ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC
BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH
----------

BÁO CÁO THỰC TẬP

CÔNG NGHỆ
SINH HỌC
Danh sách sinh viên:
1. Phạm Hữu Lộc
2. Trịnh Hồ Hoàng Lộc
3. Lê Minh Lợi

Lớp DCQ2017 – Sáng thứ 3

Nhóm 08 – Tiểu nhóm 01

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2020

 Bài 1. Chọn lọc giống vi sinh vật

1.1. Tóm tắt lý thuyết

1.1.1. Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng
- Trong quá trình chọn lọc giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập
chúng từ các nơi sinh cư tự nhiên theo kiểu săn lùng (từ những nơi thường có vi sinh
vật tự do) hoặc theo kiểu định hướng (lấy mẫu có chủ đích).
- Sau đó, người ta sử dụng môi trường phân lập và nuôi cấy chúng bằng cách kiềm
hãm hoặc giết vi sinh vật phổ biến và kích thích cho các vi sinh vật hiếm phát triển.
Nhờ đó, chúng ta có thể chọn lọc các chủng vi khuẩn có đặc tính mong muốn. Phương
pháp này thực hiện tương đối dễ dàng, nhưng nếu các đặc tính chọn lọc phức tạp thì
cũng gây khó khăn cho quá trình sàng lọc.
1.1.2. Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn

STT Loại đột biến Bản chất các thay đổi Dấu hiệu phát hiện đột biến
Thủy phân tinh bột trong môi
trường nên tinh bột không tạo
1 Amylase ngoại bào Tạo được amylase ngoại bào
màu tím với lugol. Xung quanh
khóm khuẩn có vòng sáng
Thủy phân gelatine trong môi
trường nên gelatine không bị tủa
2 Protease ngoại bào Tạo được protease ngoại bào khi tráng lên môi trường TCA.
Xung quanh khóm khuẩn có
vòng sáng
Có khả năng ức chế sự tăng
trưởng của các vi sinh vật khác
3 Kháng sinh Tạo được kháng sinh
bằng cách tạo vùng ức chế xung
quanh lỗ cấy
Mất tiêm mao hoặc tiêm
4 Không di động Khuẩn lạc mọc dính vào nhau
mao không hoạt động
Mất hoặc thay dổi bề mặt
5 Không tạo nha bào Khuẩn lạc bé, xù xì
màng nhầy
Mất hoặc thay đổi lớp bên Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ, không
6 Khuẩn lạc xù xì
ngoài lipopolysaccharide đều
Thay đổi khả năng thẩm
Mọc trên môi trường có thuốc
thấu, ngăn cản sự xâm nhập
nồng độ mà bình thường có thể
7 Kháng thuốc vào tế bào của các loại
gây ức chế phát triển của vi sinh
thuốc, hoặc phá hủy các
vật
thuốc
Phát triển trên môi trường nuôi
8 Kháng virus Mất điểm tiếp nhân virus cấy khi có mặt virus ở nồng độ
cao
 Thay đổi một protein thiết Phát triển có nhiệt độ thấp có
Nhạy cảm với nhiệt
9 yếu làm tăng sự nhạy cảm thể, không phát triển ở nhiệt độ
độ bình thường
với nhiệt độ bình thường
Mất các enzym có khả năng
10 Mất sắc tố Có màu khác hoặc mất màu
tham gia tổng hợp sắc tố
Không tạo ra sự biến đổi màu
Mất enzym phân giải các
11 Lên men đường trên môi trường đặc trưng với
loại đường
chất chỉ thị màu

1.1.3. Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật

a. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật (thời gian cấy truyền 1 tuần – 1 tháng)
- Cấy truyền trên môi trường và định kì cấy truyền sang môi trường mới.
- Ưu điểm: đơn giản, dễ làm.
- Nhược điểm: tốn công sức, môi trường và thời gian không ổn định.
b. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng
- Giữ giống ở 4 – 5oC và cho lên bề mặt một lớp vaselin, parafin… (giữ chủng nhiều
năm)
- Ưu điểm:
• Đơn giản, hiệu quả cao.
• Môi trường không bị mất nước.
• Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với cấy truyền vi sinh vật.
c. Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt
- Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử.
- Thời gian bảo quản lâu (từ 1 đến nhiều năm).
d. Phương pháp đông lạnh: làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật tới -80oC và
thêm chất chống đông thích hợp (glycerin, sữa,…)
- Phương pháp đơn giản.
- Vi sinh vật giữ được lâu 6 tháng – 10 năm.
e. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp
- Làm khô nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp.
- Làm giảm hoặc làm ngừng quá trình phân chia của vi sinh vật.
- Vi sinh vật không bị biến đổi về các đặc tính di truyền.
- Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm.
 1.2. Kết quả và bàn luận
1.2.1. Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease
a. Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym

Phân lập trên môi trường tinh bột Phân lập trên môi trường tinh bột
Cấp pha loãng: 5 tráng dung dịch Lugol
Cấp pha loãng: 5

Phân lập trên môi trường gelatin Phân lập trên môi trường gelatin
Cấp pha loãng: 4 tráng TCA 50%
Cấp pha loãng: 4

b. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Bảng 1.1. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

Chủng Mô tả khuẩn lạc Amylase Protease

Mặt lồi, rìa răng cưa, màu trắng đục.
Đường kính vòng
1 Đường kính 5mm.
sáng: 7mm
Mọc trên môi trường tinh bột.
Mặt phẳng, rìa tròn, màu trắng.
Đường kính vòng
2 Đường kính 6mm.
sáng: 9mm
Mọc trên môi trường tinh bột.
 Mặt lồi, rìa răng cưa, màu trắng đục
Đường kính vòng
3 Đường kính 6mm.
sáng: 12mm
Mọc trên môi trường gelatin.
Mặt phẳng, rìa lượn sóng, màu trắng.
Đường kính vòng
4 Đường kính 5mm.
sáng: 8mm
Mọc trên môi trường gelatin.

1.2.2. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

E. coli S. aureus

Bảng 1.2. Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Chủng E. coli S. aureus
Bacillus 1 - -
Bacillus 2 14 mm -
Bacillus 3 26 mm -
Bacillus 4 - -

1.2.3. Bàn luận

a. Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease ngoại bào
- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và
ủ ở 37oC trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào.
• Amylase ngoại bào thủy phân tinh bột của môi trường, nên xung quanh khóm
vi khuẩn tiết amylase sẽ có vòng sáng, không bắt màu tím với dung dịch Lugol (Iod).
- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và
ủ ở 37oC trong 24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào.
• Protease ngoại bào thủy phân gelatin của môi trường, nên xung quanh khóm
vi khuẩn tiết protease sẽ có vòng sáng, không bị đục màu với dung dịch TCA 50%.
 • Do lượng gelatin trong thạch có nồng độ quá thấp nên đĩa thạch không đục
rõ với TCA 50%, phải soi dưới đèn huỳnh quang mới thấy được vòng sáng mờ.
b. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
- Trong thí nghiệm phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự
tăng trưởng của nó với vi sinh vật khác
• S. aureus trong 5 lỗ gồm B1 – B4 và lỗ chứng đều không xuất hiện vòng ức
chế xung quanh lỗ.
• E. coli trong 5 lỗ gồm B1 – B4 và lỗ chứng có 2 lỗ B2, B3 xuất hiện vòng ức
chế xung quanh lỗ.
- Kết luận: Trong các chủng Bacillus:
• Chủng Bacillus 2, 3 sinh ra kháng sinh có hoạt tính tác động đến E. coli.
• Không có chủng nào sinh kháng sinh có hoạt tính tác động đến S. aureus.
 Bài 2. Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic

2.1. Tóm tắt lý thuyết

2.1.1. Khái niệm probiotic
- Probiotic là các vi sinh vật sống khi được cung cấp với số lượng vừa đủ sẽ có lợi
cho sức khỏe của vật chủ (FAO/WHO 2001).
- Các chủng vi sinh vật được dùng chủ yếu trong các chế phẩm probiotic là
Lactobacillus và Bifidobacteria, ngoài ra còn các nấm men và Bacilli.
2.1.2. Vai trò của probiotic
- Tăng cường hấp thu khoáng chất, vitamin
- Hạ cholesterol, huyết áp
- Tăng đáp ứng miễn dịch, giảm phản ứng viêm
- Phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh
- Ngăn chặn vi sinh vật có hại khi bị stress
- Có khả năng chống các yếu tố gây ung thư…
2.1.3. Các yêu cầu của vi khuẩn probiotic
a. Yêu cầu chung
- Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với yêu cầu công nghệ để có thể
đưa vào sản xuất.
- Có khả năng sống sót và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm.
- Không gây các mùi khó chịu cho sản phẩm.
- Có khả năng sống sót khi đi qua đường tiêu hóa nếu được sử dụng qua đường này
và đi đến được nơi tác động của chúng.
- Có khả năng thực hiện được chức năng định hướng.
b. Yêu cầu an toàn
- Được định danh chính xác.
- Phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh, không có khả năng lây bệnh.
- Không gây khử liên hợp muối mật.
- Không mang gen đề kháng kháng sinh có thể di truyền được.
c. Yêu cầu chức năng
- Có khả năng dụng nạp với acid dịch vị của người.
- Có khả năng dung nạp với muối mật.
- Có khả năng bám dính, tồn tại lâu dài, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong
đường tiêu hóa.
- Có khả năng sản xuất kháng sinh vi sinh vật có hoạt tính chống lại các tác nhân sinh
vật gây bệnh khác.
d. Yêu cầu công nghệ
- Có đặc tính tốt về cảm quan.
- Đề kháng với thực khuẩn.
- Dễ sản xuất, tăng trưởng đủ mạnh, dễ thu hoạch.
- Có khả năng sống sót, ổn định trong quá trình sản xuất và bảo quản.
- Có thể đánh giá chất lượng khi trộn vào sản phẩm cuối cùng.

2.2. Kết quả và bàn luận

2.2.1. Đánh giá đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
a. Hình ảnh của thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị nhân tạo
- Mẫu chứng

TBSD pha loãng cấp 2 Bào tử pha loãng cấp 2

TBSD pha loãng cấp 3 Bào tử pha loãng cấp 3

- pH = 2

TBSD pha loãng cấp 1 TBSD pha loãng cấp 2

sau 60 phút sau 60 phút

Bào tử pha loãng cấp 2 Bào tử pha loãng cấp 3

sau 60 phút sau 60 phút

TBSD pha loãng cấp 1 TBSD pha loãng cấp 2

sau 90 phút sau 90 phút

Bào tử pha loãng cấp 2 Bào tử pha loãng cấp 3

sau 90 phút sau 90 phút
- pH = 3

TBSD pha loãng cấp 1 TBSD pha loãng cấp 2

sau 60 phút sau 60 phút

Bào tử pha loãng cấp 2 Bào tử pha loãng cấp 3

sau 60 phút sau 60 phút

TBSD pha loãng cấp 1 TBSD pha loãng cấp 2

sau 90 phút sau 90 phút

Bào tử pha loãng cấp 2 Bào tử pha loãng cấp 3

sau 90 phút sau 90 phút
 b. Kết quả khả năng chịu acid dịch vị nhân tạo
Bảng 2.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo

Thời gian pH
(phút) Đối chứng MT pH 2 MT pH 3
TBSD Bào tử TBSD Bào tử TBSD Bào tử
0 23.103 147.103
60 121.102 123.103 15.102 102.103
90 3.102 121.103 1.102 93.103

Bảng 2.2. Kết quả phần trăm tế bào sóng sót ở pH dịch vị khác nhau (%)

Thời gian pH 2 pH 3
(phút) TBSD Bào tử TBSD Bào tử
0
60 52,61 83,67 6,52 69,39
90 1,30 82,31 0,43 63,27

Bảng 2.3. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch mật nhân tạo

Thời gian Nồng độ muối mật (%)

(giờ) Đối chứng 0,3 0,5
TBSD Bào tử TBSD Bào tử TBSD Bào tử
3
0 13.10 230.103
1 20.102 40.103 20.102 21.103
2 4.102 24.103 5.102 42.103

Bảng 2.4. Kết quả phần trăm tế bào sống sót

ở nồng độ muối mật khác nhau (%)

Thời gian 0,3% 0,5%

(giờ) TBSD Bào tử TBSD Bào tử
0
1 15,38 17,39 15,38 9,13
2 3,08 10,43 3,85 18,26
c. So sánh khả năng chịu acid dịch vị và muối mật của dịch mật ở các nồng độ khác
nhau
- Dịch vị:
• Khả năng chịu được trong môi trường dịch vị nhân tạo ở pH 2 tốt hơn trong
môi trường dịch vị nhân tạo có pH 3. Thời gian trong môi trường thí nghiệm càng
lâu, tỷ lệ % sống sót càng giảm.
• Bào tử chịu đựng sống sót tốt hơn TBSD trong điều kiện khắc nghiệt của
dịch vị. Điều này là có thể là do bào tử có khả năng chịu được môi trường dịch vị và
sinh trưởng được nên tốc độ phát triển nhanh hơn so với TBSD.
• Nhìn chung, khả năng chịu đựng dịch vị của Bacillus subtilis là tốt do loại vi
khuẩn này sống được trong ruột non, cần có khả năng chịu được dịch vị dạ dày để
đến được ruột non, có thể chịu đựng tới pH 2 nên được ứng dụng để làm probiotic.
- Dịch mật:
• Khả năng chịu được trong môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối
mật 0,3% tốt hơn trong môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,5%.
Thời gian trong môi trường thí nghiệm càng lâu, tỷ lệ % sống sót càng giảm.
• Bào tử chịu đựng sống sót tốt hơn tế bào sinh dưỡng trong điều kiện khắc
nghiệt của dịch mật. Điều này là hợp lý bởi bào tử là một dạng biến đổi của vi sinh
vật nhằm chống lại những điều kiện bất lợi từ môi trường.
• Nhìn chung, khả năng chịu đựng muối mật của Bacillus subtilis là rất tốt do
loại vi khuẩn này sống được trong ruột non, có khả năng dung nạp muối mật, có thể
chịu đựng nồng độ lên tới 3 – 5% nên được ứng dụng để làm probiotic.
2.2.2. Bàn luận
- Qua thử nghiệm trên ta thấy, bào tử có khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt
(pH dịch vị, dịch mật) tốt hơn là tế bào sinh dưỡng.
- pH càng acid (hoặc nồng độ muối mật càng cao) thì bào tử càng khó sống sót. Sự
sống sót của bào tử cũng giảm theo thời gian bào tử tiếp xúc với môi trường bất lợi.
- Giải thích: Bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu được những điều kiện khắc
nghiệt của môi trường. Vì vậy bào tử mọc nhiều hơn, và giảm ít hơn so với tế bào
sinh dưỡng.
 Bài 3. Tinh chế enzym amylase bằng alginat

3.1. Tóm tắt lý thuyết

3.1.1. Vai trò của enzym amylase
- Amylase là enzyme có trong nước bọt và dịch mật của người, có chức năng phân
hủy tinh bột thành maltose và sau cùng thành glucose.
- Amylase ứng dụng nhiều trong công nghiệp và thực phẩm.
- Trong y dược, amylase được sử dụng để sản xuất glucose làm dung dịch tiêm truyền,
sản xuất tinh bột biến tính làm tá dược.
3.1.2. Sản xuất enzym amylase
- Enzym amylase có thể được chiết từ nhiều nguồn khác nhau: thực vật, động vật, vi
sinh vật…
- Amylase dùng trong y dược phải có độ tinh khiết cao nên cần được tinh chế từ
enzyme thô.
- Nguyên tắc tinh chế amylase là dùng một cơ chất tương tự tinh bột (alginat) để bắt
giữ enzyme từ hỗn hợp thô. Tủa phức hợp amylase-alginat bằng cation Ca2+ rồi ly trích
lại enzyme tinh chế bằng cách hòa tan ngược lại trong glucose. Nhờ ái lực của enzyme
với glucose cao hơn với alginate, ta thu được enzyme tinh chế tan trong dung dịch
glucose.

3.2. Kết quả và bàn luận

3.2.1. Hàm lượng protein
Bảng 3.1. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

Mẫu OD280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg)

Enzym thô 0,3845 Vthô = 10 76,90
Enzym tinh chế 0,6944 Vtinh chế = 22 15,28

3.2.2. Hoạt tính enzym

a. Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560
Bảng 3.2. Thông số đường chuẩn tinh bột

Ống 1 2 3 4 5
U/ml 0,2 0,4 0,6 0,8 1
OD 0,1209 0,2697 0,3999 0,5502 0,6531
 Đồ thị đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
0.3
y = 0.2443x + 0.0121
0.25 R² = 0.996

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

b. Hoạt tính enzym

Bảng 3.3. Hoạt tính enzym thô và tinh chế

OD560 OD560 Độ pha Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng

Mẫu
chứng thử loãng enzym (U) (U/protein)
Enzym thô 0,9726 0,6245 100 524,6 6,82
Enzym tinh chế 0,9154 0,3684 10 180,5 11,81

- Hiệu suất tinh chế (Hiệu suất cố định):

𝐻𝑇𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡𝑖𝑛ℎ 180,5
𝐻𝑆 = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 34,41%
𝐻𝑇𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ℎô 524,6
- Mức tinh chế:
𝐻𝑇𝑅𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡𝑖𝑛ℎ 11,81
= = 1,73
𝐻𝑇𝑅𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ℎô 6,82
c. Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế
- Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất khá thấp: 34,41%
- Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng 1,73 lần
3.2.3. Bàn luận
a. Tổng lượng protein
- Tổng lượng trong mẫu dịch enzym thô = 76,90 (mg)
- Tổng lượng trong mẫu dịch enzym sau tinh chế = 15,28 (mg)
→ Như vậy, quá trình tinh chế đã giúp loại đi một lượng các protein, trong đó
có các protein không phải là enzym amylase. Nhờ đó mẫu dịch enzym amylase sau
tinh chế tinh khiết hơn so với mẫu dịch enzym thô ban đầu.
b. Tổng hoạt tính của enzym
- Tổng hoạt tính của enzym thô = 524,6 (U)
- Tổng hoạt tính của enzym sau tinh chế = 180,5 (U)
→ Như vậy, sau tinh chế thì tổng hoạt tính của dịch enzym bị giảm đi so với
dịch thô.
c. Hoạt tính chuyên biệt của enzym
- Hoạt tính riêng của enzym thô là 6,82 (U/protein)
- Hoạt tính riêng của enzym tinh chế là 11,81 (U/protein)
- Mức tinh chế là 1,73 lần
→ Như vậy, sau tinh chế thì hoạt tính của enzym amylase trong 1 mg protein
tăng so với trước tinh chế.
d. Quy trình tinh chế enzym

10 ml enzym thô + 30 ml sodium alginate 2%

Khuấy đều, ủ trong 1 giờ
+ 20 ml CaCl2 0,7M

Lọc lấy tủa

+ 20 ml glucose 2%
Ở 4oC, trong 12 giờ

Lọc lấy dịch (amylase tinh chế)

→ Kết luận: Vậy quá trình tinh chế đã có hiệu quả.

 Bài 4. Cố định CGTase lên alginat

4.1. Tóm tắt lý thuyết

- Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả
năng chuyển hóa tinh bột và các chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin.
- Cố định giúp tận dụng và tăng cường tính ổn định, hoạt tính của CGTase đắt tiền.
- Phân loại phương pháp cố định:
• Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion…
• Phương pháp liên kết cộng hóa trị
• Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel
• Phương pháp tạo vi nang
- Cố định CGTase lên chất mang là alginat. Xác định hàm lượng protein cố định bằng
thuốc thử Bradford, đo OD 595nm.
- Hoạt tính CGTase cố định được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin do CGTase
tạo ra từ maltodextrin trong điều kiện xác định dựa vào khả năng hấp phụ và làm mất
màu phenolphtalein của cyclodextrin.

4.2. Kết quả và bàn luận

4.2.1. Hàm lượng protein
a. Đường chuẩn BSA
Bảng 4.1. Thông số đường chuẩn BSA

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Nồng độ BSA (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
OD595 nm 0,4970 0,6014 0,7098 0,7599 0,8521 0,9395
∆OD595 nm 0 0,1044 0,2128 0,2629 0,3551 0,4425
0.3
y = 0.2412x + 0.0221
0.25
R² = 0.9659
0.2
∆OD595 nm

0.15
0.1
0.05
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Nồng độ BSA (mg/ml)
 b. Hàm lượng protein
Bảng 4.2. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

Thể tích Hệ số Hàm lượng

Mẫu OD595
(ml) pha loãng protein (mg)
Enzym ban đầu 0,8093 Vban đầu = 1 10 6,92
Enzym không CĐ theo bắt giữ 0,7929 Vgộp = 41 1/17 1,58
Enzym CĐ theo bắt giữ 5,34
Enzym không CĐ theo hấp phụ 0,8065 Vgộp = 40 3/17 4,84
Enzym CĐ theo hấp phụ 2,08

4.2.2. Hoạt tính enzym

a. Đường chuẩn CD
Bảng 4.3. Thông số đường chuẩn CD

Số thứ tự 1 2 3 4 5 6
Nồng độ CD (mg/ml) 0 2 4 6 8 10
∆OD550 0 0,0776 0,1337 0,1856 0,2138 0,2456

0.3
y = 0.2412x + 0.0221
0.25
R² = 0.9659
0.2
∆OD550

0.15
0.1
0.05
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Nồng độ CD (mg/ml)

b. Hoạt tính enzym

Bảng 4.4. Hoạt tính enzym

OD550 OD550 Hệ số Hoạt tính Hoạt tính riêng

Mẫu
chứng thử pha loãng chung (U) (U/mg protein)
Enzym ban đầu 0,6882 0,3982 30 19,57 2,828

Enzym CĐ theo bắt giữ 0,6015 0,3677 10/0,6 8,59 1,609

Enzym CĐ theo hấp phụ 0,6186 0,5282 10/0,6 2,77 1,332

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp bắt giữ:
𝑚𝑝𝑟 𝑐ố đị𝑛ℎ 5,34
𝐻% = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 77,17%
𝑚𝑝𝑟 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 6,92
- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp hấp phụ:
𝑚𝑝𝑟 𝑐ố đị𝑛ℎ 2,08
𝐻% = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 30,06%
𝑚𝑝𝑟 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 6,92
- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp bắt giữ:
𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑐ố đị𝑛ℎ 1,609
𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 56,90%
𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 2,828
- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp hấp phụ:
𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑐ố đị𝑛ℎ 1,332
𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 47,10%
𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 2,828
c. Nhận xét về hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym
- Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao hơn phương pháp
hấp phụ (gấp 2,57 lần)
- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng cao hơn
phương pháp hấp phụ (gấp 1,21 lần)
4.2.3. Bàn luận
a. Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp bắt giữ

1 ml enzym + 10 ml alginate 2%

Nhỏ từng giọt

Cốc chứa 20 ml CaCl2 0,2M

Lọc

Dịch lọc Hạt gel

Rửa 10 ml x 2 lần đệm Tris-HCl

Dịch rửa
 b. Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp hấp phụ

10 ml alginate 2%

Nhỏ từng giọt

Cốc chứa 20 ml CaCl2 0,2M

Lọc bỏ dịch

Hạt gel
+ 20 ml đệm Tris-HCl pH 8
Để yên 45 phút. Lọc
+ 1 ml enzym

Dịch lọc Hạt gel

Rửa 10 ml x 2 lần đệm Tris-HCl

Dịch rửa

c. Trong bài thực tập

- Enzym được cố định bằng phương pháp hấp phụ và bắt giữ.
- Nguyên tắc: Cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme có thể bám
trên bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong (bắt giữ) hạt gel.
- Đệm Tris-HCl pH 8 để tạo môi trường ổn định cho enzyme hoạt động tối ưu. Tránh
dùng đệm phosphate vì gel alginate không bền.
 Bài 5. Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực

5.1. Tóm tắt lý thuyết

- Nguyên tắc sắc ký ái lực: dựa vào sự gắn thuận nghịch của nhóm chức năng trên
protein đích vào pha tĩnh, các protein khác đi ra khỏi cột, protein đích sau đó được thôi
ra khỏi cột bằng một chất cạnh tranh với nó (theo thứ tự chất có ái lực yếu ra trước,
chất có ái lực mạnh ra sau).
- Kỹ thuật này đơn giản và hiệu quả nhất để tinh chế protein, song nhược điểm là đòi
hỏi protein đích phải có một nhóm chức năng nào đó mà không phải lúc nào cũng có
được. Tuy nhiên điều này có thể được khắc phục bằng kỹ thuật tái tổ hợp.
- Bài thực tập thực hiện tinh chế protein có chứa his-tag bằng IMAC (sắc ký ái lực
ion kim loại). Các ion này có ái lực với đoạn peptid có nhiều histidine (polyHistidine),
đặc biệt là 6 – 10 histidine. Chất dùng để thôi protein là imidazole nồng độ > 100mM.
- Trong sắc ký IMAC, vai trò của Imidazol trong từng loại đệm:
• Đệm chạy: Loại protein tạp không gắn với cột
• Đệm rửa: Loại protein tạp gắn không đặc hiệu với cột
• Đệm thôi: Loại protein đích có đoạn peptid chức năng

5.2. Kết quả và bàn luận

5.2.1. Kết quả xác định hàm lượng protein
Áp dụng kết quả đường chuẩn BSA trong bài 5 có 𝑦 = 0,2412𝑥 + 0,0221
Bảng 5.1. Hàm lượng protein trong các phân đoạn

Mẫu A B B1 C D1 D2 D3 D4
A280 0,2555 0,1537 0,3072 0,1202 0,2497 0,2722 0,3408 0,2794
Thể tích 1ml 1ml 2,5ml 2,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Pha loãng 15 10 1 1 1 1 1 1
Lượng 14,515 5,456 2,955 1,017 0,472 0,518 0,661 0,533

Mẫu D5 D6 D7 D8 D9 D10 Mẫu gộp D

A280 0,2489 0,2246 0,1811 0,1212 0,0719 0,0541
Thể tích 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Pha loãng 1 1 1 1 1 1
Lượng 0,470 0,420 0,330 0,205 0,103 0,066 3,778
 - Hiệu suất:
𝑀ẫ𝑢 𝑔ộ𝑝 𝐷 3,778
𝐻𝑆 = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 26,03%
𝑀ẫ𝑢 𝐴 14,515
→ Nhận xét về hiệu suất tinh chế:
- Tổng lượng protein hứng ra trong dung dịch B, C, D so với ban đầu là:
5,456 + 2,955 + 1,017 + 3,778
x 100% = 90,98%
14,515
- Toàn bộ quá trình không thất thoát nhiều.
- Sau quá trình tinh chế, lượng protein đích thu được chiếm khoảng 26,03% lượng
protein ban đầu.
5.2.2. Bàn luận
a. Sơ đồ tinh chế protein bằng sắc ký ái lực

Dịch A (protein đích + tạp)

Dịch B Đệm chạy

(protein tạp không có Histidin)
Đệm rửa
Đệm thôi
Dịch C
(protein tạp có Histidin)

Dịch D
(protein tinh chế)

Cân bằng, bảo quản cột

b. Nguyên nhân hiệu suất tinh chế thấp

- Bản chất của phương pháp tinh chế là dùng ái lực, lực liên kết giữa protein và nhựa
sắc ký là liên kết yếu, nên protein không gắn chắc chắn và dễ bị rửa trôi.
- Giai đoạn để yên 15 phút nhằm đảm bảo gắn kết giữa protein và nhựa sắc ký có thể
chưa đảm bảo đủ thời gian.
- Khi nạp dung dịch A có thể do quá trình chạy cột nhanh nên protein chưa kịp gắn
vào pha tĩnh.
- Lúc bổ sung thêm dung môi khiến các hạt silicagel bị xáo trộn và ảnh hưởng đến số
đĩa lý thuyết.
- Chất lượng cột sắc ký: không đủ số đĩa lý thuyết yêu cầu hay pha tĩnh liên kết chưa
được tốt.
- Cột sắc ký không đủ dài nên thời gian lưu chưa đủ, dẫn đến pha tĩnh của cột không
đủ để bắt giữ hết các protein cần tinh chế.
c. Nguyên nhân sai số trong quá trình thao tác
- Có thể do trộn mẫu không đều dẫn đến sai số trong đo quang.
- Ghi nhận thể tích dung dịch bị sai sót nhỏ (thất thoát dịch trên ống nghiệm hay
eppendoft, đọc thể tích sai – chủ quan của nhóm).
d. Dự đoán sự hiện diện của protein trong các dịch thu được
- Dịch A: protein đích + protein tạp có và không có đuôi His-tag
- Dịch B: protein tạp không có đuôi His-tag
- Dịch C: protein tạp có đuôi His-tag
- Dịch D: protein đích
 Bài 6. Điện di gel Polyacrylamide (PAGE)

6.1. Tóm tắt lý thuyết

- Polyacrylamide là một polymer với các monomer là acrylamide. Khi acrylamide
trùng hợp dưới sự xúc tác của các chất tạo gốc tự do như APS và TMED sẽ tạo ra sợi
polymer dài và kết tủa khỏi dung dịch, tuy nhiên, nếu trong hỗn hợp monomer ban
đầu có mặt của Bisacrylamide thì khi trùng hợp sẽ tạo ra sự phân nhánh của sợi
polymer và do đó tạo thành một hệ gel có cấu trúc lưới 3 chiều có thể sử dụng để
phân tích điện di như gel agarose.
- Hệ PAGE có thể phân tích protein hay ADN và có thể chạy với chế độ biến tính
hoặc chế độ không biến tính. Hệ đệm dùng có thể dùng liên tục hoặc không liên tục.
- Phần thực hành thực hiện là hệ PAGE biến tính (SDS-PAGE) với hệ đệm không
liên tục của Laemmli.
• Ưu điểm:
‣ Chi phí dụng cụ, thuốc thử thấp.
‣ Dễ sử dụng, tiến hành.
‣ Phân tách nhanh chóng và chính xác protein.
• Nhược điểm:
‣ Làm biến tính protein.
‣ Khả năng ứng dụng thấp.

6.2. Kết quả và bàn luận

6.2.1. Kết quả
- Nhận xét về mẫu điện di:
• Nhìn chung mẫu điện di chạy đủ thời gian, có
tách băng rõ ràng.
• Phân đoạn B là mẫu nhiều protein tạp không có
đuôi His-tag. Nhìn trên hình ta có thể thấy nhiều băng
của các loại protein tạp khác nhau.
• Phân đoạn C là mẫu của dịch rửa cuối, do đó
không có sự hiện diện của protein. Tuy nhiên do sai sót
trong thao tác thực hành nên phân đoạn C vẫn chứa các
băng protein.
 • Mẫu D là mẫu chứa protein đích đã tinh chế, chỉ tồn tại băng protein đích.
Tuy nhiên do sai sót trong thao tác thực hành nên phân đoạn D ngoài băng protein
đích còn 1 số ít các băng protein tạp khác.
- Nhận xét về protein đích trong phân đoạn B, C và D:
• Trong phân đoạn B: dường như không có sự hiện diện của protein đích.
• Trong phân đoạn C: có sự hiện diện của protein đích rõ màu, băng tương đối
với kích thước ~ 31kDa.
• Trong phân đoạn D: sự hiện diện của protein đích rõ ràng, băng protein lớn
với kích thước ~31 kDa.
6.2.2. Bàn luận
- Kết quả điện di chưa rõ ràng, đẹp đẽ nên dễ gây sai sót trong vấn đề nhận định kết
quả. Thao tác nạp mẫu còn sai sót khiến mẫu tử giếng này lan sang giếng khác.
- Nguyên nhân có thể là nạp mẫu quá nhanh dẫn đến tràn, kĩ thuật còn kém dẫn đến
lan mẫu sang giếng khác…
- Hàm lượng protein trong mẫu rõ ràng, ăn màu, đặc biệt là băng protein đích ở phân
đoạn D rõ ràng, kích thước băng lớn.