroxylase ở người. Axit nucleic Knapp, LA, 2005. Điện di gradient biến tính trên gel và ứng dụng của nó trong việc

Res. 22, 880e881. phát hiện tính đa hình phức hợp tương hợp mô học chính.

Hanekamp, JS, Thilly, WG, Chaudhry, MA, 1996. Sàng lọc đa hình DNA ty thể của con Kháng nguyên mô 5, 211e219.

người bằng phương pháp điện di gel gradient biến tính. Ừm. Genet. 98, 243e245. Kozlowski, P., Krzyzosiak, WJ, 2001. Kết hợp phân tích SSCP/song công bằng phương

pháp điện di mao quản để phát hiện đột biến hiệu quả hơn.

Hansen, TS, Petersen, NE, Iitia, A., Blaabjerg, O., Hyltoft- Petersen, P., Horder, Axit nucleic Res. 29, E71.

M., 1995. Xét nghiệm thắt oligonucleotide không phóng xạ mạnh mẽ để phát hiện Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J., Hood, L., 1988. Qua trung gian Aligase

đột biến điểm chung ở gen CYP2D6 gây ra thuốc bất thường sự trao đổi chất. kỹ thuật phát hiện gen. Khoa học 241, 1077e1080.

Phòng khám. Chem. 41, 413e418. Lerman, LS, Silverstein, K., 1987. Mô phỏng tính toán quá trình nấu chảy DNA và ứng

Haran, TE, Kahn, JD, Crothers, DM, 1994. Các yếu tố trình tự dụng của nó để làm biến tính điện di gel gradient.

chịu trách nhiệm về độ cong của DNA. J. Mol. Biol. 244, 135e143. Phương pháp Enzymol. 155, 482e501.

Hayashi, K., Yandell, DW, 1993. PCRSSCP nhạy cảm đến mức nào? Ừm. Liu, J., Zhao, Z., Sun, M., Chen, K., Yuan, W., Jiang, G., 2016. Việc phát hiện nhạy

Đột biến. 2, 338e346. cảm sự đột biến của men sao chép ngược telomerase bằng hệ thống đột biến kháng

Hayashi, K., 1991. PCR-SSCP: một phương pháp đơn giản và nhạy cảm để phát hiện các nguyên khuếch đại-PCR. Genet. Bài kiểm tra.

đột biến trong DNA bộ gen. Ứng dụng phương pháp PCR. 1, 34e38. Mol. Dấu ấn sinh học 20, 90e93.

Hayes, VM, Wu, Y., Osinga, J., Mulder, IM, van der Vlies, P., Elfferich, P., Buys, Losekoot, M., Fodde, R., Harteveld, CL, van Heeren, H., Giordano, PC, Bernini, LF,

CH, Hofstra, RM, 1999. Những cải tiến về thành phần gel và điều kiện điện di 1990. Điện di gradient biến tính trên gel và giải trình tự trực tiếp DNA bộ gen

cho rộng rãi phân tích đột biến phạm vi bằng cách biến tính điện di gel được khuếch đại PCR: một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và đáng tin cậy đối

gradient. Axit nucleic Res. 27, e29. với beta thalassemia. Anh. J. Haematol. 76, 269e274.

Hayes, VM, 2003. Sự đa dạng di truyền của gen alpha-1-antitrypsin ở người Châu Phi Lu, Q., Hwang, YT, Hwang, CB, 2002. Phổ đột biến của các đột biến thymidine kinase

được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm xác định kiểu gen mới. Ừm. Đột biến. loại 1 của virus herpes simplex. J. Virus. 76 (11), 5822e5828.

22, 59e66.

Hofstra, RM, Mulder, IM, Vossen, R., de Koning-Gans, PA, Kraak, M., Ginjaar, IB, van Macek Jr., M., Mercier, B., Mackova, A., Miller, PW, Hamosh, A., Ferec, C., Cut, GR,

der Hout, AH, Bakker, E., Buys, CH, van Ommen, GJ, van Essen, AJ, den Dunnen, 1997. Độ nhạy của kỹ thuật điện di gel gradient biến tính trong việc phát hiện

JT, 2004. Quét đột biến toàn bộ gen dựa trên DGGE của gen dystrophin ở bệnh các đột biến đã biết và các đột biến mới ở Châu Á trong gen CFTR. Ừm. Đột biến.

nhân mắc chứng loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker. Ừm. Đột biến. 23, 57e66. 9, 136e147.

Maher, PM, Chou, HH, Hahn, E., Wen, TJ, Schnable, PS, 2006.

Hovig, E., Smith-Sorensen, B., Brogger, A., Borresen, AL, 1991. Điện di trên gel biến GRAMA: phân tích bản đồ di truyền của dữ liệu điện di mao quản gradient nhiệt

tính không đổi, một sửa đổi của điện di trên gel gradient biến tính, trong phát độ. Lý thuyết. ứng dụng. Genet. 113, 156e162.

hiện đột biến. Đột biến. Res. 262, 63e71. Makino, R., Yazyu, H., Kishimoto, Y., Sekiya, T., Hayashi, K., 1992. F SSCP: phân

Hsia, AP, Wen, TJ, Chen, HD, Liu, Z., Yandeau-Nelson, MD, tích đa hình dạng chuỗi đơn phản ứng chuỗi polymerase dựa trên huỳnh quang (PCR-

Wei, Y., Guo, L., Schnable, PS, 2005. Công cụ điện di mao quản gradient nhiệt SSCP). Ứng dụng phương pháp PCR. 2, 10e13.

độ (TGCE) là một công cụ để bao phủ và lập bản đồ thông lượng cao của SNP và

IDP. Lý thuyết. ứng dụng. Genet. 111, 218e225. Makowski, GS, Nadeau, FL, Hopfer, SM, 2003. PCR ghép kênh đơn ống phát hiện 27 đột

biến xơ nang và 4 dạng đa hình

Machine Translated by Google

Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 37

sử dụng mẫu máu trẻ sơ sinh được thu thập trên thẻ Guthrie. Ann. Phòng khám. Okama, H., Curiel, DT, Brantly, ML, Holmes, MD, Crystal, RD, 1989. Phát hiện

Phòng thí nghiệm. Khoa học. 33, 243e250. nhanh các đột biến không phóng xạ trong bộ gen người bằng cách khuếch đại

Martinelli, RA, Arruda, JC, Dwivedi, P., 1996. Các xét nghiệm thắt-lai lai phát đặc hiệu của alen. Phòng thí nghiệm J. Phòng khám. Med. 114,

quang hóa học đối với các đột biến xơ nang delta F508 và delta I507. Phòng 105e113.

khám. Chem. 42, 14e18. Orita, M., Iwahana, H., Kanazawa, H., Hayashi, K., Sekiya, T., 1989.

Medikare, V., Ali, A., Ananthapur, V., Deendayal, M., Nallari, P., 2016. Phát hiện tính đa hình của DNA người bằng phương pháp điện di trên gel dưới

Các alen có nguy cơ nhạy cảm -238G/A, -308G/A và -1031T/C thúc đẩy đa hình dạng đa hình hình dạng chuỗi đơn. Proc. Natl. Học viện. Khoa học.

động cơ của gen TNF-a đối với u xơ tử cung. Khuyến cáo gần đây Trình tự gen Hoa Kỳ 86, 2766e2770.

DNA. 9, 65e71. Orkin, SH, Markham, AF, Kazazian Jr., HH, 1983. Phát hiện trực tiếp

Menounos, P., Zervas, C., Garinis, G., Doukas, C., Kolokithopoulos, D., Tegos, gen beta-thalassemia phổ biến ở Địa Trung Hải với các đầu dò DNA tổng hợp:

C., Patrinos, GP, 2000. Tính không đồng nhất phân tử của tình trạng thiếu một phương pháp thay thế để chẩn đoán trước sinh. J. Lâm sàng.

hụt glucose-6-phosphate dehydrogenase ở Hy Lạp dân số. Ừm. Đây. 50, 237e241. Đầu tư. 71, 775e779.

Papachatzopoulou, A., Menounos, PG, Kolonelou, C., Patrinos, GP, 2006. Sàng lọc

Minarik, M., Minarikova, L., Bjorheim, J., Ekstrom, PO, 2003. Điện di mao quản đột biến ở gen epsilon-globin ở người bằng cách sử dụng phân tích đa hình

gradient theo chu kỳ: một công cụ chi phí thấp để phân tích thông lượng cao hình dạng chuỗi đơn. Là. J. Hematol. 81, 136e138.

các biến thể di truyền. Điện di 24, 1716e1722.

Motta, FC, Rosado, AS, Couceiro, JN, 2002. Tiêu chuẩn hóa phương pháp điện di Papadakis, M., Papapanagiotou, E., Loutradi-Anagnostou, A., 1997.

trên gel gradient biến tính để sàng lọc đột biến các mẫu vi rút cúm A Phương pháp quét để xác định tính không đồng nhất về mặt phân tử của gen

(H3N2). J. Virus. Phương pháp 101 (1e2), 105e115. delta globin, đặc biệt là ở bệnh delta-thalassemia: phát hiện ba đột biến

thay thế mới trong vùng khởi động của gen. Ừm. Đột biến. 9, 465e472.

Mullis, KB, Faloona, FA, 1987. Tổng hợp cụ thể DNA in vitro thông qua phản ứng

dây chuyền được xúc tác polymerase. Phương pháp Enzymol 155, 335e350. Patrinos, GP, Kollia, P., Loutradi-Anagnostou, A., Loukopoulos, D., Papadakis,

MN, 1998. Kiểu Cretan về sự tồn tại di truyền không mất đoạn của huyết sắc

Muyzer, G., Smalla, K., 1998. Ứng dụng điện di gel gradient biến tính (DGGE) và tố bào thai [Agamma-158C->T] là kết quả của hai sự kiện chuyển đổi gen độc

điện di gel gradient nhiệt độ (TGGE) trong hệ sinh thái vi sinh vật. Con lập. Ừm. Genet. 102, 629e634.

kiến. Văn Leeuwenhoek 73, 127e141. Patrinos, GP, Kollia, P., Papapanagiotou, E., Loutradi-Anagnostou, A.,

Myers, RM, Fischer, SG, Lerman, LS, Maniatis, T., 1985a. Gần như tất cả các sự Loukopoulos, D., Papadakis, MN, 2001. Agamma-haplotypes: một nhóm dấu hiệu

thay thế bazơ đơn lẻ trong các đoạn DNA được nối với kẹp GC có thể được di truyền mới cho các đột biến thalassemia bên trong quy định 5' vùng của

phát hiện bằng cách điện di trên gel gradient biến tính. Axit nucleic Res. gen Agamma-globin ở người. Là. J. Hem đảo san hô. 66, 99e104.

13, 3131e3145.

Myers, RM, Lumelsky, N., Lerman, LS, Maniatis, T., 1985b. Phát hiện sự thay thế Patrinos, GP, Kollia, P., Papadakis, MN, 2005. Chẩn đoán phân tử bệnh thalassemia

bazơ đơn trong tổng số DNA bộ gen. Thiên nhiên 313, 495e498. và bệnh huyết sắc tố: từ phân tích RFLP đến mảng vi mô. Ừm. Đột biến. 26,

399e412.

Myers, RM, Maniatis, T., Lerman, LS, 1987. Phát hiện và định vị các thay đổi Paul, P., Letteboer, T., Gelbert, L., Groden, J., White, R., Coppes, MJ, 1993.

bazơ đơn lẻ bằng cách biến tính điện di trên gel gradient. Đột biến APC exon 15 giống hệt nhau dẫn đến một loại pheno khác nhau trong

Phương pháp Enzymol. 155, 501e527. bệnh đa nang tuyến gia đình. Ừm. Mol. Genet. 2, 925e931.

Nair, S., Lin, TK, Pang, T., Altwegg, M., 2002. Đặc tính của huyết thanh

Salmonella bằng phân tích đa hình thái cấu trúc chuỗi đơn PCR. J. Lâm Peters, T., Schlayer, HJ, Hiller, B., Rösler, B., Blum, H., Rasenack, J., 1997.

sàng. Vi sinh vật. 40, 2346e2351. Phân tích quasispecies trong nhiễm virus viêm gan C bằng đa hình hình dạng

Newton, CR, Graham, A., Heptinstall, LE, Powell, SJ, Summers, C., Kalsheker, N., sợi đơn huỳnh quang. J. Virus. Phương pháp 64, 95e102.

Smith, JC, Markham, AF, 1989. Phân tích bất kỳ đột biến điểm nào trong DNA.

Hệ thống đột biến chịu lửa khuếch đại (ARMS). Axit nucleic Res. 17, 2503e2516. Peters, H., Hess, D., Fahsold, R., Schulke, M., 1999. Một đột biến mới L1425P ở

vùng GAP của gen NF1 được phát hiện bằng phương pháp điện di trên gel

Nichols, WC, Liepieks, JJ, McKusick, VA, Benson, MD, 1989. gradient nhiệt độ (TGGE). Đột biến trong ngắn gọn không. 230. Trực tuyến.

Giải trình tự trực tiếp gen của bệnh đa dây thần kinh dạng amy gia đình Ừm. Đột biến. 13, 337.

Maryland/Đức loại II và kiểu gen bằng cách khuếch đại enzyme đặc hiệu của Pignon, JM, Vinatier, I., Fanen, P., Jonveaux, P., Tournilhac, O., Imbert, M.,

alen. Bộ gen 5, 535e540. Rochant, H., Goossens, M., 1994. Phân tích toàn diện trình tự mã hóa gen

Nickerson, DA, Kaiser, R., Lappin, S., Stewart, J., Hood, L., Landegren, U., P53 bởi Điện di gel gradient biến tính: ứng dụng để phát hiện đột biến

1990. Chẩn đoán DNA tự động bằng xét nghiệm thắt oligonucleotide dựa trên điểm trong bệnh bạch cầu cấp tính. Ừm. Đột biến. 3, 126e132.

ELISA. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 87, 8923e8927.

Pirastu, M., Kan, YW, Cao, A., Conner, BJ, Teplitz, RL, Wallace, RB, 1983. Chẩn

Nishimura, DY, Purchio, AF, Murray, JC, 1993. Liên kết nội địa hóa của TGFB2 và đoán trước sinh bệnh b-thalassemia: phát hiện một đột biến nucleotide đơn

gen homeobox HLX1 của con người với nhiễm sắc thể 1q. trong DNA. N. Anh. J. Med. 309, 284e287.

Bộ gen 15, 357e364.

Nowaczyk, MJ, Nakamura, LM, Eng, B., Porter, FD, Waye, JS, 2001. Pritchard, CE, Southern, EM, 1997. Ảnh hưởng của sự không phù hợp cơ sở đối với

Tần suất và sự phân bố dân tộc của đột biến DHCR7 phổ biến trong hội chứng sự nối các oligodeoxynucleotide ngắn bằng các dây chằng DNA. Axit nucleic

Smith-Lemli-Opitz. Là. J. Med. Genet. 102, 383e386. Res. 25, 3403e3407.

Machine Translated by Google

38 Chẩn đoán phân tử

Quintanar, A., Jallu, V., Legros, Y., Kaplan, C., 1998. Xác định kiểu gen kháng phân tích đa hình dạng sợi của các sản phẩm phản ứng chuỗi polymerase. Gen

nguyên tiểu cầu ở người bằng kỹ thuật SSCP huỳnh quang với trình tự sắp xếp gây ung thư 5, 1037e1043.

tự động. Anh. J. Haematol. 103, 437e444. Tannous, BA, Verhaegen, M., Christopoulos, TK, Kourakli, A., 2003.

Robinson, PN, Booms, P., Katzke, S., Ladewig, M., Neumann, L., Palz, M., Pregla, Kết hợp các phản ứng phát quang hóa học kiểu flash và phát sáng để tạo kiểu

R., Tiecke, F., Rosenberg, T., 2002. Đột biến của FBN1 và mối tương quan gen thông lượng cao của đa hình song song. Hậu môn. Hóa sinh. 320, 266e272.

kiểu gen-kiểu hình trong hội chứng Marfan và các bệnh lý fibrillinopathies

liên quan. Ừm. Đột biến. 20, 153e161. Tiecke, F., Katzke, S., Booms, P., Robinson, PN, Neumann, L.,

Rommens, J., Kerem, BS, Greer, W., Chang, P., Tsui, LC, Ray, P., 1990. Phát hiện Godfrey, M., Mathews, KR, Scheuner, M., Hinkel, GK, Brenner, RE, Hövels-

nhanh chóng đột biến xơ nang chính bằng phương pháp không phóng xạ. Là. J. Gürich, HH, Hagemeier, C., Fuchs, J., Skovby, F., Rosenberg, T., 2001. Hội

Hừm. Genet. 46, 395e396. chứng Marfan cổ điển, nghiêm trọng không điển hình và sơ sinh: 12 đột biến

Rossetti, S., Corra, S., Biasi, MO, Turco, AE, Pignatti, PF, 1995. và mối tương quan kiểu hình-kiểu gen ở FBN1 exon 24e40. Euro. J. Hừm. Genet.

So sánh các phân tích cấu trúc dị thể và chuỗi đơn, sau đó là hiển thị huỳnh 9 (1), 13e21.

quang ethidium, để phát hiện các đột biến ở bốn gen của con người. Mol. Tế Tominaga, T., 2007. Xác định nhanh các loại trình tự đa locus của Listeria

bào. Đầu dò 9, 195e200. monocytogenes bằng điện di gel gradient nhiệt độ vi mô. J. Vi sinh vật.

Saiki, RK, Scharf, S., Faloona, F., Mullis, KB, Horn, GT, Erlich, HA, Arnheim, Phương pháp 70, 471e478.

N., 1985. Khuếch đại enzyme các chuỗi b globin và phân tích vị trí hạn chế Top, B., 1992. Một phương pháp đơn giản để gắn kẹp GC 50-bp phổ biến vào các đoạn

để chẩn đoán bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm. Khoa học 230, 1350e1354. PCR được sử dụng để phân tích đột biến bởi DGGE. Ứng dụng phương pháp PCR.

2, 83e85.

Saiki, RK, Bugawan, TL, Horn, GT, Mullis, KB, Erlich, HA, 1986. Tully, LA, Parsons, TJ, Steighner, RJ, Holland, MM, Marino, MA, Prenger, VL,

Phân tích DNA b-globin và HLA-DQa được khuếch đại bằng enzyme với các đầu dò 2000. Xét nghiệm điện di gradient-gel biến tính nhạy cảm cho thấy tần số dị

oligonucleotide đặc hiệu với alen. Bản chất 324, 163e166. hợp tử cao ở vùng 1 có thể điều chỉnh được của mtDNA ở người vùng đất. Là.

Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S., Scharf, SJ, Higuchi, R., Horn, GT, Mullis, J. Hừm. Genet. 67, 432e443.

KB, Erlich, HA, 1988a. Khuếch đại DNA bằng enzyme hướng mồi với DNA

polymerase chịu nhiệt. Uhrberg, M., Hinney, A., Enczmann, J., Wernet, P., 1994. Phân tích locus gen HLA-

Khoa học 239, 487e491. DR bằng phương pháp điện di trên gel gradient nhiệt độ và ứng dụng của nó để

Saiki, RK, Chang, C.-A., Levenson, CH, Warren, TC, Boehm, CD, Kazazian Jr., HH, lựa chọn nhanh chóng các chất làm tủy xương không liên quan. Điện di 15,

Erlich, HA, 1988b. Chẩn đoán bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm và bệnh β- 1044e1050.

thalassemia bằng DNA được khuếch đại bằng enzyme và các đầu dò oligonucleotide van Elsas, JD, Garbeva, P., Salles, J., 2002. Ảnh hưởng của các biện pháp nông

đặc hiệu với alen không phóng xạ. N. Anh. J. Med. 319, 537e541. học đến sự đa dạng của vi sinh vật trong đất liên quan đến việc ngăn chặn

mầm bệnh thực vật truyền qua đất. Phân hủy sinh học 13, 29e40.

Saiki, RK, Walsh, PS, Levenson, CH, Erlich, HA, 1989. Di truyền học Wang, YH, Barker, P., Griffith, J., 1992. Hình dung các DNA dị hợp chẩn đoán từ

phân tích DNA khuếch đại bằng các đầu dò oligonucleotide đặc hiệu theo trình các dị hợp tử loại bỏ bệnh xơ nang cung cấp ước tính về độ xoắn của DNA

tự cố định. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 86, 6230e6234. bằng các bazơ phình ra. J. Biol.

Sainz, J., Huynh, DP, Figueroa, K., Ragge, NK, Baser, ME, Pulst, SM, 1994. Đột Chem. 267, 4911e4915.

biến của bệnh u xơ thần kinh Ch06.qxd 4/9/ 05 3:40 chiều Trang 64 gen loại 2 Watanabe, T., Saito, A., Takeuchi, Y., Naimuddin, M., Nishigaki, K., 2002. Cơ sở

và thiếu sản phẩm gen trong u bao sợi thần kinh tiền đình. Ừm. Mol. Genet. dữ liệu để xác định tạm thời các loài chỉ sử dụng kiểu gen: hồ sơ bộ gen dựa

3, 885e891. trên web. Bộ gen Biol. 3 (2).

Sarkar, G., Yoon, HS, Sommer, SS, 1992. Sàng lọc các đột biến bằng đa hình cấu NGHIÊN CỨU0010.

trúc chuỗi đơn RNA (rSSCP): so sánh với DNA-SSCP. Axit nucleic Res. 20, Waye, JS, Nakamura, LM, Eng, B., Hunnisett, L., Chitayat, D., Costa, T., Nowaczyk,

871e878. MJ, 2002. Hội chứng Smith-Lemli-Opitz: tần số sóng mang và phổ của các đột

Sheffield, VC, Cox, DR, Lerman, LS, Myers, RM, 1989. Việc gắn trình tự giàu G þ biến DHCR7 ở Canada .

C gồm 40 cặp bazơ (GC-kẹp) vào các đoạn DNA bộ gen bằng phản ứng chuỗi J. Med. Genet. 39, e31.

polymerase giúp cải thiện khả năng phát hiện của những thay đổi cơ sở đơn White, MB, Carvalho, M., Derse, D., O'Brien, SJ, Dean, M., 1992.

lẻ. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 86, 232e236. Phát hiện sự thay thế bazơ đơn dưới dạng đa hình dị hình.

Bộ gen 12, 301e306.

Shen, MH, Harper, PS, Upadhyaya, M., 1993. Neurofibromatosis type 1 (NF1): tìm Wiese, U., Wulfert, M., Prusiner, SB, Riesner, D., 1995. Quét các đột biến trong

kiếm các đột biến bằng phân tích PCRheteroduplex trên gel Hydrolink. Ừm. khung đọc mở protein prion của con người bằng phương pháp điện di trên gel

Mol. Genet. 2, 1861e1864. gradient nhiệt độ thời gian. Điện di 16, 1851e1860.

Sommer, SS, Cassady, JD, Sobell, JL, Bottema, CD, 1989. Một phương pháp mới để

phát hiện đột biến điểm hoặc đa hình và ứng dụng của nó để sàng lọc dân số Wood, N., Tyfield, L., Bidwell, J., 1993a. Phân loại nhanh các kiểu gen

đối với người mang bệnh phenylketon niệu. phenylketonuria bằng cách phân tích các dị thể được tạo ra bởi DNA tổng hợp

Phòng khám Mayo. Proc. 64, 1361e1372. có thể khuếch đại PCR. Ừm. Đột biến. 2, 131e137.

Stoerker, J., Hurwitz, C., Rose, NC, Silberstein, LE, Highsmith, WE, 1996. Máy Wood, N., Standen, G., Hows, J., Bradley, B., Bidwell, J., 1993b. Chẩn đoán bệnh

tạo dị thể trong phân tích các alen nhóm máu Rh. hồng cầu hình liềm bằng máy tạo song công đa năng.

Phòng khám. Chem. 42, 356e360. Mũi chích 342, 1519e1520.

Suzuki, Y., Orita, M., Shiraishi, M., Hayashi, K., Sekiya, T., 1990. Wood, N., Standen, GR, Murray, EW, Lillicrap, D., Holmberg, L., Peake, IR,

Phát hiện đột biến gen ras trong bệnh ung thư phổi ở người bằng phương pháp đơn lẻ Bidwell, J., 1995. Phân tích nhanh kiểu gen ở loại 2B von
Machine Translated by Google

Các phương pháp phát hiện biến thể thông lượng thấp và trung bình: Chương về góc nhìn lịch sử | 3 39

Bệnh Willebrand sử dụng máy phát song công đa năng. Anh. J. Zhang, Y., Coyne, MY, Will, SG, Levenson, CH, Kawasaki, ES, 1991. Phân tích

Huyết sắc tố. 89, 152e156. đột biến bazơ đơn của bệnh ung thư và các bệnh di truyền bằng cách sử

Wu, DY, Wallace, RB, 1989. Phản ứng khuếch đại thắt (LAR) e khuếch đại các dụng oligonucleotide biến đổi gắn màng. Axit nucleic Res. 19, 3929e3933.

chuỗi DNA cụ thể bằng cách sử dụng các vòng thắt phụ thuộc vào mẫu tuần

tự. Bộ gen 4, 560e569. Zhang, HD, Zhou, J., Xu, ZR, Song, J., Dai, J., Fang, J., Fang, ZL, 2007. Phát

Wu, DY, Ugozzoli, L., Pal, BK, Wallace, RB, 1989. Khuếch đại enzyme đặc hiệu hiện đột biến DNA bằng phương pháp điện di mao quản gradient nhiệt độ dựa

cho alen của DNA bộ gen beta-globin để chẩn đoán bệnh thiếu máu hồng cầu trên chip sử dụng phương pháp gia nhiệt bức xạ theo chiều xiên hệ thống.

hình liềm. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 86, 2757e2760. Phòng thí nghiệm. Chip 9, 1162e1170.

Xiao, W., Oefner, PJ, 2001. Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao: một bài đánh Zhong, XB, Reynolds, R., Kidd, JR, Kidd, KK, Jenison, R., Marlar, RA, Ward,

giá. Ừm. Đột biến. 17, 439e474. DC, 2003. Kiểu gen đa hình đơn nucleotide trên chip cảm biến sinh học

Yap, EP, McGee, JO, 1992. SSCP không đồng vị và PCR cạnh tranh để định lượng màng mỏng quang học. Proc. Natl. Học viện. Khoa học.

DNA: tế bào ung thư vú p53in.NucleicAcidsRes. 20, 145. Hoa Kỳ 100, 11559e11564.

Yoshino, K., Nishigaki, K., Husimi, Y., 1991. Điện di trên gel quét nhiệt độ:

một phương pháp đơn giản để phát hiện đột biến điểm. Axit nucleic Res.

19, 3153.