Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

CHNG IV. CNG NGH NUI CY T BO TRN DUNG HP T BO Lai t bo sinh dng l k thut to ra ging mi bng dung hp t bo trn (protoplast fusion). Trong k thut lai v tnh, nhn ca hai t bo c th c gi nguyn hoc nhn ca mt trong hai t bo b loi b. C hai trng hp, t bo cht ca hai t bo c hp nht vi nhau, v nh vy, c nhiu c tnh tt do cc gene trong t bo cht iu khin s c chuyn vo con lai. i vi loi cy trng nhn ging v tnh nh khoai ty, dung hp t bo trn v nhn dng v tnh s to ra cc ging khoai c th bi l v cho nng sut cao hn ging khoai ty thng. i vi la, ng, gene iu khin tnh bt dc c nm trong t bo cht, nu c chuyn vo ging m s gip cho cc nh chn ging to ra c ging bt dc c trong chng trnh chn to ging lai. Nh vy, k thut lai v tnh s rt ngn c thi gian to dng m rt nhiu so vi phng php lai li (backcross). 1. Khi nim t bo trn T bo trn l t bo c tch b thnh t bo. Lc ny, nguyn sinh cht v cc bo quan ch c bao bc bi mng nguyn sinh cht. T bo trn thc vt c gi l protoplast. T bo trn c hai c im quan trng: C kh nng tip nhn mt on hoc ton b DNA l. c tnh ny ch c t bo vi khun, cc t bo nguyn thy trong m thc vt khng c c tnh ny. Khi c a vo mi trng c y cht dinh dng thch hp, t bo trn c kh nng ti sinh vch t bo. y l c tnh ht sc c bit ca t bo trn. Nh , t bo trn mi phc hi c ton b chc nng ca mt t bo nguyn thy. Khi t bo trn ti to c vch v tr li thnh t bo nguyn thy, chng s li c kh nng pht trin v phn chia hon ton ging nh nhng t bo bnh thng. Khi to ra c t bo trn, cc nh khoa hc cho thy kh nng v cng ln ca n trong nghin cu cng nh trong sn xut: S dng t bo trn nh mt i tng sinh hc trong cng tc lai ging. Khi s dng cc t bo trn cng loi lai ging, vt cht di truyn ca cc c th trong cng mt loi c th trao i cho nhau. Kt qu l thu nhn c nhng tnh trng mi trong mi loi. Ngoi ra, cc nh khoa hc cn da vo kh nng
46

Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

tip nhn khng chn lc cc vt cht di truyn ca t bo trn tin hnh lai khc loi v t to ra c tnh a dng sinh hc. S dng t bo trn nh c th nhn cc vt liu di truyn t cc gii sinh vt khc. y l bc t ph rt quan trng trong Cng ngh sinh hc. Nh , cc nh khoa hc c kh nng to ra nhng ging mi khng ch c c tnh ca mt loi, khc loi m cn khc c gii sinh vt. Vic ti sinh t bo trn thnh cy hon chnh c ng dng nhiu trong nghin cu v trong sn xut. S dng t bo trn sn xut cc hp cht th cp ging nh phng php nui cy t bo n. 2. Cng ngh nui cy t bo trn 2.1. Chn mu v kh trng mu T bo trn thng c to ra t l thc vt. Vic chn mu l ph thuc rt nhiu vo mc ch nghin cu. Mu l c kh trng tng t nh i vi nhng mu thc vt dng trong nui cy m. Sau khi kh trng, mu c ngm trong dung dch manitol 13% trong 1 gi loi nc ra khi t bo cht. Mc ch ca vic ny l to ra hin tng co nguyn sinh mng t bo tch khi vch t bo, gip cho qu trnh x l vch c thun li hn. Sau khi ngm trong dung dch manitol, tin hnh tch mt di ca l lm tng din tch tip xc ca enzyme vi vch t bo. 2.2. X l enzyme to t bo trn Trong k thut to t bo trn, khng th s dng cc phng php c hc hoc ha hc ph v vch t bo v cn phi bo m hot tnh sinh hc ca t bo. Cc ch phm c cha enzyme cellulase thng c s dng to t bo trn. Enzyme cellulase s tham gia phn ct cellulose c rt nhiu thnh t bo m khng nh hng n mng t bo v cc thnh phn khc c trong t bo thc vt. Ngoi cellulase, cc ch phm enzyme cn cha nhiu loi enzyme khc nh hemicellulase, pectinase, lignase. 2.3. Tch t bo trn 2.3.1. Tch t bo trn t l T bo trn c tch t l qua 4 bc: kh trng l, lt v lp biu b, x l enzyme trong iu kin p sut thm thu thch hp v c lp t bo trn bng cch lc v ly tm. Mu l c ly t cy non c ra sch bng nc my. Kh trng s b bng cn 70 trong thi gian 1 5 pht, sau ra li bng nc ct v trng. L non thng c kh trng bng calcium hypochlorite hay sodium
47

Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

hypochlorite, thi gian kh trng ph thuc vo mu nui cy. Mu sau khi v trng s c a vo tch t bo trn. Sau , tch lp biu b di mt l enzyme c th ngm su vo nhu m tht l. L c ct ra thnh tng mnh nh v ngm vo dung dch enzyme. trnh tnh trng mng t bo b rch cn ngm mu l trong dung dch manitol, sorbitol, glucose, sucrose 8 20% hoc trong dung dch mui v c 0,3 0,5 M trong thi gian 45 60 pht t bo co nguyn sinh gip n nh mng t bo. Dung dch enzyme c v trng bng cch lc qua mng lc v trng c kch thc 45 m. Dung dch enzyme c s dng ring l hay phi hp vi nhau pH v p sut thm thu thch hp. Phng php c lp mt bc Cc mu l c ngm trong dung dch enzyme v trong ti qua m 25C s thu c hn hp t bo trn. Tin hnh loi b cc m v cm t bo khng b enzyme phn hy hon ton bng cch ht hn hp ra bng ng ht c chia . Sau cc t bo trn c lc trn mng lc Phng php c lp hai bc Trong phng php ny, cc mu l sau khi c lt b lp biu b s c ngm trong dung dch pectinase 0,5-2% c p dng thm thu thch hp v pH l 5,8. Cc bc tip theo tng t phng php c lp mt bc nhng dch t bo c ngm trong dung dch enzyme ln th 2 thu nhn hon ton cc t bo nhu m giu. 2.3.2. Tch t bo trn t m so Ngun nguyn liu l tng c lp t bo trn l m so ang trong giai on tng trng tch cc. Phng php c lp t bo trn t m so cng tng t nh i vi l nhng nng enzyme thch hp c bit l cellulase c th thp hn. Cc m so c nui cy lu ngy kh c th tch t bo trn hn l cc m so mi v vch t bo dy hn. V vy nn s dng m so mi tch t bo trn v thi gian gia 2 ln cy chuyn khng nn ko di qu 2 tun trc khi tin hnh c lp. 2.3.3. Tch t bo trn t huyn ph t bo Mt ngun nguyn liu khc c lp t bo trn l huyn ph t bo mi c nui cy v ang trong trng thi tng trng mnh. c lp t bo trn, dch huyn ph t bo c mt t bo cao c cho vo ng ly tm hnh nn v ly tm vi tc 100 vng trong 1-2 pht. Sau loi b phn dch ni v thu nhn phn t bo cn li. Phn t bo ny c cho vo mi trng MS ra v ly tm li. Phn trn mt c loi b v t bo c ngm trong 5 ml hn hp cc enzyme (14% cellulase v 0,5-2% pectinase) ri t trn my lc tc 75 vng/pht v c trong khong thi gian 2-6 gi.

48

Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

2.4. Xc nh mt t bo trn T bo trn c nhum bng phm nhum fluorescein diacetate xc nh s sng st ca t bo trn. Mt t bo c xc nh bng bung m hng cu. 2.5. Qu trnh nui cy v ti sinh t bo trn c trng c bn ca thc vt l tnh ton th, do t mt t bo trn c lp c th ti sinh thnh mt cy nguyn vn trong iu kin nui cy thch hp. Bc u tin trong qu trnh nui cy v ti sinh t bo trn l ti to vch t bo bao quanh pha ngoi mng t bo. Mi trng nui cy t bo trn thng cha 13% manitol (gip duy tr p sut thm thu ca mi trng trnh trng hp t bo b mt nc nh hng n kh nng sng v tng trng ca t bo). Khi vch t bo c ti to th s phn chia t bo c cm ng to ra nhng cm t bo. Nhng cm t bo ny c th c cm ng tip tc to ra nhng m so nh. M so c cy chuyn sang mi trng mi, nu mi trng mi c cha auxin th m so s tng sinh khi, nu mi trng mi khng c auxin v manitol th m so s pht sinh phi v phi ny s pht trin thnh cy hon chnh trn mi trng thch hp. Mi trng nui cy t bo trn Thnh phn mi trng nui cy t bo trn thng tng t nh thnh phn mi trng nui cy m so v huyn ph t bo. iu khc nhau ch yu l s n nh p sut thm thu trong c mi trng c lp v mi trng nui cy t bo trn thay th cho p lc ca thnh t bo ln mng t bo nh trong mt t bo nguyn vn. Nu nh khng c mt p sut thm thu thch hp th mng t bo trn s nhanh chng b co li. Nhiu nghin cu chng minh rng p lc thm thu ln mi trng nui cy t bo trn c lp t l c th b nh hng nghim trng bi cc iu kin mi trng xung quanh. Mt s nghin cu cho thy rng mun gim p lc thm thu trong mi trng nui cy th phi vt liu thc vt trong ti trong mt khong thi gian di trc khi c lp t bo trn. lm gim p lc thm thu ngi ta thng b sung manitol, sorbitol, glucose hoc sucrose vo hn hp enzyme. Cc nghin cu cho thy nng Fe2+, Zn2+, NH4+, trong mi trng nui cy m l qu cao so vi mi trng nui cy t bo trn. Vic tng nng Ca2+ trong mi trng nui cy t bo trn thch hp duy tr tnh nguyn vn ca mng t bo. Vitamin cng cn thit trong mi trng nui cy t bo trn v nng s dng cng tng t nh trong mi trng nui cy m. Thiamine, myoinositol, acid nicotinic v pyridoxine thng c b sung trong mi trng nui cy. Ngun nitrogen hu c thng c cung cp bi casein hydrolysate.
49

Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

Auxin v cytokinin cn thit cm ng s ti to thnh t bo v s phn chia ca t bo. 3. Dung hp t bo trn v s lai v tnh 3.1. Khi nim v dung hp t bo trn Mt trong nhng ng dng thc t quan trng nht ca t bo trn l s lai v tnh, mt qu trnh quan trng mt khi khng c s tng thch trong lai hu tnh v cc phng php lai khc b tht bi. Cc t bo trn c th dung hp vi nhau mt cch t nhin trong sut qu trnh c lp hoc s dung hp ny s xy ra trong mt iu kin c bit no . Trong qu trnh c lp, s dung hp s xy ra gia hai hoc nhiu t bo gn nhau. Qu trnh ny xy ra khi cu lin bo gia cc t bo trn nm cnh nhau gin ra v kt qu l nhn v t bo cht ca hai t bo trn s ha chung vi nhau thnh mt n v. Hin tng ny xy ra vi tn s cao gia cc t bo trn c lp t m so hay huyn ph t bo hn l cc t bo trn c lp t l. Tip theo s dung hp l t bo a nhn ny s ti to thnh t bo v nhn s bt u phn chia ngay cng lc . S dung hp cc t bo trn t cc ngun nguyn liu khc nhau phi c cm ng bi mt vi iu kin c bit v nhng iu kin c bit ny s lm cho cc t bo gn vi nhau m khng lm ph v tnh ton vn ca t bo. Nu nh nhng t bo trn c c lp t cc ngun t bo khc nhau m c x l c c s lai v tnh th t bo lai ny s cha cc vt cht trong nhn c ngun gc khc nhau v qu trnh ny c gi l lai v tnh. Cc t bo trn lai c th c nui cy bng phng php dn mng hoc cc cm t bo lai s c chuyn sang mi trng to m so. Trong iu kin mi trng thch hp th cc t bo trn lai c th ti sinh thnh mt thc vt lai v tnh. 3.2. Phng php cm ng s dung hp t bo trn Nm 1974, Kao v Michayluk pht hin polyethylene glycol (PEG) gy ra s kt dnh v dung hp tt t bo thc vt v xc nh c cc iu kin t tn sut to cc th lai cao. Mt trong nhng vn chnh ca k thut ny l vic phn bit v tch cc th lai. Cc sn phm dung hp c th c phn bit bng mt thng, bng gene nh du, bng cch dung mi trng chn lc, bng cch dng t bo trn t cc loi m khc nhau hoc c nhum bng cc cht pht hunh quang. Nhng nm gn y, nhng phng th nghim hin i dng phng php dung hp bng in tin hnh dung hp t bo trn ca nhiu loi cy. Ngi ta da vo xung in ca mt thit b to xung in tng tn sut dung hp t bo trn khi i qua cc cc ca my xung in. 3.2.1. Phng php x l c hc T bo trn c lp c gom li cho nm gn vi nhau nh mt dng c cm tay cc nh v mt micropipette. Mt phn ca u micropipette c chn
50

Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

li v vy cc t bo trn c gi li v c y i theo dng cht lng. S lng t bo dung hp nh phng php ny rt thp v v vy phng php ny khng thng dng. 3.2.2. X l bng nitrate sodium T bo trn c lp c c trong mt hn hp NaNO3 5,5% trong dung dch sucrose 10%. Dung dch c cha nhng t bo trn ny c gi n nh trong nc 35C trong 5 pht v sau em i ly tm 200 vng trong 5 pht. Sau khi ly tm, nhng phn ni ln trn mt c loi b v cc cm t bo c cho vo nc trong 30 pht. Trong sut qu trnh ny, hu ht cc t bo trn s tin hnh dung hp. Cc cm t bo c gn ra s c a vo trong mi trng nui cy c b sung 0,1% NaNO3. Cc t bo trn c yn trong mt khong thi gian, sau c ra ln th hai vi mi trng nui cy ri em i cy dn mng. 3.2.3. X l bng ion Ca2+ (pH cao) Keller v Melchers nghin cu vai tr ca ion Ca2+ v pH cao trong dung hp t bo trn thuc l. Trong phng php ny, t bo trn c ly tm trong 3 pht vi tc 50 vng/pht trong mi trng cm ng s dung hp gm c 0,5M manitol, 0,05M CaCl2.2H2O pH 10.5. Cc ng ly tm c cha t bo trn c ngm trong nc 37C trong 40-50 pht. Sauk hi x l xong c khong 20-50% t bo trn c dung hp. 3.2.4. X l bng Polyethylene Glycol (PEG) Mt trong nhng phng php thnh cng nht trong cm ng s dung hp cc t bo trn l t t bo trn trong dung dch c cha PEG, dung dch ny lm tng s kt dnh ca t bo trn v cm ng s dung hp t bo trn ca mt s loi thc vt. Ht 1 ml dung dch mi trng c cha t bo trn vi mt thch hp cho vo ng nghim cha mi trng nui cy c 1 ml dung dch PEG 56%. ng nghim c lc trong 5 giy ri sau yn 10 pht. T bo trn sau c ra vi ln loi b PEG ri chuyn li vo trong mi trng nui cy. Ch khi mt t bo trn ph hp th mi c th s dng phng php ny cm ng s dung hp. T bo trn t hai ngun khc nhau c duy tr vi mt tng ng nhau v c cho 4-6 git (mi git c th tch khong
51

Cong nghe sinh hoc thc vat

Chng 5. Cong nghe nuoi cay te bao tran

100 l) vo mt hp petri nh v yn trong 5-10 pht nhit phng. Sau 2-3 git (50 l) PEG c nh bn ra git t bo trn cm ng s dung hp. Nh cc git c cha t bo trn ln tm knh y mu vt t trong mt a petri sau c th d dng chuyn t bo trn trong cc bc tip theo. Cch ny cng ngn khng cho t bo trn dnh vo thnh a petri v ng thi cng d dng cho vic c nh, nhum mu v quan st.

52