Professional Documents
Culture Documents
2
- Đông lạnh: làm lạnh ống chứa môi trường chwuas vi sinh vật ở -80 ℃ với
chất bảo quản chống đông thích hợp (glycerine, sữa,…). Thời gian giữ lâu
khoảng 6 tháng – 10 năm.
- Đông khô: thêm chất bảo quản (sữa gầy, đường) vào môi trường chứa vi sinh
vật rồi đem đông lạnh và thăng hóa nước ở nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông
đặc của mẫu). Thời gian bảo quản lâu, khả năng phục hồi cao mà ít ảnh
hưởng đến hoạt tính.
Phân lập trên môi trường tinh bột Phân lập trên môi trường tinh
Cấp pha loãng: 5 bột tráng dung dịch lugol
Cấp pha loãng: 5
3
Phân lập trên môi trường gelatin Phân lập trên môi trường gelatin
Cấp pha loãng: 4 tráng TCA 50%
Cấp pha loãng: 4
b. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Bảng 1. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Chủng Mô tả khuẩn lạc Amylase Protease
1 Mặt lồi, mép răng cưa, màu Đường kính vòng
trắng đục. sáng: 4 mm
Đường kính 3 mm
Mọc trên môi trường tinh bột
2 Mặt lồi, mép răng cưa, màu Đường kính vòng
trắng đục. sáng: 6 mm
Đường kính 5 mm
Mọc trên môi trường gelatin
3 Mặt phẳng, mép tròn, màu Đường kính vòng
trắng đục. sáng: 4 mm
Đường kính 4 mm
Mọc trên môi trường gelatin
1.2.2. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
4
E. coli S. aureus
Bảng 2. Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Chủng E. coli S. aureus
Bacillus 1 20 mm 42 mm
Bacillus 2 19mm 40 mm
Bacillus 3 17 mm 38 mm
Bacillus 4 - 32 mm
5
→ Kết luận: Trong 4 chủng Bacillus
Cả 4 chủng Bacillus đều sinh kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của E.
coli.
Chủng Bacillus 1, 2, 3 sinh kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của S.
aureus.
6
Bài 2. Tinh chế enzyme amylase bằng alginat
Vẽ đường chuẩn
7
b. Hoạt tính enzyme
Bảng 3. Hoạt tính enzym thô và tinh chế
Mẫu OD560 OD560 thử Độ pha loãng Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng
chứng enzym (U) (U/protein)
Enzym thô 0,8296 0,1984 100 783,99 11,01
Enzym tinh chế 0,8630 0,0709 10 364,66 12,09
8
Do sau quá trình tinh chế, ta đã loại đi một lượng enzyme nên hoạt tính tổng của
enzyme tinh chế sẽ giảm đi so với hoạt tính tổng của enzyme thô.
- Về hoạt tính riêng của enzyme:
Hoạt tính riêng của enzyme thô: 11,01 (U/protein)
Hoạt tính riêng của enzyme tinh chế: 12,09 (U/protein)
Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh chế cao hơn so với enzyme thô ban đầu nhưng
mức tinh chế này khá thấp.
9
Bài 3: Cố định CGTase lên alginat
10
Hình 3.1. Đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thu và nồng độ protein
(mg/ml) theo phương pháp Bradford.
b. Hàm lượng protein
Bảng 3. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế
Mẫu OD595 Thể tích Hệ số pha Hàm lượng
(ml) loãng protein (mg)
Enzym ban đầu 0,7401 Vban đầu = 1 20 4,0820
0,7689
=> 595 = 0,7545
11
Vẽ dường chuẩn CD.
Hình 3.2. Đường biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thu vào nồng độ CD
12
𝐻% = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 13,19%
- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp bắt giữ:
- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp hấp phụ:
c. Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym.
- Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao hơn phương pháp
hấp phụ (72,40% so với 13,19% ,gấp 5,49 lần)
- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng thấp
hơn phương pháp hấp phụ (67,84% so với 112,99% ,gấp 1,67 lần)
2.2.5. Bàn luận
- Hiệu suất cố định protein ở phương pháp bắt giữ đạt khá cao (72,40%), do đây là
phương pháp cố định enzym không thuận nghịch, vì vậy enzym không thể thoát khỏi
chất mang là gel alginat sau khi đã cố định.
- Hiệu suất cố định protein ở phương pháp hấp phụ đạt khá thấp (13,19%). Do pử
phương pháp này, enzyme và chất mang chỉ dựa trên các tương tác bề mặt của gel và
enzym như liên kết hydro, lực Van der Waals, cầu nối ion, tương tác kỵ nước nên
enzym có thể quay trở lại môi trường, sự cố định là thuận nghịch, do đó hiệu suất cố
định chỉ đạt 13,19%.
- Đối với phương pháp cố định bắt giữ, tuy không thay đổi cấu trúc enzym nhưng sự
giảm sút hoạt tính được giải thích do sự cản trở về mặt không gian nên các enzym
được cố định bằng phương pháp bắt giữ khó tiếp xúc với cơ chất, chỉ những enzym
nằm ở bề mặt hạt gel mới dễ dàng gặp cơ chất. Đối với phương pháp hấp phụ, enzym
nằm ở bề mặt hạt gel, nên tỷ lệ hoạt tính riêng của enzym có thể đạt cao.
- Đối với phương pháp cố định theo phương pháp hấp phụ, hoạt tính riêng của enzym
sau cố định cao hơn so với enzym ban đầu. Nguyên nhân là do lượng enzym cố định
được quá thấp mà lượng cơ chất trong môi trường cao nên enzym tiếp xúc nhiều hơn
với cơ chất, khả năng thể hiện hoạt tính cao hơn so với enzym ban đầu.
13
Bài 4: Tinh chế Lysozym bằng sắc ký trao đổi ion
14
Ta có phương trình đường chuẩn BSA:
y = -0.7188x2 + 1.548x + 0.0109
R² = 0.9966
Thông số mẫu:
ODđệm chạy = 0,4597
ODđệm thôi = 0,4254
Bảng 1. Hàm lượng protein trong các phân đoạn
Mẫu A (n=100) B (n=50) B1 (n=10) C*
OD595 0,9121 0,8852 1,0140 0,6484
OD 0,4524 0,4255 0,5543 0,1887
Thể tích 1 1 2,5 1,5
Lượng 33,84 15,68 11,04 0,18
Mẫu
Mẫu D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 gộp
D**
OD595 0,7854 0,8601 0,8052 0,7485 0,6195 0,5271 0,4950 0,4808 0,4734 0,4532
OD 0,36 0,4347 0,3798 0,3231 0,1941 0,1017 0,0696 0,0554 0,048 0,0278
Thể
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 5
tích
Lượng 0,1280 0,1610 0,1365 0,1126 0,0629 0,0302 0,0193 0,0146 0,0121 0,0055 0,6827
15
1.1.1. Bàn luận
Thực tế lượng lysozym trong lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ rất thấp (dưới 5%).
Nguyên nhân dẫn đến hiệu suất tinh chế chưa đạt:
Rửa cột nhiều lần với đệm chạy, mỗi lần rửa ion H+ trong đệm chạy cạnh tranh
với lysozym để gắn trên nhựa trao đổi cation, làm một phần lysozym bị đẩy ra
ngoài.
Thao tác tinh chế chưa cẩn thận: không lấy hoàn toàn dịch từ cột (cụ thể khi rửa
cột với đệm chạy, không lấy được hết đệm chạy ra ngoài, khi nạp mẫu và lấy
dịch ra bị lẫn với đệm), thao tác cho mẫu hay đệm vào cột không nhẹ nhàng
làm tung nhựa trao đổi sepharose lên.
Thao tác bơm hút dịch vào eppendoff chưa chính xác làm ảnh hưởng đến kết
quả đo OD.
Khi pha loãng hay hút mẫu để đo, lắc dịch không đều dẫn đến sai số trong quá
trình đo.
Chưa hoạt hóa tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc ký.
Chất lượng cột sắc ký không tốt.
Giai đoạn để yên 10 phút nhằm đảm bảo gắn kết giữa lysozym và nhựa sắc ký
có thể chưa đảm bảo đủ thời gian.
Cột sắc ký không đủ dài nên thời gian lưu chưa đủ, dẫn đến pha tĩnh của cột
không đủ để bắt giữ hết lysozym.
1.3 . Sơ đồ quá trình tinh chế:
Để yên 10 phút
Dịch B
(protein tạp) Đệm chạy
Dịch C
(protein tạp) Đệm thôi
Dịch D
(Lysozym)
Cân bằng, bảo quản cột
16
17
18