Machine Translated by Google

Bioprocess Biosyst Eng (2011) 34:789–793 DOI

10.1007/s00449-011-0527-x

BẢN GỐC

Sản xuất nattokinase bằng nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis mật
độ tế bào cao

Eun-Yeong Kwon • Kyung Mi Kim •

Bấm Download để lưu lại Mi Kyoung Kim - In Young Lee mp3 youtube com

Nhận: 15 tháng 1 năm 2011 / Chấp nhận: 10 tháng 2 năm 2011 / Xuất bản trực tuyến: 20 tháng 2 năm 2011
Springer Verlag 2011

Tóm tắt Bacillus subtilis được nuôi cấy ở mật độ tế bào cao để trong đó quan trọng nhất là chi Bacillus từ thực phẩm lên men

sản xuất nattokinase bằng phương pháp nuôi cấy theo mẻ có độ pH- truyền thống [4]. Dựa vào nguồn gốc thực phẩm và hoạt tính tiêu

stat. Dung dịch hỗn hợp đậm đặc gồm glucose và peptone được tự sợi huyết tương đối mạnh, nattokinase có ưu điểm hơn các loại

động thêm vào bằng bơm cung cấp axit khi pH nuôi cấy tăng trên thuốc thương mại khác về tác dụng phòng ngừa và kéo dài, dùng

giới hạn cao. Ảnh hưởng của tỷ lệ glucose và peptone trong dung đường uống thuận tiện và ổn định trong đường tiêu hóa [5].

dịch thức ăn đã được nghiên cứu đến sự phát triển của tế bào và

sản xuất nattokinase bằng cách thay đổi tỷ lệ từ 0,2 đến 5 g Các chất tiêu sợi huyết tiêm tĩnh mạch như urokinase và chất

glucose/g peptone. Nồng độ tế bào cao nhất là 77 g/L khi tỷ lệ kích hoạt plasminogen mô đã được sử dụng rộng rãi trong thực

là 0,2 g glucose/g pepton. Nồng độ tế bào giảm khi tăng tỷ lệ hành lâm sàng để điều trị tiêu huyết khối. Các enzym tiêu sợi

glucose và peptone trong dung dịch cho ăn, trong khi vẫn tồn tại huyết vi sinh vật hiện nay đã thu hút được nhiều sự chú ý hơn

điều kiện tối ưu để sản xuất nattokinase. các chất tiêu huyết khối điển hình vì giá thành đắt đỏ và những
tác dụng phụ không mong muốn của chúng [4].

Hoạt tính nattokinase cao nhất là 14.500 đơn vị/mL với tỷ lệ Nuôi cấy liên tục bằng cách kiểm soát việc cung cấp chất dinh

0,33 g glucose/g peptone, cao gấp 4,3 lần so với nuôi mẻ. dưỡng là một trong những phương pháp phổ biến nhất để đạt được

mật độ tế bào cao, điều này thường cần thiết để có năng suất và

khả năng sản xuất cao của sản phẩm mong muốn [6]. Đã có nhiều

Từ khóa Nattokinase Bacillus subtilis báo cáo về việc sử dụng nuôi cấy theo mẻ mật độ tế bào cao thuộc

Nuôi cấy theo mẻ Nuôi cấy mật độ tế bào cao loại hoang dã và các chủng tái tổ hợp chứa gen để sản xuất các

sản phẩm sinh học khác nhau [7, 8].

Chiến lược cho ăn dinh dưỡng trong nuôi cấy theo mẻ bao gồm các
Giới thiệu phương pháp phản hồi gián tiếp đơn giản như pH-stat [9, 10] hoặc

DO-stat [11], chiến lược cho ăn được xác định trước (cho ăn theo

Nattokinase là một enzyme tiêu sợi huyết mạnh được coi là một cấp số nhân) [12, 13], cho ăn theo glucose hấp thu hoặc nhu cầu

tác nhân đầy hứa hẹn trong điều trị huyết khối [1]. [14], và các phương pháp khác.

Các enzym được phát hiện từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn như Gần đây, thành phần môi trường lên men tối ưu để sản xuất

natto Nhật Bản [1], nước tương Chungkook-jang Hàn Quốc [2], Doen- nattokinase bởi Bacillus subtilis đã được thiết kế bằng cách sử

jang Hàn Quốc [3], và các vi sinh vật khác nhau, dụng phương pháp thống kê, ví dụ: thiết kế thí nghiệm giai thừa

và phương pháp bề mặt phản ứng [5, 15, 16]. Chúng tôi đã nghiên

cứu ảnh hưởng của loại và nồng độ môi trường phức tạp đến việc

E.-Y. Kwon BS Kim (&) sản xuất nattokinase của B. subtilis [17]. Với thành phần môi

Khoa Kỹ thuật Hóa học, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju trường được tối ưu hóa, chúng tôi đã theo dõi động học lên men
361-763, Chungbuk, Hàn Quốc e-mail: bskim@chungbuk.ac.kr theo mẻ và nhận thấy rằng

Việc sản xuất nattokinase có liên quan đến tăng trưởng [17].

K. M. Kim M. K. Kim I. Y. Lee DMJ Tuy nhiên, quá trình lên men mật độ tế bào cao của B. subtilis

Biotech Corp, Yeongi 339-824, Chungnam, Korea chưa được thực hiện để cải thiện hoạt động của nattokinase. Trong này

123
Machine Translated by Google

790 Bioprocess Biosyst Eng (2011) 34:789–793

Trong nghiên cứu, B. subtilis được nuôi cấy ở mật độ tế bào cao máy sấy đông lạnh (Ilsin, Hàn Quốc). Nồng độ glucose được xác

để tăng sản xuất nattokinase bằng nuôi cấy theo mẻ có pH-stat định bằng cách sử dụng Glucose E-kit (YD Diagnostics, Korea).

sử dụng giới hạn cao. Ảnh hưởng của tỷ lệ glucose và peptone Hoạt tính Nattokinase được đo bằng cách điều chỉnh xét nghiệm

trong dung dịch thức ăn cũng được nghiên cứu đến sự phát triển phân hủy ibrin do JBSL (Công ty TNHH Phòng thí nghiệm Khoa học

của tế bào và sản xuất nattokinase. Sinh học Nhật Bản) phát triển [17]. Đầu tiên, 0,1 mL dung dịch

enzyme pha loãng được thêm vào 0,3 ml dung dịch đệm Tris–HCl 0,1

M (pH 7,8) chứa 10 mM CaCl2 và ủ trước ở bể nước 30 C trong 5

Nguyên liệu và phương pháp phút. Sau đó, thêm 0,3 ml dung dịch ibrin 1,2% và ủ ở 30 C
trong 10 phút.

Sinh vật và phương tiện truyền thông Sau khi ủ, 0,6 mL axit trichloroacetic 0,11 M chứa natri axetat

0,22 M và axit axetic 0,33 M được thêm vào để ngăn chặn phản ứng

Bacillus subtilis được lấy từ DMJ Biotech Corp. enzyme. 0,3 mL dung dịch ibrin 1,2% cũng được thêm vào đối

(Hàn Quốc). Nó được duy trì trên môi trường TGY: tryptone, 10 g/ chứng âm tính. Hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/

L; cao nấm men 5 g/L; NaCl, 10 g/L; và thạch, 15 g/L. phút trong 5 phút.

Môi trường nuôi cấy trong bình là: glucose, 0–100 g/L; pepton Sau đó, 0,5 mL chất nổi phía trên được thu thập và trộn với 1,25

(Ventech Bio, Hàn Quốc), 50 g/L; NH4Cl, 3 g/L; K2HPO4, 1 g/L; mL dung dịch Na2CO3 0,55 M và 0,25 mL thuốc thử Folin (Sigma,

MgSO47H2O, 2 g/L; MnSO47H2O, 0,02 g/L; FeSO47H2O, 0,05 g/L; St. Louis, MO). Sau khi ủ ở 30 C trong 30 phút, đo độ hấp thụ ở

CoCl26H2O, 0,01 g/L; CaCl22H2O, 5 g/L; và ZnCl2 là 0,01 g/L. Môi bước sóng 660 nm.

trường nuôi cấy theo mẻ giống như môi trường nuôi cấy trong bình Một đơn vị hoạt tính nattokinase được định nghĩa là lượng enzyme

với glucose 10 g/L. Glucose và MgSO47H2O được hấp khử trùng cần thiết để tạo ra 1 lg tyrosine/phút.

riêng biệt và thêm vào môi trường một cách vô trùng. Dung dịch

dinh dưỡng trong nuôi cấy mẻ là hỗn hợp glucose và peptone với

tỷ lệ 0,2–5 g glucose/g peptone (tổng cộng 800 g) trong 1 L dung kết quả và thảo luận

dịch.
Nuôi cấy bình

Canh tác

Đầu tiên, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc (100–300
Nuôi cấy bình được thực hiện trong bình 250 mL với vòng/phút) đến việc sản xuất nattokinase trong nuôi cấy bình.

thể tích làm việc là 50 mL để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Hoạt tính nattokinase thu được sau 12 giờ lần lượt là 400, 680

glucose ban đầu và tốc độ lắc lên sự phát triển của tế bào và và 530 đơn vị/mL ở tốc độ 100, 200 và 300 vòng/phút, khi nồng độ

sản xuất nattokinase. Tế bào được nuôi dưỡng trong điều kiện ban đầu của glucose và peptone lần lượt là 10 và 50 g/L. Do hoạt

hiếu khí ở 37°C trong tủ ấm lắc với tốc độ 100–300 vòng/phút. tính natto-kinase cao nhất đạt được ở tốc độ 200 vòng/phút nên
Nuôi cấy theo đợt Fed được thực hiện trong thiết bị lên men chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy tất cả các bình nuôi cấy ở điều

5 L (Kobiotech, Hàn Quốc). Nuôi cấy hạt giống được chuẩn bị kiện này sau đó. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [17],

trong bình 250 mL với thể tích làm việc 50 mL môi trường TGY chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của loại và nồng độ của ba

không có agar ở 37 C trên máy ấp lắc ở tốc độ 200 vòng/phút môi trường phức hợp (chiết xuất nấm men, peptone và tryptone)

trong 12 giờ. Hai trăm ml môi trường nuôi cấy hạt giống đã được lên sự phát triển của tế bào và sản xuất nattokinase.
sử dụng để cấy vào thiết bị lên men. Thể tích nuôi cấy ban đầu Từ dữ liệu nuôi cấy trong bình, hoạt tính nattokinase cao nhất

là 2 L. Nhiệt độ và độ pH được kiểm soát tương ứng ở 37 C và 7,0 thu được với 50 g/L bổ sung peptone. Không có peptone trong môi

bằng cách sử dụng HCl 5 N. Mức oxy hòa tan (DO) được kiểm soát trường, không phát hiện thấy hoạt động nattokinase. Deepak và

tự động ở mức 20% bằng cách thay đổi tốc độ khuấy trộn (500–900 cộng sự. [5] cũng báo cáo rằng peptone có tác động đáng kể đến

vòng/phút). Trong nuôi cấy mẻ, việc cho ăn được bắt đầu sau 5 việc sản xuất nattokinase của B. subtilis bằng cách sử dụng phân

giờ nuôi mẻ. Chiến lược cho ăn các chất dinh dưỡng là điều chỉnh tích tối ưu hóa môi trường thống kê.

pH sử dụng giới hạn cao.

Khi pH tăng trên 7,0, dung dịch dinh dưỡng được tự động thêm Ảnh hưởng của nồng độ glucose (0–100 g/L) đã được nghiên cứu

vào bằng bơm cung cấp axit. đến sự phát triển của tế bào và sản xuất nattokinase khi bổ sung

peptone 50 g/L (Hình 1, 2 ). Tăng trưởng tế bào và sản xuất

Phân tích nattokinase tăng lên tới 10 g/L bổ sung glucose. Ở điều kiện

này, OD cuối cùng được theo dõi ở bước sóng 600 nm và hoạt tính

Sự phát triển của tế bào được theo dõi bằng cách đo mật độ quang nattokinase lần lượt là 3,3 và 680 đơn vị/mL vào lúc 12 giờ.

(OD) của môi trường nuôi cấy ở bước sóng 600nm bằng máy đo Việc bổ sung glucose cao hơn (20–100 g/L) đã ức chế cả sự phát

quang phổ (Shimadzu 1650-PC, Nhật Bản). Nồng độ tế bào được xác triển của tế bào và sản xuất nattokinase. Ngay cả khi không có

định bằng trọng lượng tế bào khô được đo bằng glucose, OD

123
Machine Translated by Google

Bioprocess Biosyst Eng (2011) 34:789–793 791

tăng lên 2,5 và hoạt tính nattokinase đạt 125 đơn vị/mL sau 12 giờ do tiêu

thụ chất dinh dưỡng trong peptone. Vì sự tăng trưởng tế bào và hoạt tính

nattokinase cao nhất đạt được khi bổ sung glucose 10 g/L nên nồng độ

glucose này đã được sử dụng sau đó.

Nuôi cấy Fed-batch trong thiết bị lên men 5 L

Từ nuôi cấy trong bình, người ta thấy rằng nồng độ glucose và peptone ban

đầu tối ưu để sản xuất nattokinase lần lượt là 10 và 50 g/L. Ở điều kiện

này, nuôi cấy theo mẻ được thực hiện trong thiết bị lên men 5 L được kiểm

soát pH và DO [17]. Hoạt tính OD và nattokinase cao nhất lần lượt là 40

và 3.400 đơn vị/mL vào lúc 10 giờ. Người ta đã chứng minh rằng việc sản

xuất nattokinase có liên quan đến sự tăng trưởng và nên thu hoạch nuôi

cấy trước giai đoạn tĩnh để sản xuất nattokinase tối đa.
Hình 1 Sự phát triển tế bào theo thời gian của B. subtilis với nồng độ glucose
khác nhau trong nuôi cấy bình

Để đạt được hoạt tính nattokinase cao hơn bằng cách tăng nồng độ tế

bào, nuôi cấy theo mẻ được thực hiện bằng chiến lược cho ăn có độ pH-stat

với giới hạn cao. Năm đợt nuôi cấy theo mẻ được thực hiện bằng cách thay

đổi tỷ lệ glucose và peptone trong dung dịch cho ăn từ 0,2 đến 5 g glucose/

g peptone (Hình 3, 4, 5 , 6 , 7). Sau 5 giờ nuôi mẻ với nồng độ peptone

ban đầu là 50 g/L, việc cho ăn được bắt đầu vì glucose đã cạn kiệt. Do pH

nuôi cấy tăng lên cùng với mức tiêu thụ chất dinh dưỡng, hỗn hợp glucose

và peptone được tự động cung cấp bằng bơm cung cấp axit khi pH tăng trên

7,0. Hình 3 cho thấy các tiến trình thời gian của dữ liệu nuôi cấy theo mẻ

với tỷ lệ 0,2 g glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn. Sau khi cho ăn

dung dịch dinh dưỡng, nồng độ tế bào tiếp tục tăng lên tới 77 g/L sau 23
giờ. Hoạt tính nattokinase cao nhất là 11.000 đơn vị/mL lúc 21 giờ. Nồng

độ glucose được duy trì dưới 1 g/L sau khi cho ăn.

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến hoạt động của nattokinase lúc 12 giờ
Dữ liệu của các môi trường nuôi cấy theo mẻ khác (0,33, 1, 3 và 5 g
trong nuôi cấy trong bình
glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn) được trình bày trong

Hình 3 Nuôi cấy B. subtilis theo mẻ sử dụng chiến lược cho ăn pH-stat với tỷ lệ Hình 4 Nuôi cấy B. subtilis theo mẻ sử dụng chiến lược cho ăn pH-stat với tỷ lệ

0,2 g glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn trong thiết bị lên men 5 L 0,33 g glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn trong thiết bị lên men 5 L

123
Machine Translated by Google

792 Bioprocess Biosyst Eng (2011) 34:789–793

Hình 5 Nuôi cấy B. subtilis theo mẻ sử dụng chiến lược cho ăn có pH-stat với Hình 7 Nuôi cấy B. subtilis theo mẻ sử dụng chiến lược cho ăn có pH-stat với

tỷ lệ 1 g glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn trong thiết bị lên men 5 tỷ lệ 5 g glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn trong bình lên men 5 L
L

Hình 6 Nuôi cấy B. subtilis theo mẻ sử dụng chiến lược cho ăn có pH-stat với
tỷ lệ 2 g glucose/g peptone trong dung dịch cho ăn trong thiết bị lên men 5 Hình 8. Ảnh hưởng của tỷ lệ glucose và peptone trong dung dịch cho ăn đến
L
hoạt động tối đa của nattokinase trong thiết bị lên men 5 L

Quả sung. 4, 5, 6 và 7. Sự thay đổi nồng độ tế bào, hoạt động natto- Phạm vi hoạt động là 460–3.200 FU (hoạt tính tiêu sợi huyết)/mL.

kinase và nồng độ glucose theo thời gian tương tự như trong Hình 3, Chúng tôi đã kiểm tra với mẫu nattokinase chuẩn và xác nhận rằng

cho thấy việc sản xuất nattokinase liên quan đến tăng trưởng. Nồng hoạt tính nattokinase được xác định trong nghiên cứu này tương tự

độ tế bào và hoạt tính nattokinase thu được trong mỗi mẻ nuôi cấy như hoạt tính tiêu sợi huyết (18.000 đơn vị/mL tương ứng với 20.000

được tóm tắt trong Hình 8. Nồng độ tế bào cao nhất là 77 g/L khi tỷ FU/mL) [17].

lệ là 0,2 g glucose/g peptone. Nồng độ tế bào giảm khi tăng tỷ lệ Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc sản xuất nattokinase có

glucose và peptone trong dung dịch cho ăn, trong khi vẫn tồn tại thể tăng lên, không chỉ bằng cách tối ưu hóa môi trường mà còn bằng

điều kiện tối ưu để sản xuất nattokinase. Điều này chỉ ra rằng việc cách nuôi cấy theo mẻ với mật độ tế bào cao.

cung cấp peptone giàu chất dinh dưỡng sẽ thúc đẩy sự phát triển của Suzuki và cộng sự. [9] đã thảo luận rộng rãi về nền tảng hiện

tế bào nhưng việc bổ sung quá nhiều peptone sẽ ức chế quá trình sản tượng học và các ưu điểm của nuôi cấy theo mẻ có chỉ số pH bằng cách

xuất nattokinase. Hoạt tính nattokinase cao nhất là 14.500 đơn vị/ sử dụng điểm đặt có giới hạn cao. Ở các giai đoạn ổn định hoặc suy

mL với tỷ lệ 0,33 g glucose/g peptone, cao gấp 4,3 lần so với nuôi giảm sử dụng các nguồn nitơ-cacbon hữu cơ như peptone, tế bào tạo

cấy mẻ. ra một lượng nhỏ năng lượng để duy trì quá trình trao đổi chất cơ

bản của chúng, có thể là từ sự phân hủy các chất tích lũy trước bên

trong tế bào hoặc từ sự phân giải một phần của tế bào. Là kết quả

So với các báo cáo khác về sản xuất nattokinase, dữ liệu của của quá trình oxy hóa các hợp chất carbon để hình thành năng lượng

chúng tôi cho thấy mức độ hoạt động của nattokinase cao. Một số duy trì, các tế bào sẽ bài tiết lượng nitơ dư thừa dưới dạng NH4 ?,

nghiên cứu tối ưu hóa môi trường thống kê gần đây đã được thực hiện khiến độ pH tăng lên, cho thấy các chất nền có thể được cung cấp tự

để cải thiện việc sản xuất nattokinase [5, 15, 18]. động trong một liên kết

123
Machine Translated by Google
Bioprocess Biosyst Eng (2011) 34:789–793
với sự gia tăng độ pH bằng cách sử dụng giới hạn cao. Khi
nguồn carbon được tiêu thụ hết, DO thường tăng rõ rệt hơn sự
thay đổi độ pH. Khi sử dụng nhiều chất nền, mặc dù nồng độ
của chất nền năng lượng carbon trở thành 0, các tế bào vẫn có
thể tiếp tục phát triển bằng cách sử dụng nguồn nitơ-cacbon
phức tạp. Sự hấp thụ oxy vẫn tiếp tục và sự thay đổi DO không
phải lúc nào cũng lớn trong môi trường chứa nhiều cơ chất. Do
đó, chiến lược cho ăn bằng chỉ số pH sử dụng giới hạn cao sẽ
hiệu quả hơn phương pháp cho ăn bằng chỉ số DO khi sử dụng
nhiều chất nền như trường hợp của chúng tôi.
Tóm lại, nattokinase được sản xuất bằng nuôi cấy B.
subtilis trong bình và mẻ. Trong nuôi cấy bình, tốc độ lắc
tối ưu và nồng độ glucose ban đầu để sản xuất natto-kinase
lần lượt là 200 vòng/phút và 10 g/L.
Nuôi cấy theo mẻ có độ pH-stat sử dụng điểm đặt giới hạn cao
có hiệu quả để phát triển B. subtilis đến mật độ tế bào cao
lên tới 77 g/L. Sản lượng Nattokinase được cải thiện lên
14.500 đơn vị/mL từ 680 đơn vị/mL nuôi cấy trong bình và 3.400
đơn vị/mL nuôi cấy theo mẻ.
Lời cảm ơn Nghiên cứu này được Bộ Kinh tế Tri thức (MKE) và Viện Tiến bộ
Công nghệ Hàn Quốc (KIAT) hỗ trợ tài chính thông qua Chương trình Phát triển
Lực lượng lao động về Công nghệ Chiến lược.
Người giới thiệu
1. Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H (1987) Một loại enzyme
tiêu sợi huyết mới (nattokinase) trong phô mai thực vật Natto; một loại
thực phẩm đậu nành điển hình và phổ biến trong chế độ ăn của người Nhật.
Kinh nghiệm 43:1110–1111 2.
Kim W, Choi K, Kim Y, Park H, Choi J, Lee Y, Oh H, Kwon I, Lee S (1996)
Tinh chế và xác định đặc tính của enzyme tiêu sợi huyết được sản xuất
từ Bacillus sp. chủng CK 11-4 được sàng lọc từ Chungkook-Jang. Appl
Environ Microbiol 62:2482–2488 3. Kim SH, Choi NS (2000) Tinh
chế và xác định đặc tính của subtilisin DJ-4 do Bacillus sp. tiết ra. Chủng
DJ-4 được trình chiếu từ Doen-Jang. Biosci Biotechnol Biochem 64:1722–
1725 4. Peng Y, Yang X, Zhang Y (2005) Enzym tiêu sợi huyết
vi sinh vật: tổng quan về nguồn, sản xuất, đặc tính và hoạt động tiêu huyết
khối trong cơ thể. Appl Microbiol Công nghệ sinh học 69:126–132 5.
Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, Venkatesh Babu
S, Senthilkumar SR, Sangiliyandi G (2008) Tối ưu hóa
793
thành phần môi trường để sản xuất Nattokinase bởi Bacillus sub-tilis
bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Biores Technol 99:8170–8174 6. Kim BS
(2007) Kỹ thuật
nuôi cấy mật độ tế bào cao để sản xuất các sản phẩm công nghiệp. Trong:
Shaw JF, Hou CT (eds) Phân tích sinh học và công nghệ sinh học cho thực
phẩm chức năng và sản phẩm công nghiệp. CRC Press, Boca Raton, FL, trang
505–520 7. Shiloach J, Fass R (2005) Nuôi cấy E. coli đến
mật độ tế bào cao - một quan điểm lịch sử về phát triển phương pháp. Công
nghệ sinh học Adv 23:345–357
8. Choi JH, Keum KC, Lee SY (2006) Sản xuất protein tái tổ hợp bằng nuôi
cấy vi khuẩn Escherichia coli với mật độ tế bào cao. Chem Eng Sci 61:876–
885 9. Suzuki T,
Yamane T, Shimizu S (1990) Cơ sở hiện tượng học và một số thử nghiệm sơ bộ
về cung cấp chất nền tự động trong nuôi cấy theo mẻ theo phương thức pH-
stat sử dụng điểm đặt cao. J Ferment Bioeng 69:292–297
10. Kim BS (2002) Sản xuất polyhy-droxyalkanoates có chiều dài chuỗi trung
bình bằng nuôi cấy Pseudomonas oleovo-rans theo mẻ. Công nghệ sinh học
Lett 24:125–130
11. Kim JS, Lee BH, Kim BS (2005) Sản xuất poly(3-hydroxybutyrate-co-4-
hydroxybutyrate) bởi Ralstonia eutropha.
Biochem Eng J 23:169–174 12.
Kim BS, Lee SC, Lee SY, Chang YK, Chang HN (2004) Nuôi cấy Escherichia coli
theo mẻ với mật độ tế bào cao sử dụng phương pháp cho ăn theo cấp số
nhân kết hợp với chỉ số pH. Bioprocess Biosyst Eng 26:147–150
13. Kim BS, Hou CT (2006) Sản xuất lipase bằng nuôi cấy liên tục mật độ tế
bào cao của Candida cylindracea. Bioprocess Biosyst Eng 29:59–64 14.
Kim BS, Lee SC,
Lee SY, Chang HN, Chang YK, Woo SI (1994)
Sản xuất poly(3-hydroxybutyric acid) bằng nuôi cấy Alcaligenes eutrophus
theo mẻ với kiểm soát nồng độ glucose.
Biotechnol Bioeng 43:892–898 15.
Liu J, Xing J, Chang T, Ma Z, Liu H (2005) Tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng
để sản xuất nattokinase bởi Bacillus natto NLSSE bằng phương pháp thí
nghiệm thống kê. Proc Hóa sinh 40:2757–2762
16. Po TC, Chiang CJ, Chao YP (2007) Chiến lược tiếp cận ổn định sản xuất
nattokinase tái tổ hợp ở Bacillus subtilis. Bio-technol Prog 23:808–813
17. Cho YH, Song JY, Kim
KM, Kim MK, Lee IY, Kim SB, Kim HS, Han NS, Lee BH, Kim BS (2010) Sản xuất
nattokinase theo mẻ và cho ăn - Nuôi cấy hàng loạt Bacillus subtilis.
Công nghệ sinh học mới 27:341–346
18. Wang DS, Torng CC, Lin IP, Cheng BW, Liu HR, Chou CY (2006) Tối ưu hóa
quá trình dẫn truyền sản xuất nattokinase bằng phương pháp bề mặt đáp
ứng. J Quy trình thực phẩm Eng 29:22–35
123