Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate

KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME PROTEASE THU NHẬN TỪ BACILLUS

SUBTILIS CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE
Trần Hồng Thắng*, Trần Thị Duân Hải*, Nguyễn Huỳnh Thanh Phong*
Nguyễn Thị Tình*, Hồ Bảo Xuyên*, Nguyễn Văn Dũng*
TÓM TẮT
Thu nhận enzyme từ tế bào vi sinh vật cố định trong chất mang là một hướng mới trong
công nghệ sản xuất enzyme. Đề tài được thực hiện nhằm mục đích đánh giá khả năng sản xuất
enzyme protease từ tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis được cố định trong gel Alginate, đồng thời,
khảo sát một số điều kiện tinh sạch và hoạt động của enzyme protease thu nhận được từ các tế
bào được cố định. Kết quả của đề tài cho thấy nồng độ Alginate thích hợp với việc cố định tế bào
B. subtilis là 2%, thời gian nuôi cấy tế bào vi khu n được cố đ ào vi sinh vật cố
định sau 4 lần tái sử dụng, hoạt độ riêng enzyme protease giảm 50% hoạt tính. Enzyme protease
thu nhận được có hoạt độ riêng cao nhất khi được tinh sạch bằng dung môi Acetone và điều kiện
hoạt động t i ưu của enzyme protease là ở nhiệt độ 40oC và pH 7.
Từ khóa: tế bào cố định; protease; Bacillus subtilis; Alginate.
CHARACTERIZATION OF PROTEASE ACTIVITY FROM BACILLUS
SUBTILIS CELLS IMMOBILIZED IN ALGINATE GEL
ABSTRACT
Enzyme from immobilized cells is the new approach for enzyme production technology.
This paper aimed to evaluate the ability of enzyme production from Bacillus subtilis immobilized
in alginate beads and determine optimum conditions for enzyme activity. The results showed that
optimum concentration of alginate for immobilizing cells was 2% in 24h. Protease enzyme from
immobilized cells reduce 50% specific activity after 4 batches. Enzyme protease, purified by
acetone solvent show the highest activity. Optimum temperature and pH for enzyme activity is
40oC and pH 7.
Keywords: immobilized cell, protease, bacillus subtilis, alginate.
I. GIỚI THIỆU niger…(Lượng, 2004).
Protease là một trong những enzyme có định tế bà
nhiều ứng dụng rộng rãi phục vụ cho đời sống, đang đ
trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dệt đi m trong vi c lên men sản xuất protease. Vì
may, dược phẩm. Protease có thể thu nhận từ protease là một enzyme ngoại bào, nên có thể
các nguồn: thực vật, động vật và vi sinh vật. được áp dụng trong việc cố định tế bào. Bằng
Trong đó, vi sinh vật là nguồn cho protease cách cố định các tế bào vi khuẩn trong các chất
phong phú nhất. Một số loài vi sinh vật có khả nền, protease được sinh tổng hợp trong môi
năng tổng hợp protease như B. subtilis, B. trường nuôi cấy. Điều này làm cho quá trình
cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces sản xuất protease bằng các tế bào cố định ổn
rimosus và Aspergillus oryzae, Aspergillus định hơn trong thời gian dài, dễ dàng tinh sạch

*
Trường Đại học Công nghiệp TPHCM

108

được enzyme nằm chủ yếu trong môi
trường lỏng còn tế bào được giữ lại trong các
chất nền (Kumar và Takagi, 1999). Alginate
thường được sản xuất dưới dạng các dẫn xuất
của muối tan như sodium alginate, potassium
alginate. Khi các muối này được cho tiếp xúc
với các ion kim loại đa hóa trị như Ca2+, Zn2+,
Pb2+… các ion kim loại đa hóa trị sẽ thay thế
các ion ban đầu trong phân tử alginate hình
thành liên kết ngang giữa các lớp trong cấu
trúc mạng phân tử alginate và tạo thành cấu
trúc gel. Trong ngành công nghệ thực phẩm,
ion Ca2+ được sử dụng làm tác nhân tạo gel
alginate vì hầu hết ion còn lại có thể ảnh
hưởng không tốt đến sức khoẻ của người sử
dụng và có khả năng gây độc cho vi khuẩn,
nấm men (Nghĩa, 1996).
B. subtilis có khả năng tiết enzyme
protease trên môi trường nuôi cấy để phân giải
các chất dinh dưỡng có trong môi trường nhằm
cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi
chất. Để phát hiện và đánh giá khả năng hoạt
hóa của enzyme protease được tiết bởi B.
subtilis ta dùng môi trường gelatin nghèo chất
dinh dưỡng để kích thích chúng sản sinh
protease.
Mục tiêu của bài báo này nhằm đánh giá
khả năng sinh tổng hợp protease của chủng B.
subtillis tại phòng sinh hóa trên chất nền là gel
alginate được cố dịnh bằng dung dịch CaCl2.
II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Vi sinh vật
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được
cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Viện
Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường
Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí
Minh. Chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên
môi trường giữ giống có thành phần bao gồm
(trên 1L môi trường): cao thịt (10), peptone
(10), NaCl (5), dung dịch A (5ml), sacharose
(10), agar (20), thêm nước cất cho đủ 1L.
Thành phần dung dịch A bao gồm:
Tạp chí Đại học Công nghiệp
MgSO4.7H2O (1.15g), MnSO4.4H2O (0.28g),
được hòa tan trong 100mL nước cất.
Khảo sát khả năng sinh enzyme protease
Chủng Bacillus subtilis được tăng sinh
trong môi trường lỏng có thành phần cao thịt
(10g), peptone (10g), NaCl (5g), dung dịch A
(5ml), sacharose (10g), thêm nước cất đủ
1000ml. Chủng B. subtillis được nuôi cấy lắc
(120 vòng/phút) trong 24 giờ trong 100mL
môi trường tăng sinh. Sau khi tăng sinh, chủng
vi sinh vật được cấy điểm vào môi trường
gelatin và ủ ở 37oC trong 48 giờ để đánh giá
khả năng sinh tổng hợp enzyme protease
(Clarke, 1953). Mỗi chủng được cấy ra ba đĩa,
và đo đường kính vòng phân giải trong từ đĩa
để đánh giá khả năng sinh enzyme.
Cố định vi sinh vật bằng gel Alginate
100mL dung dịch tăng sinh B. subtillis
được nuôi cấy lắc trong 24 giờ, ly tâm 3000
vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, thu
sinh khối. Sinh khối tế bào B. subtillis được
rửa lại bằng KCl vô trùng, nước cất vô trùng
(lặp lại ba lần) và huyền phù toàn bộ sinh khối
với 100mL nước muối sinh lý đã hấp khử
trùng (Adinarayana, Jyothi, và Ellaiah, 2005).
Pha loãng 1mL dung dịch huyền phù tế
bào trong nước muối sinh lý vào 100mL môi
trường thu nhận protease bổ sung Sodium
Algiante ở nồng độ xác định. Toàn bộ hỗn hợp
được tạo hạt bằng dung dịch CaCl2 0,25M. Hạt
gel tạo thành được để ổn định trong dung dịch
CaCl2 trong 1 giờ rồi rửa lại bằng nước muối
sinh lý và nước cất vô trùng (ba lần). Các hạt
gel tạo thành được nuôi cấy lỏng lắc (120
vòng/phút) sử dụng môi trường thu nhận
protease trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm. Dịch tăng sinh thu nhận được sử dụng
cho các thí nghiệm sau.
Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào B.
subtillis cố định
Môi trường thu nhận protease (100mL)
được bổ sung chất mang Sodium Alginate ở
109
Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate
các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%, 4% và
5%) được hấp khử trùng (121oC và 1atm)
trong 30 phút. Môi trường tiệt trùng được bổ
sung huyền phù vi sinh vật và tạo hạt gel bằng
dung dịch CaCl2 0,25M.
Hình 1. Chủng B. subtilis nuôi trên đĩa
petri (trên) và được nhuộm gram (dưới).
Các hạt tế bào B. subtillis cố định được
nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) trong 24 giờ
ở nhiệt độ phòng. Mẫu B. subtillis tự do cũng
được nuôi cấy ở mốc thời gian trên. Enzyme
protease thu nhận được từ các thí nghiệm trên
được xác định hoạt độ dựa trên khả năng phân
giải casein. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần
110
và lấy giá trị trung bình.
Khảo sát độ rò rỉ tế bào từ hạt gel
Môi trường thu nhận protease (100mL)
được bổ sung chất mang Sodium Alginate ở
các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%, 4% và
5%) được hấp khử trùng (121oC và 1atm)
trong 30 phút. Môi trường tiệt trùng được bổ
sung huyền phù vi sinh vật và tạo hạt gel bằng
dung dịch CaCl2 0,25M.
Các hạt tế bào B. subtillis cố định được
nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) trong 24h ở
nhiệt độ phòng. Lọc bỏ hạt gel, thu lại dịch
lọc, dịch lọc được lọc thêm một lần nữa bằng
giấy lọc để loại bỏ thành phần gel Alginate bị
vỡ trong quá trình nuôi cấy. Sinh khối trong
dịch lọc được xác định bằng phương pháp sấy
đến khối lượng không đổi (Adinarayana et al.,
2005).
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme
protease của chủng B. subtillis cố định qua các
mẻ nuôi cấy
B. subtillis được cố định trong gel
alginate 2%, các hạt gel được đưa vào bình
môi trường thu nhận protease 100ml (mẻ 1),
sau 24 giờ tiến hành chuyển hạt gel từ mẻ 1
sang môi trường thu nhận mới (mẻ 2). Enzyme
protease trong môi trường cũ được thu nhận và
khảo sát hoạt tính protease và hàm lượng
protein. Tiếp tục thực hiện cho các mẻ sau cho
đến khi hoạt độ của mẻ cuối cùng bằng 50%
hoạt độ của mẻ 1.
Khảo sát điều kiện tinh sạch enzyme
protease
B. subtillis được cố định trong gel
alginate 2%, các hạt gel được đưa vào bình
môi trường thu nhận protease 100ml và nuôi
cấy trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được loại bỏ
hạt gel và ly tâm để thu dịch chiết enzyme.
Dịch chiết enzyme được kết tủa bằng cồn 96o
và Acetone ở 4oC theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3,
1:4 (Vdịch chiết:Vdung môi), lắc đều và để lạnh
trong 60 phút; ly tâm 6000 vòng/phút trong 10

phút. Loại bỏ dịch nổi và thu nhận kết tủa, kết
tủa được huyền phù bằng nước cất vô trùng.
Dịch thu được là dịch enzyme thô được đánh
giá hoạt độ protease và hàm lượng protein.
Khảo sát điều kiện hoạt động của
enzyme protease
Enzyme thô thu nhận từ quá trình tăng
sinh tế bào vi sinh vật cố định được khảo sát ở
các nhiệt độ (30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC)
và pH (6, 7, 8, 9) để tìm điều kiện hoạt động
tối ưu của enzyme này.
Xác định hoạt độ enzyme protease theo
Anson
Hoạt độ protease được xác định dựa trên
khả năng phân giải protein (casein) của
protease. Dịch enzyme (1mL) được cho phản
ứng với 5mL dung dịch casein 1% trong thời
gian 30 phút ở nhiệt độ 35oC. Sau 30 phút,
ngừng phản ứng enzyme bằng 10mL dung
dịch TCA 5% và đem lọc thu dịch. Dịch lọc
thu được (2mL) được bổ sung 0,5mL thuốc
thử Folin và đem đo mật độ quang ở bước
sóng 720nm. Dựa vào đường chuẩn tyrosine
(dung dịch tyrosine chuẩn 20mM) để xác định
lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm
được thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Hoạt độ của enzyme được biểu diễn bằng đơn
vị hoạt độ enzyme protease. Một đơn vị hoạt
độ enzyme protease là lượng enzyme trong
một phút ở 300C có khả năng phân giải protein
tạo thành sản phẩm hòa tan trong acid
tricloacetic, có độ hấp thụ quang ở bước sóng
720nm tương đương với 1µmol tyrosine
(Cupp-Enyard, 2008). Các thí nghiệm được
thực hiện ba lần và tính giá trị trung bình.
Xác định hàm lượng protein theo
Bradford
Hàm lượng protein trong mẫu được xác
định bằng phương pháp Bradford dựa trên sự
thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm Comassie Brilliant Blue khi tạo phức
hợp với protein. Dịch mẫu (1mL) được bổ
sung thêm 5mL thuốc nhuộm Comassie
Tạp chí Đại học Công nghiệp
Brilliant Blue và đem đo mật độ quang ở bước
song 595nm. Dựa vào đường chuẩn protein
(dung dịch Albumin chuẩn 0,1%) để xác định
hàm lượng Albumin tương ứng với lượng
protein có trong dịch mẫu (Kruger, 1994). Các
thí nghiệm được thực hiện ba lần và lấy giá trị
hoạt độ trung bình.
Xử lý số liệu thống kê
Các số liệu được xử lý theo phương pháp
phân tích phương sai ANOVA.
III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Khả năng phân giải protein của chủng B.
subtillis
Vòng phân giải gelatin nhằm định tính
khả năng phân giải protein của chủng
B.subtilis. Sau 48 giờ ủ và tiến hành thử bằng
thuốc thử HgCl2 thu được đường kính trung
bình của vòng phân giải là 3cm. Từ kết quả
này cho thấy chủng B. subtilis của chúng tôi có
khả năng phân giải protein gelatin trên môi
trường bán rắn. Vòng phân giải có đường kính
trung bình khoảng 3cm, trong khi khuẩn lạc
chỉ nằm ngay giữa đĩa petri, điều này cho thấy
chủng B. subtilis cần một cơ chế để có thể sử
dụng gelatin ở môi trường ngoại bào, một
trong các cơ chế đó chính là khả năng tiết ra
các enzyme ngoại bào đặc trưng của chủng B.
subtilis trong đó có enzyme protease.
Như vậy qua các vòng phân giải trên
môi trường gelatine có thể xác nhận khả năng
sinh tổng hợp protease của chủng B. subtillis.
Hình 2. Vòng phân giải gelatin của
chủng Bacillus subtilis.
111
Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate

Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào B.

subtillis cố định
Để đánh giá độ ổn định của hạt gel
alginate, tế bào vi khuẩn B. subtillis được cố
định ở các nồng độ alginate khác nhau (1, 2, 3,
4 và 5%) và nuôi cấy trong môi trường cảm
ứng sinh enzyme protease trong 24 giờ. Khối
lượng sinh khối khô và hoạt độ riêng của
enzyme protease ở các khoảng thời gian khác
nhau. Kết quả ở Hình 3 cho thấy nồng độ
alginate sử dụng cho việc cố định tế bào vi
khuẩn có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh Hình 3. Hoạt độ riêng protease (UI/mg)
tổng hợp enzyme protease và mức độ rò rỉ của của enzyme protease theo nồng độ Alginate và
tế bào ra môi trường. Từ các dữ liệu cho thấy mức độ rò rỉ tế bào ở 24h.
protease thu nhận từ chủng B. subtillis cố định
Kết quả này là phù hợp so với một số
có hoạt độ cao nhất ở nồng độ Alginate 2%
nghiên cứu trước đây, (Zoe và cộng sự ,2006)
sau 24 giờ nuôi trong môi trường sinh tổng
đã sử dụng alginate nồng độ từ 2% đến 3,5%
hợp protease đạt (27.458 UI/mg) và giảm dần
để cố định B. subtillis sinh tổng hợp amylase
ở các nồng độ alginate khác (3%, 4% và 5%).
cao gấp 2,5 lần amylase thu nhận từ các chủng
Điều này cho thấy khi tăng dần nồng độ
tự do (Konsoula và Liakopoulou-Kyriakides,
alginate sẽ làm giảm cấu trúc xốp của hạt gel,
2006). Đồng thời, nghiên cứu của Adinarayana
từ đó giới hạn khả năng cung cấp dinh dưỡng
và cộng sự (2004) cũng thu nhận được kết quả
và khả năng khuếch tán của oxy từ môi trường
tương từ nhưng ở nồng độ alginate tối ưu thu
tới tế bào vi sinh vật. Như vậy nồng độ 2% của
nhận được là 3% (Adinarayana, Bapi Raju và
Alginate là tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp
Ellaiah, 2004).
protease của chủng B. subtillis cố định.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme
Mức độ rò rỉ tế bào từ hạt gel Alginate
protease của chủng B. subtillis cố định qua các
được thể hiện trong Hình 3, độ rò rỉ tế bào sẽ
mẻ nuôi cấy
giảm dần khi ta tăng dần nồng độ alginate từ
1% lên 5%. B. subtillis được cố định trong gel Chủng B. subtillis cố định được nuôi cấy
Alginate không hoàn toàn nằm sâu bên trong thu nhận enzyme protease theo mẻ (24 giờ cho
hạt mà sẽ có một lượng tế bào nằm gần lớp vỏ mỗi mẻ) ở nồng độ alginate tối ưu. Kết quả thu
alginate có cấu trúc lỗ xốp, vì vậy lượng B. nhận được cho thấy hoạt độ riêng của enzyme
subtilis nằm gần bên ngoài sẽ có khả năng protease thu nhận được giảm dần theo từng
thoát ra khỏi hạt gel. Vì vậy, khi nồng độ mẻ, và đến mẻ thứ 4, hoạt độ riêng (11,359
alginate càng thấp thì số lượng tế bào thoát ra UI/mg) chỉ đạt 50% so với hoạt độ ở mẻ ban
ngoài sẽ càng nhiều do nồng độ alginate càng đầu (25,331 UI/g). Tuy nhiên khi so sánh hàm
thấp thì sẽ làm cấu trúc của alginate càng lỏng lượng protein qua từng mẻ nhận thấy hàm
lẻo và cấu trúc lỗ xốp càng lớn. lượng protein giảm ít và ổn định qua từng mẻ
Hình 4.
Sở dĩ hoạt tính, hàm lượng và hoạt độ
riêng đều giảm dần qua các mẻ có thể là do
chủng B. subtilis qua mỗi mẻ sẽ yếu dần làm

112

giảm khả năng phân giải các chất dinh dưỡng
và sinh tổng hợp enzym protease nên kết quả
giảm dần.
Như vậy, khi sử dụng tế bào vi sinh vật
đã được cố định bằng hạt gel Aginate qua 4
lần nuôi cấy mẻ thì hoạt độ riêng của enzyme
giảm còn 50% so với lần đầu tiên, đây chính là
hướng ứng dụng mang lại ưu điểm vượt trội so
của enzyme do tế bào cố định tao thành so với
enzyme tự do.
Hình 4. Sự biến thiên hàm lượng, hoạt
độ riêng của enzyme protease ở các mẻ khi
nuôi tế bào cố định.
Khảo sát điều kiện tinh sạch enzyme
protease
Enzyme protease thu nhận được tinh
sạch thành enzyme bán tinh khiết bằng dung
môi hữu cơ (cồn 96o và acetone) ở các tỷ lệ
khác nhau. Kết quả thu nhận được thể hiện ở
Hình 5 cho thấy hoạt độ riêng của các enzyme
bán tinh khiết ở từng phương pháp tinh sạch
đều cao hơn so với hoạt độ riêng của enzyme
protease thô ban đầu.
Kết quả cho thấy acetone có khả năng
tinh sạch enzyme protease tốt hơn so với cồn
tuyệt đối ở các tỷ lệ thay đổi từ 1:1 đến 1:4,
khi tinh sạch bằng acetone ở tỷ lệ 1:2 thì thu
được enzyme bán tinh khiết có hoạt độ cao
nhất (196.042 UI/mg) tăng 52% so với enzyme
thô. Trong khi đó, khi tinh sạch bằng cồn tuyệt
đối, hoạt độ enzyme bán tinh khiết cao nhất
thu nhận được ở tỷ lệ 1:3 (136.498 UI/mg tăng
Tạp chí Đại học Công nghiệp
30% so với enzyme thô). Nguyên nhân của kết
quả trên có thể là do acetone có khả năng
tương tác với nước bằng phản ứng dehydrat
hóa, làm giảm lượng nước liên kết với các
phân tử protein. Trong khi đó ethanol là dung
môi có khả năng dehydrat hóa protein mạnh
hơn acetone. Điều này làm cho nó dễ dàng gây
biến tính protein, kể cả những protein không
phải là protease. Việc làm biến tính protease
và những protein tạp khác không phải là
protease dẫn đến hàm lượng protein cao nhưng
hoạt tính lại thấp, kết quả là hoạt độ riêng và
hiệu suất thu hồi hoạt tính cũng thấp (Hình 5).
Hình 5. Hoạt độ riêng của enzyme
protease ở các điều kiện tinh sạch khác nhau.
Khảo sát điều kiện hoạt động của
enzyme protease
Từ kết quả và đồ thị cho thấy protease
của B.subtilis hoạt động mạnh nhất ở 40oC.
Vượt quá nhiệt độ này, hoạt tính enzyme sẽ
giảm dần từ 50oC đến 70oC, đặc biệt là ở
khoảng từ nhiệt độ 60oC đến 70oC, hoạt tính
giảm mạnh. Nguyên nhân có thể là do ở nhiệt
độ 40oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích của
enzyme protease, nó giúp thúc đẩy enzyme
hoạt động, làm tăng tốc độ phản ứng của
enzyme - cơ chất, vì vậy tại nhiệt độ này
protease cho hoạt tính cao nhất. Từ nhiệt độ
40oC trở lên, hoạt tính protease giảm dần là do
khi vượt quá khoảng nhiệt độ tối thích (40oC),
enzyme sẽ dần bị biến tính và mất hoạt tính
phân giải. Đồng thời, khi nhiệt độ càng tăng
113
Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate
cao thì sự biến tính enzyme sẽ càng tăng làm
cho hoạt tính enzyme protease càng giảm thấp
và không có khả năng phục hồi hoạt tính. Do
đó, hoạt tính protease giảm dần từ 40oC xuống
70oC. Ở nhiệt độ 30oC, protease cho hoạt tính
thấp là do nhiệt độ này chưa đạt đến khoảng
nhiệt độ tối thích để thúc đẩy sự hoạt động của
enzyme, enzyme còn bị ức chế một phần nên
hoạt tính của protease tại nhiệt độ này còn
thấp.
Từ kết quả và biểu đồ cho thấy pH 7 là
pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme
protease ở chủng B.subtilis cố định. Còn ở các
mốc pH còn lại thì tại pH 6 cho hoạt tính
enzyme thấp nhất, tại pH 8 và pH 9 thì hoạt
tính enzyme giảm dần, nhưng vẫn cao hơn so
với pH 6.
114
Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
lên hoạt độ riêng của enzyme protease.
Kết quả trên có thể giải thích như sau:
pH 7 cho hoạt tính protease cao nhất là do đây
là khoảng pH phù hợp, giúp tăng khả năng
hoạt động của các nhóm chức ở trung tâm hoạt
động của protease. Ở pH 6 protease có hoạt
tính thấp có thể do đây là điểm pH gần điểm
đẳng điện của protease vì phần lớn enzyme -
protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid nên
enzyme có xu hướng bị kết tủa và biến tính do
pH đẳng điện làm giảm khả năng hòa tan của
enzyme, điều này làm cho hoạt tính protease
tại pH 6 rất thấp. Ở khoảng pH từ 8 – 9,
protease cũng cho hoạt tính giảm dần. Điều
này có giải thích là do tại pH kiềm độ phân ly
của các nhóm chức hoạt động của protease bị
hạn chế và phần nào ảnh hưởng đến hoạt tính
phân giải cơ chất của protease.
IV. KẾT LUẬN
Đề tài đã cho thấy khả sử dụng tế bào vi
khuẩn B. subtilis cố định để thu nhận enzyme
protease ở nồng độ algiante thích hợp là 2%.
Trong thời gian nuôi cấy 24 giờ, các tế bào B.
subtilis cố định cho protease có hoạt độ riêng
cao nhất là 24 giờ, còn ở B. subtilis tự do là 48
giờ. Sau 4 lần tái sử dụng, hoạt độ enzyme do
tế bào B. subtilis cố định giảm 50% so với ban
đầu, điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc
sử dụng tế bào vi sinh vật cố định trong thực
tế. Đồng thời enzyme protease của chủng cố
định có hoạt độ riêng cao hơn so với chủng tự
do, từ đó có thể thấy enzyme protease từ
chủng cố định tinh sạch hơn so với chủng tự
do. Tác nhân kết tủa tốt nhất để thu protease là
acetone ở tỉ lệ thể tích dịch chiết enzyme: thể
tích acetone là 1:2. Nhiệt độ thích hợp để
protease cho hoạt tính cao nhất là 40oC và pH
thích hợp là pH 7.